CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU VÀ THỰC NGHIỆM
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.3. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật
3.3.3.1. Nguyên tắc
Dựa vào độ hòa tan trong các dung môi khác nhau của các hợp chất trong nguyên liệu mà phân tích, dùng các dung môi có độ phân cực tăng dần: ether, ethanol và nước. Sau đó, xác định các nhóm hợp chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng đặc trƣng.
3.3.3.2. Phương pháp và thực nghiệm
Chuẩn bị dịch chiết
- Dịch chiết ether: Chiết 25g mẫu bằng diethyl ether trong bể siêu âm cho đến khi dịch ether nhạt màu. Gộp dịch chiết, lọc và cô lại còn khoảng 50ml.
- Dịch chiết cồn: Bã sau khi chiết bằng ether đƣợc chiết nóng bằng ethanol 96o trong bể siêu âm đến khi dịch gần không màu. Gộp dịch chiết, lọc và cô lại còn khoảng 50ml.
- Dịch chiết nước: Bã sau khi chiết bằng ethanol 96o được chiết nóng bằng ethanol 96o trong bể siêu âm 5 phút (3 lần) với thể tích nước vừa đến ngập mẫu. Gộp dịch chiết, lọc và cô lại còn khoảng 50ml.
Xác định các nhóm hợp chất
Xác định các nhóm hợp chất trong dịch ether
Acid hữu cơ Chất béo Triterpenoid tự do Tinh dầu
Anthraglycosid Flavonoid Alkaloid Carotenoid
Xác định các nhóm hợp chất trong dịch cồn
Xác định các nhóm hợp chất trong dịch nước
Phương pháp định tính
- Acid hữu cơ:
Lấy 2ml dịch thử cho vào ống nghiệm. Pha loãng với 1ml nước cất, thêm một ít tinh thể Na2CO3. Nếu có bọt khí sủi lên từ các tinh thể Na2CO3 – có acid hữu cơ.
- Alkaloid:
Bốc hơi tới cắn 5 ml dịch thử trong chén sứ, hòa cắn với 4 ml HCl 1%. Chia đều trong 4 ống nghiệm, nhỏ lần lƣợt vào đó các thuốc thử sau cùng với kết quả nhận định là có alkaloid:
Thuốc thử Valse-Mayer:
+ Công thức thuốc thử: 1.35g HgCl2 hòa tan trong 100ml dung dịch KI 5%
+ Dấu hiệu: Tạo kết tủa màu trắng vàng.
Thuốc thử Bouchardat:
+ Công thức thuốc thử: Ì 2.5g và 5.0g KI hòa tan trong 10ml nước cất.
+ Dấu hiệu nhận biết: cho kết tủa màu nâu hay màu vàng đậm.
Thuốc thử Dragendorff:
+ Công thức thuốc thử:
Dung dịch A: 850mg Bi(NO3)2.5H2O trong 40ml H2O và 10ml acetic băng.
Dung dịch B: Hòa tan 8g KI trong 20ml H2O.
Trộn hai thể tích bằng nhau của hai dung dịch A và B để làm thuốc thử.
+ Dấu hiệu nhận biết: tạo kết tủa có màu từ vàng cam đến đỏ.
Alkaloid Tanin Flavonoid
Anthraglycosid Đường khử Saponin
Alkaloid Tanin Anthraglycosid Polyuronic
Đường khử Flavonoid Saponin
28 - Antraglycosid:
Phản ứng Bortrager: Cho 5 ml dịch thử vào một ống nghiệm nhỏ, thêm vào đó NaOH 10 %, lắc kỹ. Nếu lớp kiềm có màu từ hồng tới đỏ - Có anthraglycosid.
- Carotenoid:
Phản ứng 1: Bốc hơi tới cắn 5 ml dịch ether trong chén sứ, nhỏ vào đó vài giọt thuốc thử Carr-Price (SbCl3 bão hòa trong CHCl3). Dung dịch có màu đỏ - Có carotenoid.
Phản ứng 2: Thêm vào cắn vài giọt H2SO4 đậm đặc. Dung dịch có màu xanh dương - Có carotenoid.
- Chất béo:
Nhỏ vài giọt dịch ether lên cùng một chỗ trên giấy xác định chất béo, sấy nhẹ cho hết dung môi, hết mùi tinh dầu (nếu có).Chỗ nhỏ để lại vết mờ - Có chất béo.
- Đường khử:
Bốc hơi 5 ml dịch thử đến cắn.Hòa cắn với 3 ml nước cất trên bếp cách thủy. Để nguội
và lọc qua giấy lọc. Thêm vào dịch lọc 0,5 ml dung dịch Fehling A và 0,5 Fehling B.
