Luận văn thạc sĩ Công nghệ hóa học: Nghiên cứu hoạt tính cỏ cú vườn (Cyperus Rotundusl.)

làm đối tượng nghiên cứu với mục tiêu là khảo sát hoạt tính sinh học của các cao chiết từ thân rễ cỏ cú đồng thời xây dựng qui trình chiết tách sao cho cao chiết thu được có hoạt tính m

GIỚI THIỆU

Nước ta có khí hậu và thảm thực vật khá phong phú, đa dạng Theo các số liệu thống kê mới nhất thảm thực vật Việt Nam có trên 12000 loài, trong số đó có trên 3200 loài thực vật là vị thuốc trong y học dân gian [1, 2], đồng thời đƣợc sử dụng nhƣ nguồn nguyên liệu trực tiếp, gián tiếp hoặc cung cấp những chất đầu vào cho các công nghệ bán tổng hợp nhằm tìm kiếm những dƣợc phẩm mới cho việc điều trị các chứng bệnh thông thường cũng như các bệnh nan y Các số liệu gần đây cho thấy rằng, có khoảng 60% dƣợc phẩm đƣợc dùng chữa bệnh hiện nay, đã hoặc đang thử cận lâm sàng đều có nguồn gốc từ thiên nhiên

Từ xa xƣa, trong dân gian vẫn truyền nhau câu: “Nam bất thiểu trần bì, nữ bất ly hương phụ” nghĩa là chữa bệnh cho nam giới không thể thiếu vị trần bì và chữa bệnh cho nữ giới không thể quên hương phụ Hương phụ là một vị thuốc quí từ cỏ cú chuyên trị đau bụng kinh, rối loạn kinh nguyệt, đau bao tử, an thần…Nó là vị thuốc mà Y học cổ truyền đã sử dụng từ thế kỉ 17, đƣợc ghi vào dƣợc điển Đông Y Trung Quốc 1963, 1988, Dược điển Việt Nam Những chế phẩm có thành phần của hương phụ đã được xếp vào danh mục thiết thiết yếu từ năm 1986 và được lưu hành rộng rãi trong cả nước như: Cao hương ngải, Cao ích mẫu, Hoàn điều kinh, Viên ích mẫu…Thêm vào đó trong nông nghiệp, cỏ cú là một loài cây mọc hoang với khả năng sinh trưởng cực mạnh và là đối tượng cần loại bỏ Những điều này chính là một ƣu thế rất lớn trong việc phát triển sử dụng loài cây này

Tuy nhiên, từ xưa cho tới nay việc sử dụng cỏ cú (hương phụ) vẫn theo các phương pháp chế biến của đông y hoặc dân gian, chủ yếu ở dạng cao thô từ nước sắc hoặc cồn nên chƣa tận dụng đƣợc hết các thành phần có hoạt tính trong cỏ cú Tại Việt Nam, cũng chƣa có một nghiên cứu nào đi sâu vào việc làm thế nào để có thể sử dụng một cách tối ưu các thành phần có hoạt tính sinh học của cỏ cú (hương phụ) Vì vậy, với đề tài " Nghiên cứu hoạt tính của cỏ cú vườn (Cyperus rotundus L.)" nhằm góp phần nghiên cứu một cách bài bản và có hệ thống, kế thừa và phát huy vốn y học cổ truyền của dân tộc, đồng thời mở ra những hướng đi mới trong tương lai

TỔNG QUAN

TỔNG QUAN VỀ CỎ CÚ VƯỜN

Tên khoa học: Cyperus rotundus L

Tên gọi: củ gấu vườn, cỏ gấu vườn, cỏ cú vườn, hương phụ vườn

Hình 2 1 Cây cỏ cú (Cyperus rotundus L.)

Cây cỏ sống nhiều năm

Lá: Hình giải dài bằng thân, cứng bóng, gân nổi ở dưới lá, phần dưới của lá ôm lấy thân

Hoa: nở từ đầu mùa hè đến mùa đông, mọc ở ngọn thành cụm, phân nhánh phức tạp, mỗi hoa mọc ở nách một lá bắc gọi lá vảy, các hoa họp lại thành bông nhỏ, các bông nhỏ tập trung thành ngù, bông kép hay chùy không đều nhau, các vảy xếp thành

2 – 3 dãy trên trục Nhụy chẻ ba, bao phấn dính gốc hai ô bầu thương 3 lá noãn, 3 đầu nhụy, quả bế 3 góc, dẹt hay gần bầu dục, chứa 1 hạt

Hình 2 2 Hoa cỏ cú (Cyperus rotundus L.)

Thân rễ: nằm dưới đất, từ đó mọc lên thân khí sinh tiết diện 3 cạnh, cao 10–

60cm Thân rễ hay còn gọi là củ có hình thoi, màu nâu đen hay nâu sẫm, có nhiều nếp nhăn dọc và đốt ngang, mỗi đốt cách nhau khoảng 0.1 – 0.6cm Trên mỗi đốt có lông màu đen, và vết tích rễ con, vết bẻ có sợi và bóng nhoáng, phần vỏ màu hồng nhạt, trụ giữa màu nâu sẫm, có mùi thơm đặc trƣng Bộ phần dùng chủ yếu để chế thành dƣợc liệu là thân rễ

- Đặc điểm vi phẫu thân rễ:

+ Biểu bì: là một lớp tế bào hình trái xoan, to nhỏ không đều

+ Hạ bì: có hai tầng tế bào hình chữ nhật, thành dày, bên trong rải rác có các sợi hạ bì xếp thành đám cách nhau đều đặn

+ Mô mềm vỏ: dày có trên 30 tầng té bào, hình trái xoan hoặc hơi tròn Trong tế bào có nhiều hạt tinh bột, rải rác có nhiều tế bào tiết hình tròn hoặc teo lại, thành hình nhiều cạnh, ngoài ra còn có các bó libe gỗ, mỗi bó gồm có mạch gỗ bao ở ngoài, libe ở giữa

+ Nội bì: tạo bởi những té bào hình vuông nhỏ xếp liên tiếp thành vòng, thành tế bào hơi dày

+ Vỏ trụ: là một lớp tế bào hình chữ nhật, thành mỏng, xếp sát nội bì

4 + Mô mềm ruột: gồm các tế bào tròn, to, màng mỏng, có các tế bào tiết, và các bó libe gỗ sắp xếp nhƣ ở mô mềm vỏ

- Soi bột: Bột có màu nâu, mùi thơm đặc trƣng, vị cay hơi đắng, có tế bào mô cứng hình chữ nhật hay hình nhiều cạnh, màu nâu, vàng nhạt, màng dày có ống trao đổi rõ ràng Sợi dài thành dày, khoang hẹp, tế bào tiết hình tròn, hay bầu dục, trong có chất tiết màu vàng, xung quanh có 5- 8 tế bào kích thước đều đặn xếp tỏa ra rất đặc biệt Hạt tinh bột hỡnh trũn hay bầu dục, rộng 4- 25àm, rốn và võn khụng rừ Tế bào nội bì hình chữ nhật màng dày, có mảng mạch mạng, mạch vạch

Hình 2 3: Rễ, củ cỏ cú 2.1.2 Phân bố, thu hái, chế biến

Cỏ cú mọc hoang ở khắp nơi trên đồng ruộng, ven đường…Đối với nhà nông, đây là một loài cỏ rất khó tiêu diệt, chỉ cần sót lại một mẩu thân rễ nhỏ cũng đủ phát triển Còn thấy mọc ở những nước khác vùng châu Á như Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Indonexia

Thu hoạch cỏ cú hiện nay chỉ mới dựa vào nguồn mọc hoang thiên nhiên, không ai trồng Có thể kết hợp với việc làm cỏ vườn, ruộng để thu hoạch hay có thể tổ chức thu hái riêng Thường hay đào về mùa xuân, nhưng đào về mùa thu củ chắc và tốt hơn Sau khi đào toàn cây, người ta phơi cho khô, vun thành đống để đốt, lá và rễ con cháy hết, còn lại củ lấy riêng rửa sạch, phơi hay sấy khô

Khi dùng có thể dùng sống (nghĩa là củ chế biến nhƣ trên, dùng ngay), sắc hay ngâm rƣợu, tán bột

2.1.3 Một số công trình nghiên cứu về cỏ cú

2.1.3.1 Nghiên cứu về thành phần hóa học a Trên thế giới:

Có nhiều tác giả trên nhiều nước đã xác định trong cây cỏ cú vườn có các nhóm hợp chất sau:

+ Bốn flavonoid nhƣ là quercetin, kaempferol, catechin, và myricetin đã đƣợc xác định khi thử in vitro và in vivo lá và thân rễ cỏ cú [3]

+ Ayad C.AL Daody và các cộng sự tại Iraq đã xác định cỏ cú vườn có flavonoid có hàm lƣợng toàn phần là 1.25% trên sắc kí giấy với hệ dung môi n- buthanol- acid acetic- nước (4:1:5) Có vết Rf 0.46, 0.61, 0.84 tương ứng với Myrictin, Quercetin và Kaempferol [4].

