CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU VÀ THỰC NGHIỆM
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.6. Khả năng kháng vi sinh vật
Để đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của hoạt chất hay đối tƣợng nghiên cứu, thông thường sử dụng 2 phương pháp chính như sau:
Phương pháp khuyến tán đĩa thạch
Phương pháp pha loãng
Chuẩn bị vi sinh vật thử nghiệm
- Chuẩn độ đục: Sử dụng thang độ đục McFarland 0.5 đƣợc pha chế nhƣ sau:
+ Thêm 0.5 ml BaCl2 0.048M (BaCl2.2H2O 1.175% khối lƣợng/thể tích) vào
99.5ml H2SO4 0.18M (1% thể tích/thể tích) đồng thời khuấy liên tục để tạo huyền trọc.
+ Điều chỉnh độ đục của huyền trọc sao cho mật độ quang khi đo ở bước sóng 625nm nằm trong khoảng 0.08 – 0.1.
+ Phân phối vào các ống có cùng cỡ với ống dùng để chuẩn bị vi sinh vật, mỗi ống 5 ml huyền trọc, nút chặt.
36 + Dịch chuẩn độ đục được bảo quản trong tối ở nhiệt độ phòng, trước khi sử dụng phải lắc mạnh để huyền trọc phân tán đều trở lại.
- Chuẩn bị môi trường hoạt hóa vi sinh vật: Môi trường hoạt hóa vi khuẩn thử nghiệm là TSB. Thành phần môi trường gồm:
Trypticase pepton 17g
Phytone pepton 3g
NaCl 20g
KH2PO4 2.5g
Glucose 2.5g
Nước cất vừa đủ 1000ml
Đun nóng, lắc nhẹ để hòa tan, phân phối vào erlen hoặc ống nghiệm, hấp 121oC trong 15 phút, pH cuối cùng 7,3 ± 0,2.
- Vi khuẩn thử nghiệm được cấy vào ống nghiệm chứa 5 ml môi trường TSB, ủ ở 37oC cho đến khi có độ đục bằng hoặc vượt quá McFarland 0.5, thường mất khoảng 2- 4 giờ. Mẫu cấy phải đƣợc điều chỉnh độ đục cho bằng với McFarland bằng cách pha loãng với nước muối sinh lý sao cho độ hấp thu đo ở bước sóng 625 nm với nằm trong khoảng 0.08- 0.1. Độ đục này tương đương với mật độ vi sinh vật khoảng 1 – 2.108 CFU/ml.
- Vi sinh vật sau khi đã điều chỉnh phải đƣợc sử dụng trong 15 phút.
Chuẩn bị môi trường thử nghiệm
Môi trường thử nghiệm là MHA với các thành phần như sau:
Cao thịt: 5g
Pepton: 10g
NaCl: 5g
Thạch: 5g
Nước cất vừa đủ: 1000ml
Cân đầy đủ các hóa chất cho vào các bình nón, lắc đều cho hóa chất tan hoàn toàn. Điều chỉnh pH về 6.4- 6.6 bằng HCl và NaOH 1N.Hấp tiệt trùng tại 121oC trong 30 phút.
Chuẩn bị đĩa thạch Các hộp petri đƣợc rửa sạch, sấy khô ở 150oC trong 1giờ. Hấp tiệt trùng các đĩa thạch ở 121oC trong 30 phút.
3.3.6.1. Phương pháp pha loãng
Làm kháng sinh đồ theo phương pháp pha loãng liên tiếp để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC = Minimum Inhibitory Concentration) của các loại cao chiết có khả năng ngăn chặn sự tăng trưởng của vi khuẩn. Tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn trên 5 chủng vi sinh vật E. faecalis, P. aeruginosa, E. coli, S. typhi, B.
cereus, S. aureus.
Chuẩn bị vi sinh vật thử nghiệm
Huyền trọc vi sinh vật trên đƣợc pha loãng tiếp 10 lần để có mật độ vi sinh vật
khoảng 107CFU/ml. Nếu chấm một vết khoảng 1μl sẽ có số lượng vi sinh vật tương đương khoảng 104 CFU/vết.
