Phương pháp nghiên cứu

3.2.1. Định tính các hợp chất flavonoid trong dịch chiết

- Tác dụng của FeCl3: Tùy theo nhóm flavonoid và tùy theo số lượng vị trí nhóm OH trong phân tử mà cho màu lục, xanh, nâu.

3.2.2. Phương pháp trích ly các hợp chất tự nhiên:

 Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp trích ly dung môi có

hỗ trợ sóng siêu âm để trích ly các hợp chất tự nhiên từ hạt citrus.

 Ngoài ra, chúng tôi còn sử dụng phương pháp trích ly dung môi (Soxhlet) và phương pháp ép cơ học để thu được dầu hạt citrus.

3.2.3. Phương pháp phân tích thành phần phenolic từ hạt Citrus

3.2.3.1. Phương pháp so màu Folin-Ciocalteu

Xác định hàm lượng phenolic tổng bằng phương pháp so màu sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu.

Nguyên tắc

- Hợp chất phenolic bị oxy hóa bởi thuốc thử Folin-Ciocalteu tạo thành hợp chất có màu xanh.

Hóa chất

- Thuốc thử Folin-Ciocalteu - Dung dịch Natri carbonate - Dung dịch chuẩn acid gallic: xây dựng dung dịch chuẩn có nồng độ 5, 10, 15,

20, 40, 60, 80, 100 mg/L.

Cách tiến hành

 Xây dựng đường chuẩn:

52 - Pha các dung dịch chuẩn từ dung dịch gốc 500 ppm của acid gallic (0.05g định mức thành 100 ml) thành các dung dịch lần lượt có nồng độ xác định: 20, 40, 60, 80, 100

ppm tức là lấy từ dung dịch chuẩn gốc lần lượt các thể tích 2, 4, 6, 8, 10 ml định mức đến 50 ml bằng nước cất.

- Natri carbonate rắn được hòa tan thành dung dịch có nồng độ 1M (lấy 26.5g natri carbonate hòa tan và định mức bằng nước cất trong bình 250 ml).

- Folin-Ciocalteu được pha loãng thành dung dịch 10% (1ml định mức thành 10 ml).

- Lấy 1 ml các dung dịch chuẩn tác dụng với 5 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu, thêm 4ml Na2CO3, trộn đều hỗn hợp.

- Sau 1 giờ, xác định độ hấp thu A ở bước sóng 750 nm.

- Dựng đường chuẩn độ hấp thu A theo mg acid gallic/ml (ppm).

 Đo mẫu - Dùng 1 ml mẫu, xác định độ hấp thu A tương tự như trên.

- Từ đồ thị đường chuẩn ta xác định được hàm lượng phenolic tổng có trong mẫu nghiên cứu.

3.2.3.2. Phương pháp sắc kí lỏng cao áp ghép khối phổ (LC-MS)

Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự

chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc từ trường

nhất định. Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion.

Định tính

Sự di chuyển của pha động vào máy khối phổ làm tăng đường nền một cách đáng kể. TIC (total ion chromatography) biểu hiện sự biến đổi theo thời gian của tổng số ion được phát hiện bởi máy khối phổ.

53 Những ion với m/z nhỏ nhưng có cường độ cao sinh ra bởi kĩ thuật ion hóa mềm như phun electron, có thể được bỏ qua. Hệ thống dữ liệu có thể được sử dụng để trừ phổ

của nền từ sắc kí đồ của mẫu. Quá trình này cần thực hiện cẩn thận để đảm bảo những ion có m/z giống nhau xuất hiện trong sắc kí đồ của mẫu và của đường nền không bị mất.

Đường nền xuất hiện khi hai thành phần không hòa tan hoàn toàn vào nhau và góp phần đáng kể từ khối phổ của những chất được rửa giải sớm được tìm thấy trong khối phổ của chất rửa giải sau đó. Với mục đích giải thích những hợp chất có mặt trong mẫu, loại đường nền rất quan trọng.

Định lượng

Định lượng sử dụng kĩ thuật khối phổ không khác so với định lượng của các kĩ thuật khác, liên quan đến việc so sánh cường độ tín hiệu sinh ra bởi chất phân tích trong mẫu và chuẩn của chúng với hàm lượng đã biết.

Để định lượng, người phân tích cần xác định diện tích hoặc chiều cao peak của chất phân tích và một vài nội chuẩn có mặt để suy ra hàm lượng chất phân tích có mặt trong mẫu.