- Các hợp chất phenol và tanin:

+ Theo tài liệu [5] cỏ cú vườn có các chất phenol và tanin, hàm lượng tanin 1.66%

+ Theo các nhà nghiên cứu Nhật Bản và Trung Quốc trong cỏ cú vườn có các chất polyphenol là catechol tanin, leucocyanidin và leucocyanidin glycosid, acid phenolic nhƣ p cumaric, ferulic, vanilic, p hydroxybenzoic và protocatechic [6]

Cỏ cú vườn có alkaloid hàm lượng toàn phần 0.21- 0.24%, sắc ký giấy với hệ dung môi n- buthanol- acid acetic- nước (1:1:1) hiện màu bằng thuốc thử Dragendorff cho 1 vết Rf = 0.78, sắc ký lớp mỏng (SKLM) nhôm oxyt hoạt độ II, dung môi khai triển cloroform- benzen (7:3) hiện màu bằng thuốc thử Dragendorff cho 1 vết Rf = 0.9 Glycosid tim hàm lƣợng toàn phần 0.62- 0.74%, sắc ký giấy trên hệ dung môi n- buthanol- acid acetic- nước (1:1:1) hiện màu bằng dung dịch thuốc thử natri nitroprussiat cho 1 vết Rf =0.85

- + Về hàm lƣợng tinh dầu: Hàm lƣợng tinh dầu trong thân rễ từ 0.3-2.8%

+ Các hằng số lý, hóa học của tinh dầu: Theo tài liệu tinh dầu có chỉ số khúc xạ ờ 27 o C là 1.388, chỉ số xà phòng 137.4, chỉ số acid 26.6, chỉ số iod 29.2

+ Thành phần tinh dầu: Theo Kapadia V H và cộng sự ở Ấn Độ đã xác định trong tinh dầu cỏ cú vườn có 27 cấu tử, trong đó sesquiterpen hydrocarbon chiếm 25%, sesquiterpen peroxyd 12%, sesquiterpen ceton 20%, monoterpen và các alcol béo 25%, các chất chƣa xác định 18%

Bảng 2 1 Thành phần tinh dầu cỏ cú

+ Theo Hikino và cộng sự tại Nhật Bản đã xác định đƣợc cấu trúc của một số chất sau: α-rotunol, β-rotunol, cyperolon và 3epi cyperolon, cyperotundon, cyperen, sugetriol , cyperol, isocyperol và đã bán tổng hợp đƣợc cypenolon từ cyperon

+ Một số tác giả đã dựa vào sự có mặt các chất trong tinh dầu và hàm lƣợng của chúng để phân loại hóa học Theo Komai đã tìm thấy tại Hawaii (Mỹ) loài C rotundus có hàm lƣợng patchoulenyl acetate và sugenyl acetate cao hơn các loài khác, ông cho đây là một loài hóa học mới gọi là loài K

Ngoài các thành phần trên trong cỏ cú vườn còn có chất đắng, hệ số đắng 1:333, tinh bột 9.2% , pectin 8.7%, chất béo 2.98% mg, acid hữu cơ 3.25%, vitamin, C 8.8% mg, các nguyên tố vô cơ Ba 6.10 -3 , Pb 6.10 -3 , Ti 10 -2 , Cr 6.10 -3 , Ni 10 -2 , Cu 3.10 -4 , Al 1%, Fe 10 -2 , Si 10 -1 , Mn 10 -2 Các chất đường trước khi thủy phân 13.22%, sau khi

Isocyperol thủy phân 14.41%, tinh bột hầu hết là hydrat cacbon glucose, sacarose, fructose, protein 4.9% b Trong nước:

Theo Đàm Đảm, thành phần thân rễ cỏ cú chứa: tinh bột 0.18%, clorid 0.42%, chất béo 1.32, không có iod, chất đắng hệ số đắng 250, chất nhựa, flavonoid, glucosid, alcaloid, tinh dầu 1.27% alcaloid trên SKLM với 3 hệ dung môi n- buthanol- acid acetic- nước (4:1:5), methanol-cloroform (1:9), ethyl acetate- methanol-nước (100:17:3) đều cho một vết, flavonoid chạy với n-buthanol-acid acetic-nước (4:1:2) và hệ methanol- cloroform (1:9) tất cả đều cho 2 vết[15, 16]

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU VÀ THỰC NGHIỆM

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Đề tài nghiên cứu tách các cụm hoạt chất, khảo sát hoạt tính sinh học của cỏ cú vườn với định hướng sàng lọc và tìm kiếm nguồn nguyên liệu tự nhiên phong phú, có hoạt tính mạnh, khả năng ứng dụng mạnh trong các lĩnh vực nhƣ: dƣợc phẩm, mỹ phẩm…

Với mục tiêu trên, nội dung nghiên cứu bao gồm các vấn đề sau:

 Kiểm tra thành phần hóa học bằng phương pháp sơ bộ hóa thực vật

 Tách các cụm hoạt chất theo độ phân cực khác nhau

 Đánh giá hoạt tính sinh học của từng cụm hoạt chất:

 Xác định hàm lƣợng phenol tổng

 Đánh giá tính kháng oxy hóa của các cụm hoạt chất bằng phương pháp

 Đánh giá tính kháng vi sinh vật của từng cụm hoạt chất

 Xây dựng qui trình chiết

 Kiểm tra qui trình đã xây dựng

HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ

Bảng 3 1 Danh mục hóa chất sử dụng

Tên hóa chất Nguồn gốc

 Hóa chất sử dụng trong chiết cao

 Hóa chất sử dụng trong xác định hàm lƣợng phenol tổng

- Thuốc thử Folin Merck – Đức

 Hóa chất sử dụng trong xác định IC50 và kháng oxy

 Hóa chất sử dụng trong sơ bộ hóa thực vật

- Mg kim loại Trung Quốc

 Hóa chất sử dụng thử nghiệm vi sinh - Môi trường lỏng MHA Trung Quốc

3.2.2 Dụng cụ và thiết bị

- Máy cô quay chân không Buchi - Máy đo độ ẩm hiệu Sartorius-MA35 - Máy UV hiệu Thermo Scientific Helios Epsilon - Bếp điện từ

- Bể lắc siêu âm - Tủ cấy vô trùng - Tủ ấm

- Tủ sấy - Máy ly tâm

- Nồi hấp áp suất Và một số thiết bị cần thiết khác

- Micro Pipet 1000, 100àl - Ống sinh hàn

- Bình cầu hai cổ - Nhiệt kế

- Becher - Phễu chiết quả lê - Bình cô quay - Phễu lọc - Bình lọc chân không Và một số dụng cụ cần thiết khác.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Mẫu đƣợc xác định ẩm độ bằng máy đo độ ẩm SARTORIUS-MA35, Các thông số cài đặt:

- Thời gian: 0.0 (ở chế độ mặc định, máy sẽ cho kết quả khi khối lƣợng mẫukhông đổi)

Các thí nghiệm đƣợc thực hiện nhiều lần Độ ẩm trung bình đƣợc xác định bằng cách lấy trung bình kết quả của các lần thí nghiệm n w w n i

Với: w: độ ẩm trung bình (%) w i : độ ẩm các lần thí nghiệm (%) n: số lần thí nghiệm

3.3.2 Xác định tro toàn phần

Tro toàn phần là lƣợng hợp chất vô cơ còn lại khi nung cháy hoàn toàn mẫu nguyên liệu, các ion còn lại ở dạng carbonat hay oxit

Một lƣợng mẫu đƣợc cân cho vào chén sứ sạch Mẫu đƣợc đốt cháy chậm trên một bếp điện trong tủ hút cho đến khi không thấy khói Phần còn lại sau khi đốt đươc cho vào tủ nung ở 600oC cho đến khi phân rã thành tro màu trắng Khối lƣợng đƣợc cân lại sau khi làm nguội trong bình hút ẩm (cân đến khi khối lƣợng tro không đổi) Độ tro đã đƣợc tính toán theo công thức sau:

