Quả Citrus
Tách lấy hạt
Ép cơ học
Trích ly hợp chất phenolic
Xác định hàm lượng phenolic tổng
Phân tích thành phần bằng LC-MS Xác định hoạt tính chống oxi hóa bằng phương pháp DPPH
Dầu hạt Citrus Phơi khô
Trích ly dung môi
58 Hình 4.2: Sơ đồ trích ly hợp chất phenolic từ hạt và dầu hạt
4.3.1. Khảo sát quá trình trích ly các hợp chất tự nhiên từ hạt Citrus
Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình
trích ly các hợp chất tự nhiên từ hạt Citrus với hàm mục tiêu là hàm lượng phenolic tổng.
Vì lí do tiết kiệm thời gian nên chúng tôi chỉ tiến hành khảo sát trên nguyên liệu là hạt cam Sành.
- Dung môi trích ly - Tỉ lệ mẫu và thể tích dung môi trích ly - Thời gian siêu âm
Hạt/dầu hạt Citrus
Thêm dung môi trích ly
Siêu âm
Li tâm
Chiết pha phân cực
Xác định hàm lượng phenolic tổng Phân tích các hợp chất bằng LC-MS
59
4.3.1.1. Ảnh hưởng của dung môi trích ly
1 g hạt cam Sành được hòa tan trong 5 ml dung môi. Thông số khảo sát, loại dung môi dùng cho quá trình trích ly hợp chất phenolic: methanol; ethanol; acetronitrile.
Thông số cố định:
- Thể tích dung môi trích ly: 5 ml - Thời gian siêu âm: 5 phút Hàm mục tiêu: Hàm lượng phenolic tổng
4.3.1.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi và nước
1 g hạt cam Sành được hòa tan trong 5 ml các hỗn hợp dung môi. Thể tích dung môi và nước sử dụng: 100%, 90%, 80%, 70%, 60%.
Thông số cố định:
- Loại dung môi sử dụng: giá trị tối ưu ở phần 4.3.1.1.
- Thời gian siêu âm: 5 phút Hàm mục tiêu: Hàm lượng phenolic tổng
4.3.1.3. Ảnh hưởng của khối lượng mẫu và thể tích dung môi sử dụng
1g hạt cam Sành được hòa tan trong thể tích dung môi lần lượt là: 5 ml, 10 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml.
Thông số cố định:
- Loại hỗn hợp dung môi trích ly: giá trị tối ưu ở phần 4.3.1.2.
- Thời gian siêu âm: 5 phút Hàm mục tiêu: Hàm lượng phenolic tổng
4.3.1.4. Ảnh hưởng của thời gian siêu âm
Thời gian siêu âm: từ 5 phút, 10 phút, 20 phút.
Các thông số cố định:
60 - Thể tích hỗn hợp dung môi trích ly: giá trị tối ưu ở phần 4.3.1.3.
- Loại dung môi trích ly: loại dung môi tối ưu ở phần 4.3.1.2.
Hàm mục tiêu: Hàm lượng phenolic tổng
4.3.2. Xác định độ ẩm các loại hạt Citrus
- Cân khoảng m0= 5g các giống hạt đem sấy ở nhiệt độ 102-1050C. Sau khi sấy, cân lại khối lượng m1. Sau đó tính độ ẩm của nguyên liệu bằng công thức:
% Ẩm = 100%
0 1
0
m m m
4.3.3. Xác định hàm lượng phenolic
- Cân 1g dầu hạt hoặc 1g hạt cho vào ống li tâm, sử dụng dung môi sau khi đã khảo sát để trích ly hợp chất phenolic.
- Xác định hàm lượng phenolic tổng của dịch chiết bằng phương pháp so màu Folin-Ciocalteu ở mục 3.2.3.1.
4.3.4. Phân tích thành phần bằng LC-MS
Những hợp chất được tách bởi hệ thống sắc kí lỏng ghép khối phổ đầu dò 3 tứ cực (Agilent 6410 Triple quad LC/MS/MS) bao gồm hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
LC1200, cụ̣t Apollo (C8, 4.6ì150mm, 5àm) và đõ̀u dũ khụ́i phụ̉ ba tứ cực với kiờ̉u ESI.
Pha động bao gồm dung dịch nước với 0.1% acid formic (dung môi A) và acetonitrile (dung môi B), sử dụng chương trình dung môi đẳng dòng với 60% A và 40% B, tốc độ
dũng là 0.4 mL/phỳt. Thờ̉ tớch tiờm mõ̃u 1àL.
4.3.5. Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa bằng phương pháp DPPH
Đối với cao chiết: phương pháp DPPH được thực hiện như sau: cao chiết được pha với dung dịch methanol 70% với các nồng độ khác nhau: 0.5; 1; 2; 3; 5 g cao chiết/ 3mL.
Hỗn hợp được thờm cựng thờ̉ tích dung dịch DPPH trong methanol (100àM). Sau 15 phỳt ở nhiệt độ phòng, đo độ hấp thu của mẫu trắng và mẫu ở 517 nm sử dụng máy quang phổ
UV-Vis. Dung dịch kiểm soát bao gồm methanol và dung dịch DPPH.
61 Đối với dầu hạt: phương pháp DPPH được thực hiện như sau, tùy thuộc vào hoạt tính, mẫu được pha loãng với dung dịch methanol 70% với các nồng độ khác nhau: 100, 200, 400 mg/mL. Hỗn hợp được thêm cùng thể tích dung dịch DPPH trong methanol (100àM). Sau 15 phỳt ở nhiợ̀t đụ̣ phũng, đo đụ̣ hấp thu của mõ̃u trắng và mõ̃u ở 517 nm sử dụng máy quang phổ UV-Vis. Dung dịch kiểm soát bao gồm methanol và dung dịch DPPH.
Tiến hành thí nghiệm 3 lẫn. Làm tương tự với chất chuẩn BHT.
62