Vi sinh vật sau khi đã điều chỉnh phải đƣợc sử dụng trong 15 phút.
Chuẩn bị dịch chiết với các nồng độ khác nhau
Các cao chiết đƣợc cân chính xác và pha thành dung dịch mẹ bằng DMSO. Theo nghiên cứu của Trần Cát Đông, DMSO với nồng độ 5% trong môi trường thử nghiệm không làm ảnh hưởng đến kết quả kháng vi sinh vật.
Khi sử dụng, pha loãng dung dịch mẹ thành các nồng độ khác nhau bằng cách
thêm một lượng MHA lỏng thích hợp.Vortex kĩ để trộn đều chất thử trong môi trường, đỗ vào đĩa petri và để nguội cho thạch đông lại. Nếu chƣa sử dụng, các đĩa thạch có chứa chất thử nghiệm phải đƣợc bảo quản trong tủ lạnh 2- 80oC trong vòng 2 tuần.
Tiến hành song song với 1 đĩa đối chứng không có chất thử nghiệm thay thế bằng DMSO.
Tiến hành
Dùng micropipette cấy 1 μl huyền trọc vi sinh vật đã điều chỉnh ở trên lên bề mặt môi trường thạch có chứa các nồng độ chất thử. Bắt đầu cấy từ nồng độ thấp nhất, mỗi
vi sinh vật cấy thành 1 chấm.
Để yên khoảng 15 – 30 phút cho vết chấm khô hoàn toàn, lật ngửa đĩa lại.
Ủ các đĩa petri trong tủ ấm 37oC trong 24 giờ.
Đọc kết quả
Kết quả chỉ có giá trị khi vi sinh vật trong đĩa đối chứng mọc bình thường.
Lần lƣợt đọc từ đĩa thạch có nồng độ chất thử nghiệm từ thấp lên cao. Quan sát sựtạo thành khóm của vi sinh vật. Nồng độ MIC được xác định ở đĩa môi trường mà ở đó có nồng độ chất thử nghiệm thấp nhất ức chế hoàn toàn sự tạo khóm của vi sinh
38 vật.
Các khóm đơn lẻ hoặc vết mờ do đầu cấy để lại không đƣợc tính. Nếu có vi sinh vật mọc ở nồng độ cao hơn và bị ức chế ở nồng độ thấp, mẫu cấy có thể đã bị nhiễm.
3.3.6.2. Phương pháp khuyếch tán đĩa thạch
Hoạt chất có trong dịch chiết khuếch tán vào trong môi trường dinh dưỡng có vi sinh vật chỉ thị tại các vùng ức chế tỷ lệ thuận với logarid nồng độ. Dịch chiết cỏ cú được cho vào các giếng thạch đã được đục sẵn trong đĩa môi trường nuôi cấy. Sau thời gian nuôi cấy thích hợp, đo đường kính vùng ức chế để đánh giá khả năng ức chế vi sinh vật của mẫu nghiên cứu[14].
Tiến hành
Môi trường MHA được nấu chảy và đổ vào đĩa petri sao cho có được lớp thạch dày 3- 4 mm. Để nguội cho thạch đông lại
Dùng micropipette hút 50μl huyền trọc vi sinh vật đã chuẩn bị cho vào các đĩa môi trường, trải đều trên mặt thạch cho đến khi ráo mặt.
Sau đó cho các đĩa petri vào trong buồng nuôi cấy (đã đƣợc vô trùng bằng cách lau cồn và bật đèn tử ngoại trong 2 giờ). Sau đó, tiến hành đục lỗ, mỗi đĩa thạch 6 lỗ (giếng thạch), đường kính 5mm.
Nhỏ dịch chiết đƣợc pha ở các nồng độ khác nhau vào giếng thạch.
Ủ các đĩa petri trong tủ ấm 37oC trong 24 giờ.
Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn sau 24 giờ:
Đọc kết quả
Quan sát đĩa thạch xem có vòng vô khuẩn hay không. Nếu có, đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Panmer có độ chính xác ± 0.1mm.