Ash (%) x100 (3.2) Trong đó: m 0 : khối lƣợng mẫu (g) m1: khối lƣợng mẫu sau khi đốt (g)

26 m2: khối lƣợng mẫu sau khi nung ở 600 o C (g) u :Độ ẩm của nguyên liệu (%)

3.3.3 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật [32, 33]

Dựa vào độ hòa tan trong các dung môi khác nhau của các hợp chất trong nguyên liệu mà phân tích, dùng các dung môi có độ phân cực tăng dần: ether, ethanol và nước Sau đó, xác định các nhóm hợp chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng đặc trƣng

3.3.3.2 Phương pháp và thực nghiệm

- Dịch chiết ether: Chiết 25g mẫu bằng diethyl ether trong bể siêu âm cho đến khi dịch ether nhạt màu Gộp dịch chiết, lọc và cô lại còn khoảng 50ml

- Dịch chiết cồn: Bã sau khi chiết bằng ether đƣợc chiết nóng bằng ethanol 96 o trong bể siêu âm đến khi dịch gần không màu Gộp dịch chiết, lọc và cô lại còn khoảng 50ml

- Dịch chiết nước: Bã sau khi chiết bằng ethanol 96 o được chiết nóng bằng ethanol 96 o trong bể siêu âm 5 phút (3 lần) với thể tích nước vừa đến ngập mẫu Gộp dịch chiết, lọc và cô lại còn khoảng 50ml

 Xác định các nhóm hợp chất

 Xác định các nhóm hợp chất trong dịch ether

Acid hữu cơ Chất béo Triterpenoid tự do Tinh dầu

 Xác định các nhóm hợp chất trong dịch cồn

 Xác định các nhóm hợp chất trong dịch nước

Lấy 2ml dịch thử cho vào ống nghiệm Pha loãng với 1ml nước cất, thêm một ít tinh thể Na2CO3 Nếu có bọt khí sủi lên từ các tinh thể Na 2 CO 3 – có acid hữu cơ

Bốc hơi tới cắn 5 ml dịch thử trong chén sứ, hòa cắn với 4 ml HCl 1% Chia đều trong 4 ống nghiệm, nhỏ lần lƣợt vào đó các thuốc thử sau cùng với kết quả nhận định là có alkaloid:

+ Công thức thuốc thử: 1.35g HgCl 2 hòa tan trong 100ml dung dịch KI 5%

+ Dấu hiệu: Tạo kết tủa màu trắng vàng

+ Công thức thuốc thử: Ì 2.5g và 5.0g KI hòa tan trong 10ml nước cất

+ Dấu hiệu nhận biết: cho kết tủa màu nâu hay màu vàng đậm

Dung dịch A: 850mg Bi(NO3)2.5H2O trong 40ml H2O và 10ml acetic băng

Dung dịch B: Hòa tan 8g KI trong 20ml H2O

Trộn hai thể tích bằng nhau của hai dung dịch A và B để làm thuốc thử

+ Dấu hiệu nhận biết: tạo kết tủa có màu từ vàng cam đến đỏ

Alkaloid Tanin Anthraglycosid Polyuronic Đường khử Flavonoid Saponin

Phản ứng Bortrager: Cho 5 ml dịch thử vào một ống nghiệm nhỏ, thêm vào đó NaOH 10 %, lắc kỹ Nếu lớp kiềm có màu từ hồng tới đỏ - Có anthraglycosid

Phản ứng 1: Bốc hơi tới cắn 5 ml dịch ether trong chén sứ, nhỏ vào đó vài giọt thuốc thử Carr-Price (SbCl3 bão hòa trong CHCl3) Dung dịch có màu đỏ - Có carotenoid

Phản ứng 2: Thêm vào cắn vài giọt H2SO4 đậm đặc Dung dịch có màu xanh dương - Có carotenoid

Nhỏ vài giọt dịch ether lên cùng một chỗ trên giấy xác định chất béo, sấy nhẹ cho hết dung môi, hết mùi tinh dầu (nếu có).Chỗ nhỏ để lại vết mờ - Có chất béo

Bốc hơi 5 ml dịch thử đến cắn.Hòa cắn với 3 ml nước cất trên bếp cách thủy Để nguội và lọc qua giấy lọc Thêm vào dịch lọc 0,5 ml dung dịch Fehling A và 0,5 Fehling B Đun cách thủy 5 phút Nếu có tủa đỏ gạch dưới đáy ống nghiệm - Có các hợp chất khử (chủ yếu là đường khử)

Phản ứng Cyanidin: Lấy khoảng 10 ml dịch thử cho vào chén sứ, bốc hơi đến cắn khô

Hòa cắn với 2 ml cồn 250 gạn dịch cồn cho vào một ống nghiệm nhỏ Thêm vào đó một ít bột Mg kim loại và thêm từ từ 0,5 ml HCl đậm đặc Sau phản ứng dung dịch có màu từ hồng tới đỏ - có flavonoid

- Anthocyanosid: Lấy 1 ml dịch thử cho vào một ống nghiệm nhỏ, thêm 3 giọt HCl

10 %, nếu dung dịch có màu từ hồng đỏ tới đỏ và chuyển sang màu xanh khi kiềm hóa bằng dung dịch NaOH 10 % - Có anthocyanosid

- Proanthocyanidin: Lấy 5 ml dịch thử cho vào một ống nghiệm, thêm 2 ml HCl 10

%, đun cách thủy 10 phút Nếu dung dịch có màu hồng tới đỏ - có proanthocyanidin

Nhỏ từng giọt một 2 ml dịch thử vào một ống nghiệm có chứa 10 ml cồn 95o.Nếu có nhiều tủa bông đƣợc tạo thành - có polyuronid

Phản ứng 1: Nhỏ vài giọt dịch thử lên một miếng giấy lọc, sấy nhẹ Nhỏ lên đó hai giọt KOH 10 % trong cồn, tiếp tục sấy nhẹ cho khô Che một nửa vết chấm bằng một miếng kim loại, soi UV365 nm Sau vài phút lấy miếng kim loại ra; nhận xét sự thay đổi cường độ phát quang của nửa mặt bị che: sáng dần lên đến khi sáng tương đương với nửa không bị che – có coumarin

Phản ứng 2: Bốc hơi tới cắn 5 ml dịch thử Hòa cắn với 2 ml cồn 700, chia đều vào hai ống nghiệm nhỏ, thêm vào ống thứ nhất 0,5 ml KOH 10 % và ống thứ hai một lượng nước cất tương đương Đun cách thuỷ cả hai ống nghiệm trong 2 phút, để nguội soi UV365 nm Dung dịch trong ống một có huỳnh quang mạnh hơn dung dịch trong ống thứ hai- có coumarin

Lấy 5 ml dịch thử cho vào chén sứ bốc hơi tới cắn Hòa cắn với 5 ml cồn trên bếp cách thủy.Lọc, cho dịch lọc vào ống nghiệm Thêm 5 ml nước, lắc mạnh theo chiều dọc ống Nếu có bọt bền - có saponin

Bốc hơi tới cắn dịch thử trong chén sứ, hòa cắn với 4 ml nước cất trên bếp cách thủy

Lọc, chia dịch chiết vào hai ống nghiệm: Ống 1: Pha loãng với nước cất theo tỉ lệ 1:2, thêm hai giọt thuốc thử FeCl3 5 %, lắc đều Nếu dung dịch có màu xanh rêu hay xanh đen - có polyphenol Ống 2: Thêm 5 giọt dung dịch gelatin mặn, lắc đều so sánh với ống chứng.Nếu có tủa bông trắng - có tanin

Bốc hơi tới cắn 5 ml dịch ether trong chén sứ; nếu cắn có mùi thơm nhẹ cho vào đó một ít cồn cao độ, bốc hơi tới cắn Cắn có mùi thơm nhẹ đặc trƣng – có tinh dầu