Kết quả sử dụng phổ TIC, thông số của mỗi peak bao gồm: thời gian lưu, chiều cao và diện tích của peak. Với mục đích định lượng, mỗi peak được phụ thuộc bởi 2 thông số: vị trí baseline của chúng, thời gian lưu, thu được bởi hệ thống máy tính. Vị trí

của baseline của chúng có ảnh hưởng đáng kể đến độ chính xác và độ đúng của quá trình định lượng, khi đường baseline không nằm ngang và tín hiệu của mỗi thành phần không được phân giải hoàn toàn.

Thuận lợi của máy khối phổ là khối lượng có thể sử dụng như là đặc điểm khác biệt và có thể định lượng những thành phần chưa biết.

Sử dụng EIC để xác định vị trí của một hợp chất mà không được phân giải sắc kí từ những thành phần của hỗn hợp và không có mặt rõ ràng trong phổ TIC. Với phổ EIC, có thể định lượng tất cả các hợp chất mặc dù với độ chính xác khác nhau.

54

Nhận danh

NMR và MS là 2 phương pháp được sử dụng cho việc nhận danh các hợp chất tự

nhiên. Việc nhận danh các hợp chất cần sử dụng phổ NMR. Tuy nhiên, kĩ thuật này cần vài miligram những hợp chất đã tinh chế và luôn là thử thách để thu được lượng mẫu cao hơn. Gần đây, phương pháp ESI được phát triển và sử dụng trong việc nghiên cứu các hợp chất tự nhiên. Kĩ thuật ion hóa mềm, với sự phân mảnh ít, có thể được sử dụng cho việc phân tích cấu trúc. Sự phân mảnh MS nhiều lần của các flavonoid và limonoid được khảo sát ở các tài liệu, cho phép nhận danh ướm thử các hợp chất chưa biết nếu thiếu chuẩn[52-54].

Kỹ thuật thực nghiệm:

Mẫu được trích ly bằng dung dịch methanol 70%, sau đó dịch chiết đươc lọc qua màng lọc 0.45àm. Mõ̃u cõ̀n phõn tớch sau khi được tách trong hợ̀ thụ́ng sắc ký lỏng, mõ̃u sẽ đi qua một ống dẫn đến đầu dò MS. Tại đây diễn ra quá trình ion hóa trong buồng API với kiểu ESI. Ion sinh ra được tập trung và gia tốc bằng hệ quang học ion để đưa vào bộ

phân tích khối. Tại bộ phân tích khối, tứ cực thứ nhất sẽ chọn ion mẹ có m/z xác định, các phân mảnh của ion này được tạo ra tại buồng va chạm (collision cell) nhờ tương tác với khí trơ và được phân tích nhờ tứ cực thứ ba, tạo ra tín hiệu đặc trưng tại bộ phận phát hiện ion.

3.2.3.3. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết

Phương pháp DPPH

Phân từ DPPH là gốc tự do không bền ở nhiệt độ phòng, nó có thể nhận một điện tử hoặc một gốc hydro để trở thành phân tử bền, có màu tím đậm, đặc trưng bởi độ hấp thu là 515-520 nm. Phương pháp quét gốc DPPH dựa vào phản ứng khử của DPPH khi trộn với chất chống oxi hóa như polyphenol, mất màu tím của chúng và làm giảm độ hấp thu của chúng ở 520 nm. Phần trăm của sự quét gốc tự do DPPH được tính toán dựa vào phương trình sau đây:

55 Phần trăm ức chế DPPH (%)= [(Ao-A1)/Ao]×100

Trong đó A1 và Ao là độ hấp thu ở cuối phản ứng trong dung dịch DPPH với có hoặc khụng cú dịch chiết hạt [44]. Giỏ trị phõ̀n trăm ức chế DPPH tương đương với àmol trolox(BHT)/ml. Để cải thiện kết quả của phương pháp này, thông số khác được thêm và:

giá trị IC50, là lượng cơ chất gây ra ức chế 50% gốc tự do DPPH [45, 46]. Mỗi mẫu được đo ở vài nồng độ và giá trị IC50 (mg/ml) được tính toán dựa vào phần trăm ức chế tương ứng [47]. Cả phần trăm ức chế DPPH và giá trị IC50 tương quan âm với nồng độ cơ chất, mức độ chống oxi hóa càng cao thì phần trăm ức chế DPPH càng cao và giá trị IC50 càng thấp.

56