Phản ứng Libermann- Bourchardat: bốc hơi tới cắn 5 ml dịch thử, hòa cắn với

PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

- Thu hái và xử lý nguyên liệu: Theo dân gian và một số nghiên cứu, rễ và củ cỏ cú có dƣợc tính mạnh nên đƣợc chọn làm đối tƣợng nghiên cứu trong luận văn này Cỏ cú sau khi đƣợc thu hái thì loại bỏ các phần thân, lá Còn lại rễ và củ cỏ cú, đem rửa sạch, phơi khô tránh sáng trong 21 ngày, rồi đem nghiền nhỏ thành bột Bảo quản trong lọ kín

- Bột cỏ cú sau đó đƣợc tiến hành đánh giá các tính chất căn bản về màu, mùi, độ ẩm, độ tro

3.4.2 Chiết cao tổng và cao phân đoạn

Bột cỏ cú đƣợc chiết kiệt với dung môi methanol, tỷ lệ thể tích dung mội / khối lƣợng nguyên liệu là 4:1, duy trì nhiệt độ chiết là 65 o C, thời gian chiết là 2h/lần, lặp lại 3 lần Sau mỗi lần, lọc thu dịch chiết, bã nguyên liệu tiếp tục chiết các lần còn lại

Thu gom dịch chiết từ cả 3 lần và loại dung môi bằng cô quay áp suất thấp, thu đƣợc cao tổng Xác định khối lƣợng cao chiết tổng (để tính hiệu suất chiết cao H1ct (Hiệu suất H 1 là hiệu suất chiết cao tính trên nguyên liệu khô, tính theo công thức 3.5))

Trong đó: m 1 (g): Khối lƣợng cao chiết m o (g): Khối lƣợng bột nguyên liệu u(%): Ẩm độ nguyên liệu

Hình 3.5 Hệ thống chiết hoàn lưu bột cỏ cú

Cho nước cất vào cao tổng theo tỷ lệ thể tích nước : tỷ lệ khối lượng cao tổng là 4:1 Khuấy đều trong 20 phút Lần lƣợt cho các dung môi vào theo chiều tăng độ phân cực: n-hexane, ethyl acetate, n-buthanol Đối với mỗi loại dung môi, khuấy trong 90 phút, chia thành 3 lần, với mỗi lần dùng phiễu chiết tách lấy lớp phía trên rồi tiếp tục khuấy với dung môi thêm vào Gom dịch chiết và loại dung môi bằng cô quay áp suất thấp, thu đƣợc các cao phân đoạn lần lƣợt là: cao HEX, cao EA, cao BU,

40 cao H 2 O Xác định khối lƣợng các cao phân đoạn thu đƣợc, tính hiệu suất cao phân đoạn (H1, H2) theo công thức 3.6, 3.7

Hiệu suất cao tính trên 100g nguyên liệu khô: H 1pd (%) (3.6)

Hiệu suất cao tính trên 100g cao tổng: H2(%) (3.7)

Trong đó: m2(g): Khối lƣợng cao phân đoạn m'o(g): khối lƣợng cao tổng

H 1ct (%): Hiệu suất chiết cao tổng

Hình 3 6 Qui trình chiết cao tổng và cao phân đoạn (Điều kiện 1)

Cao n- hexane 1 Buthanol, khuấy 90 phút, chia 3 lần 2 Ethyl acetate, khuấy 90 phút, chia 3 lần

Dịch chiết n-hexane 3 H 2 O, khuấy 20 phút

4 n-hexane, khuấy 90 phút, chia 3 lần

Chiết Bay hơi dung môi

Cao tổng Dịch chiết + Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 4:1 + Thời gian: 6 giờ, chia 3 lần

Phần còn lại n-hexane Dịch chiết

3.4.3 Khảo sát sơ bộ hóa thực vật, tính kháng oxy hóa, hàm lƣợng phenol tổng, tính kháng vi sinh vật của từng cụm hoạt chất

- Sơ bộ hóa thực vật (đã trình bày ở phần 3.3.3)

- Xác định hàm lƣợng phenol tổng ( đã trình bày ở phần 3.3.4)

- Khảo sát khả năng kháng oxy hóa – xác định chỉ số IC 50 theo phương pháp DPPH (đã trình bày ở phần 3.3.5)

- Khảo sát khả năng kháng vi sinh vật theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch và phương pháp pha loãng (đã trình bày ở phần 3.3.6)

Tổng hợp các kết quả khảo sát khảo sát hàm lƣợng phenol tổng, kháng oxy hóa, kháng vi sinh vật, đánh giá cụm cao có hoạt tính sinh học mạnh Kết quả này sẽ đƣợc tiếp tục sử dụng trong xây dựng qui trình chiết

3.4.4 Xây dựng qui trình chiết

Mục đích: Xây dựng qui trình chiết sao cho thu đƣợc cao chiết có hiệu suất cao, hoạt tính sinh học mạnh trên cơ sở tiết kiệm dung môi, nhiệt lƣợng cũng nhƣ thời gian chiết Trong luận án này, qui trình chiết được khảo sát với các ảnh hưởng như sau:

3.4.4.1 Ảnh hưởng của cách thức chiết

Bố trí thí nghiệm đƣợc trình bày ở bảng 3.3

Bảng 3 3 Bố trí thí nghiệm trong ảnh hưởng thời gian chiết

Thời gian chiết trong một lần (giờ/lần) 1 3 1.5 2 3

Tồng thời gian chiết (giờ) 2 6 4.5 6 9

Kết quả lựa chọn cách thức chiết sao cho hiệu suất chiết thu đƣợc cao

3.4.4.2 Ảnh hưởng của kích cỡ nguyên liệu

Kích cỡ nguyên liệu đƣợc khảo sát ở hai dạng nguyên liệu là dạng bột mịn đƣợc nghiền bằng máy nghiền dạng nhỏ (thực hiện tại tiệm xay bột dƣợc liệu, địa chỉ:

1, Đoàn Công Hớn, Phường Trường Thọ, Quận Thủ Đức) và dạng xay thô (bẳng máy xay sinh tố, thực hiện tại trường đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh)

Bảng 3 4 Kích cỡ nguyên liệu sử dụng trong xây dựng qui trình chiết

Cỡ hạt Bột mịn Bột xay thô

3.4.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết

Từ các kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của các cụm cao phân đoạn, lựa chọn qui trình chiết cao phân đoạn dừng lại ở cụm cao có hoạt tính sinh học mạnh nhất

Bột cỏ cú đƣợc chiết kiệt với các nồng độ methanol khác nhau: 0, 20, 40, 60, 80, 100% thu đƣợc cao tổng, sau đó tiến hành chiết cao phân đoạn Đánh giá kết quả thu đƣợc theo hiệu suất thu, hàm lƣợng phenol tổng và khả năng kháng oxy hóa của các cao chiết

 Hiệu suất: Hiệu suất chiết của cao tổng và cao phân đoạn đƣợc tính lần lƣợt theo công thức 3.5, 3.6 và 3.7

 Xác định hàm lƣợng phenol tổng (đã trình bày ở phần 3.3.5)

 Xác định khả năng kháng oxy hóa: phương pháp thực nghiệm giống như xác định IC 50 (đã trình bày ở phần 3.3.6), tuy nhiên chỉ cần thực hiện tại một nồng độ nhất định

 Từ các kết quả khảo sát ảnh hưởng cách thức chiết, kích cỡ nguyên liệu và khảo sát nồng độ dung môi Xây dựng qui trình chiết sao cho cao chiết thu đƣợc có hiệu suất cao và hoạt tính sinh học mạnh

3.4.4.4 Kiểm tra qui trình a Độ lặp lại của qui trình

 Chiết lặp lại 3 lần với qui trình đƣợc xây dựng Đánh giá kết quả hiệu suất chiết của cao tổng và cao phân đoạn thu đƣợc

44 Độ lệch chuẩn S= (3.8) Độ lệch =| ̅| (3.9) Trong đó: là hiệu suất chiết cao lần thứ i ̅ là hiệu suất trung bình

Với các giá trị độ lệch ( ) thu đƣợc, so sánh với giá trị 2S tính theo công thức 3.8 Nếu các giá trị thu đƣợc từ công thức 3.9 đều nhỏ hơn giá trị 2S, cho thấy các giá trị hiệu suất thu được đều có thể tin tưởng được với độ tin cậy 95%[37] b Đánh giá tính chất ngoại quan của cao tổng và cao phân đoạn từ qui trình đƣợc xây dựng với qui trình chiết ban đầu

- So sánh tính chất ngoại quan của cao chiết thu đƣợc từ quy trình xây dựng đƣợc và qui trình ban đầu

- Kiểm tra khả năng kháng vi sinh vật của cao tổng và cao phân đoạn thu từ qui trình đƣợc xây dựng So sánh với kết quả này với qui trình chiết ban đầu.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

CHUẨN BỊ VÀ ĐÁNH GIÁ NGUYÊN LIỆU

Nguyên liệu là thân rễ cỏ cú, đƣợc thu hoạch tại xã Phổ Ninh, huyện Đức Phổ, tỉnh Quảng Ngãi vào tháng 02/2014.Nguyên liệu đƣợc trải đều và phơi tránh sáng trong 21 ngày nhằm đảm bảo cho ẩm độ nguyên liệu thấp, không gây ẩm mốc

Nguyên liệu sau đó đƣợc nghiền nhỏ và bảo quản trong hộp kín, tránh sáng Cho silicagel vào trong hộp để tránh tình trạng hút ẩm ngƣợc trở lại Tính chất cơ bản của bột nguyên liệu đƣợc trình bày ở bảng 4.1

Bảng 4 1 Tính chất cơ bản của nguyên liệu

Hình ảnh nguyên liệu Màu sắc Mùi Độ ẩm (%) Độ tro Trước khi xay Sau khi xay (%)

Bột rễ củ cỏ cú có màu xám tro; mùi cỏ thơm nhẹ đặc trƣng của dƣợc liệu

Xác định độ ẩm là công việc đầu tiên phải làm khi tiến hành xác định chất lƣợng của một dƣợc liệu Hàm lƣợng các hoạt chất nhƣ tinh dầu, chất béo, alkaloid, glycoside… đều đƣợc qui định trên trọng lƣợng khô tuyệt đối của dƣợc liệu Mỗi dƣợc liệu đều có một giới hạn độ ẩm nhất định, nếu quá độ ẩm đó thì dƣợc liệu dễ bị mốc, hƣ hỏng Ẩm độ bột cỏ cú là 10.15%, đáp ứng đƣợc yêu cầu về độ ẩm giới hạn đƣợc qui định trong dƣợc điển Việt Nam IV (độ ẩm giới hạn nhỏ hơn 13%)

Tro là thành phần còn lại của dƣợc liệu sau khi nung cháy hết các chất hữu cơ

Tro thực sự chỉ gồm các loại muối khoáng có trong dƣợc liệu, do đó tro còn đƣợc gọi là tro tổng số muối khoáng Độ tro là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lƣợng cũng nhƣ thể hiện độ tin cậy về độ "sạch" của dƣợc liệu Giống nhƣ độ ẩm, mỗi loại

46 dược liệu đều có một độ tro giới hạn Đối với hương phụ, theo yêu cầu của dược điển Việt Nam phải có độ tro nhỏ hơn 3%, do đó bột nguyên liệu rễ củ cỏ cú đƣợc sử dụng trong luận văn (độ tro: 2.88%) đáp ứng đƣợc yêu cầu về độ tro.

PHÂN TÍCH SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT

Thành phần hóa học của thực vật rất phức tạp và thường không thể biết được một cách tường tận.Vì vậy, thông thường việc nghiên cứu thành phần hóa của chúng bắt đầu bằng việc xác định các nhóm hợp chất thường gặp trong thực vật bằng phản ứng hóa học Kết qủa phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của bột cỏ cú đƣợc trình bày ở bảng 4.2

Bảng 4 2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học rễ củ cỏ cú

Thuốc thử Hiện tƣợng Kết quả

+ - - H2SO4 đậm đặc Xuất hiện màu xanh dương đậm Có carotenoid

+ - - Bốc hơi còn lại cắn Có mùi thơm Có tinh dầu

Burchard Đỏ nâu tím, lớp trên có màu xanh lục

+ - - Nhỏ dd lên giấy Vết trong mờ Có acid béo + + - Mg/HCl đậm đặc Có màu đỏ nhạt Có flavonoid

+ + - KOH 10% Phát huỳnh quang mạnh dưới đèn UV 365nm Có coumarin

+ + - KOH 10% Có màu đỏ nhạt Có antraglucosid

TT Mayer TT Bouchardat TT Dragendorff

Tủa trắng - vàng nhạt Tủa đỏ nâu

- + + Lắc mạnh dd Tạo bọt bền Có saponin

- + + Dd FeCl3 Màu lục đen Tanin

- + - Na2CO3 Sủi bọt khí Có acid hữu cơ

A, B Tủa màu đỏ gạch Đường khử

96 o Tủa bông trắng - vàng nâu Có polyuronic

Chú thích: “+”: Phản ứng dương tính, có sự hiện diện của hợp chất.; “-“: Phản ứng âm tính, không có sự hiện diện của hợp chất

Theo kết quả khảo sát đƣợc trình bày ở bảng 4.2 cho thấy trong rễ, củ cỏ cú có sự hiện diện của carotenoid, tinh dầu, triterpenoid tự do, acid béo, flavonoid, coumarin, antraglucosid, alkaloid, saponin, tanin, acid hữu cơ, đường khử, polyuronic Kết quả này khá giống với kết quả nghiên cứu của Vũ Văn Điền đối với hương phụ vườn ở một số tỉnh phía Bắc, cho thấy có sự tương đồng về thành phần cụm hoạt chất ở các vùng miền trên lãnh thổ Việt Nam.

CHUẨN BỊ CAO CHIẾT TỔNG VÀ CÁC CAO PHÂN ĐOẠN

Để nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có độ phân cực khác nhau, thông thường tiến hành chiết những hợp chất có trong cây bằng cách sử dụng dung môi methanol (có thể chiết hầu hết các loại hợp chất tự nhiên) để tạo cao tổng, sau đó tiến hành chiết lần lƣợt bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần từ cao tổng thu đƣợc

Phương pháp chiết cao tổng trước rồi tiến hành phân tách các cao có độ phân cực khác nhau như cao HEX, EA, BU, H 2 O được sử dụng vì đây là phương pháp rẻ tiền, tiết kiệm dung môi và dễ thực hiện Cao tổng và cao phân đoạn thu đƣợc có tính chất cơ bản nhƣ sau:

Bảng 4 3 Tính chất cơ bản của cao tổng và cao phân đoạn

Tính chất Cao tổng Cao HEX Cao EA Cao BU Cao H 2 O

Màu sắc Nâu đen, đục Nâu, đục Nâu đen, đục Nâu đen, đục Nâu, trong

Mùi Thơm nồng Thơm nồng Thơm nồng Thơm nồng Thơm ngọt

Dạng Keo đặc Keo sệt Keo đặc Keo cứng Keo loãng

Từ bảng 4.3 có thể thấy trừ cao nước thì các cao còn lại có ngoại quan và mùi khá giống nhau; riêng cao HEX có màu nhạt hơn Điểm khác biệt của cao H 2 O là trong suốt, trong khi các cao còn lại đều đục khó có thể nhìn xuyên suốt Mùi của cao

H 2 O cũng có mùi ngọt nhẹ, chứ không hắc nhƣ các cao còn lại Khi xét về dạng của các cao thì đa phần lại không giống nhau: Cao BU thì cứng rất khó lấy, cao nước thì loãng, các cao còn lại có dạng sệt hoặc đặc Sự khác biệt về tính chất của các cao tổng và cao phân đoạn cho thấy sự khác biệt về khả năng tách chiết của các loại dung môi khác nhau Điều này sẽ đƣợc trình bày rõ ràng hơn ở các kết quả tiếp theo

Các thông số và hiệu suất qui trình chiết của cao tổng đƣợc trình bày ở bảng 4.4

Bảng 4 4 Các thông số và hiệu suất qui trình chiết cao tổng

Các thông số Lần 1 Lần 2 Lần 3 mvật liệu (g) 100 100 100 Độ ẩm (%) 9.54 9.88 11.02

Hiệu suất trung bình H 1ct (%) 22.51

Chú ý: Hiệu suất H 1 (%) tính trên bột nguyên liệu khô

Các cao phân đoạn đƣợc phân tách thành các cụm hoạt chất từ cao tổng Dựa trên nguyên tắc chung là dung môi không phân cực (ether dầu hỏa, n-hexane, …) sẽ hòa tan tốt các hợp chất không phân cực (alcol béo, ester béo,…), dung môi phân cực trung bình (diethyl ether, chloroform, …) sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình (các hợp chất có chứa nhóm chức ether -O-, aldehyde -CHO=, cetone -

CO-, ester -COO-, …) và dung môi có tính phân cực mạnh (methanol, …) sẽ hòa tan tốt các hợp chất phân cực (các hợp chất có chứa nhóm -OH, -COOH, …)

Các dung môi chiết phân đoạn đƣợc bố trí chiết sao cho độ phân cực tăng dần nhằm tách chiết hiệu quả tất cả các chất Các thông số và hiệu suất chiết cao phân đoạn đƣợc thu nhận ở bảng 4.5

Bảng 4 5 Các thông số và hiệu suất của qui trình chiết cao phân đoạn

Các thông số Lần 1 Lần 2 Lần 3 m vật liệu (g) 15 15 15

Loại cao Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình

Chú ý: Hiệu suất H 1 (%) tính trên nguyên liệu khô; Hiệu suất H 2 (%) tính trên cao tổng

Hiệu suất chiết H1 của các cao tổng và phân đoạn quy về nguyên liệu khô

Hình 4.1 Hiệu suất chiết H1 của các cao tổng và phân đoạn

Hình 4.2 Hiệu suất chiết H2 của các cao tổng và phân đoạn

Cao tổng Cao Hex Cao EA Cao Bu Cao H2O

Cao Hex Cao EA Cao Bu Cao H2O

50 Từ bảng 4.4, 4.5 và hình 4.1, 4.2 có thể thấy hiệu suất chiết cao với các dung môi: HEX, EA, BU gần như nhau trong khi chiết với nước là cao nhất (gần gấp 3 lần so với các cao phân đoạn còn lại) Tổng hiệu suất chiết H 2 của cao H2O và BU là 62.36% - gấp 2.35 lần so với tổng hiệu suất của cao HEX và EA (26.64%) Điều này cho thấy trong rễ, củ cỏ cú thì các chất có độ phân cực mạnh (có hằng số điện môi tương đương với nước và buthanol) chiếm tỷ lệ cao; các hợp chất không phân cực (có hằng số điện môi tương đương với n-hexane), các hợp chất phân cực trung bình (có hằng số điện môi tương đương với ethyl acetae), chiếm tỷ lệ thấp hơn hẳn Điều này hoàn toàn phù hợp với bản chất của quá trình chiết tách dƣợc liệu bằng dung môi: là quá trình di chuyển vật chất trong hệ hai pha rắn - lỏng nhờ khả năng hòa tan hoạt chất của dung môi, do đó những chất có độ hòa tan gần nhau sẽ dễ dàng đƣợc tách ra hơn

Dung môi sử dụng trong chiết cao tổng là methanol, là chất có độ phân cực mạnh, vì thế trong quá trình chiết cao tổng, phần lớn các chất có độ phân cực mạnh đƣợc di chuyển ra ngoài màng tế bào và hòa tan trong dịch chiết Khi cho nước vào cao tổng và khuấy, các chất có độ phân cực mạnh tạo liên kết hydro với nước và bền vững cho tới cuối giai đoạn chiết phân đoạn, vì thế hiệu suất chiết với nước sẽ là cao nhất

Tổng hiệu suất của các cao chiết phân đoạn (20.03%) gần bằng với hiệu suất chiết cao tổng (22.51%) nên có thể đánh giá chuỗi qui trình chiết phân đoạn đƣợc bố trí tốt, cho hiệu suất thu hồi các chất cao; tuy nhiên trong thao tác làm cũng không tránh khỏi một số mất mát do vật chất bị bay hơi theo dung môi, phân hủy chất

ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT

Rất nhiều nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng nhiều hợp chất polyphenol có hoạt tính sinh học mạnh Trong thực vật, polyphenol có đến 8000 cấu trúc khác nhau trên khung sườn có ít nhất một nhân thơm với một hoặc nhiều nhóm hydroxy Mục tiêu của việc đánh giá hàm lƣợng phenol tổng là xác định dung môi có khả năng chiết đƣợc nhiều polyphenol nhất Hàm lƣợng polyphenol của cao chiết đƣợc trình bày ở bảng 4.6

Bảng 4 6 Hàm lƣợng phenol tổng (TPE) của cao tổng và phân đoạn

Hàm lƣợng phenol tổng TPE (mg/g) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình

Hình 4 3 Hàm lƣợng phenol tổng của các cao tổng và phân đoạn

Từ bảng 4.6 và hình 4.3, có thể thấy sắp xếp hàm lƣợng polyphenol trong các cao chiết nhƣ sau: cao EA > cao BU > cao H 2 O > cao HEX > cao tổng Trong đó hàm lƣợng phenol tổng của cao EA vƣợt trội hẳn (gấp 1.5 lần) các cao phân đoạn còn lại

Các cao HEX, cao BU và cao H 2 O có hàm lƣợng xấp xỉ nhau

Khi chiết hỗn hợp cao tổng - nước với dung môi n-hexane thì các chất có độ phân cực thấp (chất màu, sáp, chất béo, các hydrocarbon ) sẽ bị hòa tan trong dung môi n-hexane và đƣợc tách ra Trong thực vật, đa số các polyphenol là các chất có độ phân cực mạnh, nên trong phân đoạn n-hexane không có nhiều polyphenol, do đó hàm lƣợng phenol tổng trong cao HEX là thấp nhất Tiếp tục chiết hỗn hợp này với dung môi EA, thì một phần lớn các polyphenol đƣợc tách ra Điều này giúp cho việc định hướng về độ phân cực của polyphenol trong thực vật Nhiều nghiên cứu cũng đã ghi nhận phần lớn polyphenol nằm trong phân đoạn ethyl acetate và trong đó thì flavonoid chiếm 1 lƣợng rất lớn Các polyphenol còn lại tiếp tục đƣợc tách ra khi hòa

Cao tổng Cao HEX Cao EA Cao BU Cao H2O

Hàm lƣợng phenol tổng TPE (mg/g)

52 tan trong dung môi BU và nước Hàm lượng polyphenol trong hai cao này thấp hơn so với cao EA, cho ta định hướng về các polyphenol có độ phân cực tương đương với BU và nước không nhiều bằng các polyphenol có độ phân cực tương đương với EA

Cao tổng chứa nhiều tạp chất nên hàm lƣợng phenol tổng thấp hơn các cao phân đoạn còn lại; tuy nhiên đây vẫn là một cao có tiềm năng sử dụng rất lớn cần đƣợc nghiên cứu về sau

4.4.2 Khả năng kháng oxy hóa của cao tổng và cao phân đoạn bằng phương pháp DPPH

Mẫu cao tổng và các mẫu cao phân đoạn đều đƣợc đo ở 8 nồng độ khác nhau

(các nồng độ này đều được khảo sát trước đảm bảo Q% đi từ 0-100%) Ở mỗi nồng độ đƣợc đo lặp lại 3 lần tính trung bình để giảm thiểu sai số Khảo sát tính kháng oxy hóa của cao tồng và cao phân đoạn thông qua việc xác định giá trị IC 50 (giá trị nồng độ ức chế đƣợc 50% gốc tự do)

Hình 4.1 Khả năng ức chế gốc tự do theo phương pháp DPPH của các cao tổng và phân đoạn

Giá trị IC 50 của cao chiết đƣợc suy ra từ đồ thị biểu diễn phần trăm ức chế DPPH theo logC Trong luận văn này, IC 50 đƣợc xác định bằng graph prism 5 và đƣợc trình bày trong bảng 4.7

Bảng 4 7 Giá trị IC 50 của các cao tổng và phân đoạn

Loại cao chiết Cao tổng Cao HEX Cao EA Cao BU Cao H 2 O IC50 (μg/ml) 249.90 608.90 186.10 784.60 809.70

Hình 4 5 Giá trị IC50(μg/ml) của các cao tổng và phân đoạn

Giá trị IC50 càng cao thể hiện tính kháng oxy hóa càng thấp Từ bảng 4.7 và hình 4.5 cho thấy mức độ kháng oxy hóa của các cao nhƣ sau: cao EA > cao tổng > cao HEX > cao BU > cao H 2 O

Cao EA là cao có giá trị IC 50 thấp nhất, nhỏ hơn các cao phân đoạn còn lại từ 3- 4 lần, thể hiện tính kháng oxy hóa vƣợt trội so với các cao còn lại Trong cao EA có thể có các sesquiterpen, diterpen, coumarin, quinon, các aglycon do hợp chất glycosid bị thuỷ giải, các monoglycosid, một số alkaloid loại base yếu Đây là những hợp chất có hoạt tính kháng oxy hóa tốt nên sự kết hợp có thể gia tăng hoạt tính cho loại cao này

Trong cao HEX có thể có các hydrocarbon béo và thơm, các thành phần của tinh dầu nhƣ monotecpene, các chất không phân cực nhƣ các chất béo carotene, các sterol, các chất màu thực vật…Sự kết hợp của các hợp chất này làm cho cao HEX có hoạt tính kháng oxy hóa theo cơ chế bắt gốc tự do DPPH Tuy nhiên giá trị IC 50 thu đƣợc cao hơn rất nhiều so với cao tổng cũng nhƣ vitamin C (16.37± 0.21àg/ml) thể

Cao tổng Cao HEX Cao EA Cao BU Cao H2O

IC50 (μg/ml) hiện tính kháng oxy hóa thấp, điều này có thể một phần là do sự có mặt của các chất màu làm ảnh hưởng đến kết quả đo hấp thu quang phổ Dù vậy, đây vẫn là một loại cao tiềm năng, cần kết hợp với các kết quả kiểm nghiệm khác để có những kết luận đúng đắn về hoạt tính sinh học của chúng

Trong cao BU sẽ có mặt glycozit, ankaloid, flavonoid, các hợp chất phenol, nhựa, acid hữu cơ… Trong cao nước sẽ có mặt glycoside, tanin, các đường, các hidratcacbon phân tử vừa nhƣ pectin, các protein thực vật, các muối vô cơ… Sự kết hợp của các chất này trong cao nước và cao BU làm cho chúng có tính kháng oxy hóa yếu

Nhiều nghiên cứu gần đây cũng đã chỉ ra mối tương quan của khả năng kháng oxy hóa và hàm lƣợng polyphenol khi cho rằng đa số các polyphenol có tính kháng oxy hóa mạnh: Nhóm hydroxyl tự do trong phân tử polyphenol tạo liên kết với gốc tự do, giúp chuyển gốc tự do sang trạng thái bền Xem xét mối tương quan của hàm lƣợng polyphenol trong các cao phân đoạn (trình bày trong bảng 4.6) và các giá trị IC50 của chúng (trình bày trong bảng 4.7) có thể thấy xu thế của các cao phân đoạn khá giống nhau: Hàm lƣợng nhiều nhất / Kháng oxy hóa mạnh nhất là cao EA với những giá trị trội hơn hẳn; các cao phân đoạn còn lại thì khá gần nhau về hoạt tính cũng như hàm lượng polyphenol Điều này một lần nữa khẳng định mối tương quan của polyphenol và khả năng kháng oxy hóa của thực vật Riêng cao tổng tuy có hàm lƣợng polyphenol thấp nhất nhƣng lại có khả năng kháng oxy hóa mạnh là do trong thành phần cao chiết tổng ngoài các hợp chất polyphenol còn có các hoạt chất khác có khả năng kháng oxy hóa mạnh (nằm trong phân đoạn cao HEX ) nên khi đánh giá mối tương quan thì thể hiện không rõ ràng

4.4.3 Khả năng kháng vi sinh vật

4.4.3.1 Khả năng kháng vi sinh vật của cao tổng và các cao phân đoạn theo phương pháp pha loãng

Bảng 4 8 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao tổng và cao phân đoạn trên các vi sinh vật thử nghiệm

Nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết (àg/ml)

Cao HEX Cao EA Cao BU Cao

Nồng độ MIC được xác định ở đĩa môi trường mà ở đó các vi khuẩn bị ức chế phát triển nên mật độ vi khuẩn giảm hẳn, chỉ còn 1- 3 khuẩn lạc Do đó, giá trị MIC càng cao thì khả năng kháng khuẩn càng thấp Kết quả từ bảng 4.8 cho thấy trừ cao nước ra thì các cao còn lại đều có khả năng kháng khuẩn ở các nồng độ thấp, đặc biệt là cao EA và cao HEX có nồng độ MIC thấp hơn hẳn so với các cao còn lại Chẳng hạn, nồng độ ức chế tối thiểu đối với E faecalis của cao EA là 1000(àg/ml), của cao HEX là 1500(àg/ml), trong khi của cao BU và cao nước là 3000(àg/ml) - gấp 3 lần cao EA và gấp 2 lần cao HEX, cao H2O là 4000(àg/ml) - gấp 4 lần cao EA và gấp 2.6 lần đối với cao HEX Đối với các chủng vi khuẩn còn lại, thì sự khác biệt này vẫn tương tự, chứng tỏ hai cao EA và cao HEX có khả năng kháng khuẩn mạnh hơn các cao còn lại

Khảo sát trên 6 chủng vi khuẩn nhƣng có thể thấy các cao EA và cao HEX có ảnh hưởng mạnh mẽ đến hai chủng vi khuẩn là B.cereus và P.aeruginosa: Đối với cao HEX nồng độ ức chế tối thiểu với 2 chủng vi khuẩn này là 750 àg/ml, trong khi nồng độ ức chế với vi khuẩn E faecalis / E.coli/ S.aureus lớn hơn hẳn với giá trị là

XÂY DỰNG ĐIỀU KIỆN CHIẾT

Xây dựng điều kiện chiết sao cho cao chiết thu đƣợc có hoạt tính sinh học mạnh Trong luận án, hai phân đoạn ethyl acetate và n-hexane đƣợc tập trung đánh giá vì có hoạt tính sinh học mạnh Nội dung khảo sát đƣợc thực hiện trong các khảo sát nhƣ sau:

4.5.1 Ảnh hưởng của cách thức chiết Bảng 4 11 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hiệu suất chiết H1 của cao tổng

Thời gian chiết trong một lần (h/lần) 1 3 1.5 2 3

Trạng thái dịch chiết Màu vàng nhạt

Màu nâu sậm Trạng thái cao chiết Nâu sậm Nâu sậm Nâu sậm Nâu sậm Nâu sậm Hiệu suất H1 (%) 11.50% 12,76% 13,67% 17,00% 17,11%

Hình 4 6 Ảnh hưởng của cách thức chiết đến hiệu suất chiết H 1 của cao tổng

Từ bảng 4.11 và hình 4.6 có thể thấy khi tăng số lần chiết hay tổng thời gian chiết đều dẫn đến tăng hiệu suất thu cao tổng Chẳng hạn, ở cùng số lần chiết là 2 lần, khi thời gian chiết tăng từ 1h đến 3 h thì hiệu suất cũng tăng từ 11.50% đến 12.76%

Tương tự, với số lần chiết là 3 lần, khi tăng thời gian chiết từ 1.5 h đến 3 h thì hiệu suất cũng tăng từ 13.67% đến 17.11%

Trong cùng điều kiện chiết là 3h/lần, nếu chiết 2 lần thì hiệu suất là 12.76%, nhƣng nếu lặp thêm 1 lần chiết nữa với bã thì hiệu suất tăng lên 17.11%, độ tăng

Tuy nhiên cũng cần lưu ý đến tổng thời gian tiêu tốn, vì quá trình chiết thực hiện ở nhiệt độ sôi của dung dịch, nếu thời gian tiêu tốn quá dài sẽ dẫn đến hao phí nhiệt lƣợng cũng nhƣ dung môi đáng kể Ở cùng số lần chiết là 3 lần, mặc dù tổng thời gian chiết tăng thêm 3 h nhƣng hiệu suất tăng từ 17.00% lên 17.11%, độ tăng chiếm tỷ lệ

1%, gần nhƣ không đáng kể Điều này là do trong khoảng thời gian này nồng độ chất tan trong dung môi chiết đã đạt bão hòa nên khi tăng thời gian lên, hiệu suất chiết vẫn không đổi Ở cùng tổng thời gian chiết là 6h, nhƣng với 2 cách thức chiết là 3x2 và 2x3, hiệu suất tăng lên từ 12.76% đến 17.00%, mức độ tăng chiếm 34%

Vì vậy, chọn cách thức chiết là 2x3, không chỉ thu đƣợc hiệu suất cao mà còn là giải pháp cho vấn đề hao phí thời gian, nhiệt lƣợng, cũng nhƣ dung môi

4.5.2 Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu

Tiến hành khảo sát ở hai cỡ hạt là bột mịn và cỡ hạt xay thô

Bảng 4 12 Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hiệu suất chiết H1 của cao tổng

Cỡ hạt Hình ảnh Hiệu suất (%)

Nhìn chung, kết quả khảo sát cho thấy sự ảnh hưởng rõ rệt của kích thước nguyên liệu đến hiệu suất chiết cao tổng Kích thước càng giảm thì hiệu suất chiết càng tăng Khi ở dạng xay thô bằng máy xay trong phòng thí nghiệm thì hiệu suất chiết chỉ đạt 17.00%, nhưng trong trường hợp sử dụng máy nghiền, bột mịn hơn thì hiệu suất tăng lên 22.51%, gấp 1.32 lần so với bột xay thô Điều này là do diện tích bề mặt tiếp xúc với dung môi của các hạt bột mịn lớn hơn bột xay thô, thêm nữa khi nghiền mịn phá vỡ các thành tế bào tạo điều kiện cho các chất thấm ra ngoài màng tế bào

Vì vậy, nguyên liệu sau khi phơi khô, đƣợc đem đi nghiền mịn

4.5.3 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết

Trong nội dung này, độ phân cực của dung môi sẽ đƣợc thay đổi bằng cách điều chỉnh hàm lƣợng dung dịch methanol Việc thay đổi độ phân cực dung môi ngoài ảnh hưởng đến hiệu suất chiết thì cũng sẽ liên quan đến thành phần các chất đƣợc chiết ra và dẫn đến sự thay đổi hoạt tính sinh học Chính vì vậy, trong nội dung nghiên cứu này, ngoài hiệu suất chiết cao thì các yếu tố nhƣ hàm lƣợng phenol tổng và khả năng kháng oxy hóa cũng đƣợc đánh giá

Bảng 4 13 Hiệu suất chiết H 1 , H2(%) cao tổng, cao HEX và cao EA khi chiết cao tổng với các nồng độ methanol khác nhau

Hiệu suất chiết H 1 , H2(%) Nồng độ methanol

Cao tổng 19.34 - 20.25 - 23.62 - 24.34 - 22.51 - Cao HEX 0.30 1.33 0.56 2.47 1.85 8.20 4.04 17.93 3.44 15.27 Cao EA 0.60 2.67 1.11 4.93 1.86 8.27 3.00 13.33 2.55 11.33

(Chú ý: Hiệu suất H 1 (%): Hiệu suất tính trên 100g nguyên liệu khô, Hiệu suất H 2 (%): Hiệu suất tính trên 100g cao tổng)

Hình 4 7 Hiệu suất chiết H1(%) của cao tổng, cao HEX và cao EA khi chiết cao tổng với các nồng độ methanol khác nhau

Hình 4 8 Hiệu suất chiết H2(%) của cao HEX và cao EA khi chiết cao tổng với các nồng độ methanol khác nhau

Bảng 4 14 Tỷ lệ hiệu suất chiết cao tổng, cao HEX , cao EA khi nồng độ dung môi methanol tăng

Tỷ lệ hiệu suất (%) Độ tăng nồng độ (%) 20-40 40-60 60-80 80-100

Từ bảng 4.12, hình 4.7 và 4.8, có thể thấy xu hướng hiệu suất chiết H 1 của cao tổng và các cao phân đoạn đều tăng dần khi nồng độ methanol tăng từ 20% đến 80%, sau đó giảm Khi thêm nước vào dung môi methanol sẽ làm tăng độ phân cực của dung môi, do tăng thêm nhóm hydroxyl của nước, nhờ thế khả năng tách các chất phân cực sẽ tăng lên Độ phân cực của dung môi sẽ tỷ lệ thuận với tỷ lệ Methanol/ nước: Tỷ lệ càng lớn thì độ phân cực càng nhỏ Tuy nhiên, tại tỷ lệ 80%, đạt giá trị hiệu suất thu cao tổng và các cao phân đoạn lớn nhất Có thể kết luận tại tỷ lệ này độ phân cực của dung môi tương đương với nhiều hợp chất có trong rễ, củ cỏ cú

Nhìn vào bảng 4.13, có thể thấy sự thay đổi tỷ lệ hiệu suất của các cao chiết tương ứng với độ tăng của các nồng độ khác nhau, chứng tỏ sự thay đổi nồng độ dung môi có ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất thu của cao chiết Đặc biệt là khi tăng nồng độ methanol từ 40% - 60% và 80% - 100% ở cả cao tổng, cao HEX và cao EA đều cho thấy có sự khác biệt rất lớn về tỷ lệ hiệu suất:

Chẳng hạn ở độ tăng nồng độ methanol từ 40% lên 60%: ở cao tổng thì tỷ lệ tăng là 1.17 (trong khi ở các tỷ lệ lân cận là 1.05, 1.03), ở cao HEX là 3.30 (trog khi ở các tỷ lệ nồng độ lân cận thì tỷ lệ tăng là 1.87, 2.18); chỉ riêng ở cao EA là có sự giảm tỷ lệ tăng ở tỷ lệ nồng độ 60/40 (1.68 - Nhỏ hơn tỷ lệ tăng 1.85 tại tỷ lệ nồng độ 40/20), tuy nhiên nếu xét theo sự giảm dần của tỷ lệ tăng thì có sự giảm đột ngột từ 1.85 xuống 1.68) Điều này chứng tỏ khi thay đổi nồng độ methanol từ 40% đến 60% thì có sự thay đổi rất lớn về thành phần hoạt chất đƣợc tách chiết ra Trong hai cao phân đoạn thì cao HEX chịu ảnh hưởng rõ hơn khi thể hiện ở tỷ lệ hiệu suất đột biến lên đến 3.30, tức là các hợp chất không phân cực cũng đƣợc chiết ra nhiều hơn chứ không chỉ các hợp chất phân cực

65 Tương tự khi tăng nồng độ từ 80% đến 100%: Có sự giảm mạnh về tỷ lệ hiệu suất khi so sánh với độ tăng nồng độ từ 60% lên 80%, thể hiện rõ ở cao HEX ( ở 60%-80%: 2.18, ở 80%-100%: 0.85) và cao EA (Ở 60%-80%: 1.61, ở 80%-100%:

0.85) Đồng thời, xét các giá trị tỷ lệ hiệu suất thì ở độ tăng 60%-80% cũng thu đƣợc các giá trị tăng khá lớn, nhất là ở cụm cao HEX Điều này chứng tỏ tại nồng độ methanol 80% cũng có ảnh hưởng rất lớn đến thành phần hoạt chất được chiết ra, mà trong đó cụm cao HEX bị ảnh hưởng khá mạnh (tương tự ở nồng độ 60%)

Do vậy, khi xét về hiệu suất thì có thể thấy nồng độ methanol 80% tách ra nhiều chất hơn so với các nồng độ khác Cần đánh giá các tiêu chí khác về hoạt tính sinh học để xây dựng qui trinh chiết sao cho thu đƣợc các cao phân đoạn có hoạt tính mạnh nhất

Kết quả xác định hàm lƣợng phenol tổng của cao chiết khi nguyên liệu đƣợc chiết với các nồng độ methanol khác nhau đƣợc thu nhận ở bảng sau:

Bảng 4 15 Hàm lƣợng phenol tổng của cao tổng, cao n-hexane, cao ethyl acetate trong tối ƣu hóa qui trình chiết cao tổng

Hàm lƣợng phenol tổng (mg/g) Cao tổng Cao HEX Cao EA

Hình 4 9 Hàm lƣợng phenol tổng của cao chiết khi chiết cao tổng với các nồng độ methanol khác nhau

Từ bảng 4.14 và hình 4.9 có thể thấy xu hướng các cao có hàm lượng polyphenol tăng dần, đạt cực đại tại nồng độ 80% sau đó giảm: Ở nồng độ methanol 80%: TPE của cao tổng là 314.38(mg/g) cao gấp 2 lần so với của methanol 20%; của cao HEX 401.88(mg/g), cao gấp 1.82 lần; của cao EA là 708.13(mg/g), cao gấp 1.27 lần Hàm lƣợng phenol tổng của cao EA trội hơn hẳn so với hai cao còn lại: Tại nồng độ methanol 80%, cao EA có TPE là 708.13(mg/g) gấp 1.76 lần so với cao HEX và gấp 2.20 lần so với cao tổng Xu hướng này cũng tương tự như đối với hiệu suất Chứng tỏ tại nồng độ 80%, nhiều polyphenol được tách ra và có thêm định hướng về độ phân cực của các hợp chất poly phenol trong rễ,củ cỏ cú