Đun cách thủy 5 phút. Nếu có tủa đỏ gạch dưới đáy ống nghiệm - Có các hợp chất khử (chủ yếu là đường khử).
- Flavonoid
Phản ứng Cyanidin: Lấy khoảng 10 ml dịch thử cho vào chén sứ, bốc hơi đến cắn khô.
Hòa cắn với 2 ml cồn 250 gạn dịch cồn cho vào một ống nghiệm nhỏ. Thêm vào đó một ít bột Mg kim loại và thêm từ từ 0,5 ml HCl đậm đặc. Sau phản ứng dung dịch có màu từ hồng tới đỏ - có flavonoid.
- Anthocyanosid: Lấy 1 ml dịch thử cho vào một ống nghiệm nhỏ, thêm 3 giọt HCl
10 %, nếu dung dịch có màu từ hồng đỏ tới đỏ và chuyển sang màu xanh khi kiềm hóa bằng dung dịch NaOH 10 % - Có anthocyanosid.
- Proanthocyanidin: Lấy 5 ml dịch thử cho vào một ống nghiệm, thêm 2 ml HCl 10
%, đun cách thủy 10 phút. Nếu dung dịch có màu hồng tới đỏ - có proanthocyanidin.
- Polyuronic:
Nhỏ từng giọt một 2 ml dịch thử vào một ống nghiệm có chứa 10 ml cồn 95o.Nếu có nhiều tủa bông đƣợc tạo thành - có polyuronid.
- Coumarin:
Phản ứng 1: Nhỏ vài giọt dịch thử lên một miếng giấy lọc, sấy nhẹ. Nhỏ lên đó hai giọt KOH 10 % trong cồn, tiếp tục sấy nhẹ cho khô. Che một nửa vết chấm bằng
một miếng kim loại, soi UV365 nm. Sau vài phút lấy miếng kim loại ra; nhận xét sự thay đổi cường độ phát quang của nửa mặt bị che: sáng dần lên đến khi sáng tương đương với nửa không bị che – có coumarin.
Phản ứng 2: Bốc hơi tới cắn 5 ml dịch thử. Hòa cắn với 2 ml cồn 700, chia đều
vào hai ống nghiệm nhỏ, thêm vào ống thứ nhất 0,5 ml KOH 10 % và ống thứ hai một lượng nước cất tương đương. Đun cách thuỷ cả hai ống nghiệm trong 2 phút, để nguội soi UV365 nm. Dung dịch trong ống một có huỳnh quang mạnh hơn dung dịch trong ống thứ hai- có coumarin.
- Saponin:
Lấy 5 ml dịch thử cho vào chén sứ bốc hơi tới cắn. Hòa cắn với 5 ml cồn trên bếp cách
thủy.Lọc, cho dịch lọc vào ống nghiệm. Thêm 5 ml nước, lắc mạnh theo chiều dọc ống. Nếu có bọt bền - có saponin.
- Tanin:
Bốc hơi tới cắn dịch thử trong chén sứ, hòa cắn với 4 ml nước cất trên bếp cách thủy.
Lọc, chia dịch chiết vào hai ống nghiệm:
Ống 1: Pha loãng với nước cất theo tỉ lệ 1:2, thêm hai giọt thuốc thử FeCl3 5 %,
lắc đều. Nếu dung dịch có màu xanh rêu hay xanh đen - có polyphenol.
Ống 2: Thêm 5 giọt dung dịch gelatin mặn, lắc đều so sánh với ống chứng.Nếu có tủa bông trắng - có tanin.
- Tinh dầu:
Bốc hơi tới cắn 5 ml dịch ether trong chén sứ; nếu cắn có mùi thơm nhẹ cho vào đó một ít cồn cao độ, bốc hơi tới cắn. Cắn có mùi thơm nhẹ đặc trƣng – có tinh dầu.
- Triterpenoid:
Phản ứng Libermann- Bourchardat: bốc hơi tới cắn 5 ml dịch thử, hòa cắn với
0,5 ml anhydrid acetic và 0,5 ml CHCl3, chuyển dung dịch vào ống nghiệm, nhỏ từ từ 1 ml H2SO4 đậm đặc theo thành ống đặt nghiêng. Nếu vòng ngăn cách có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím; lớp dung dịch phía trên dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím - có triterpennoid tự do (phytosterol).
Hình 3. 1 Sơ đồ phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật.
Mg/HClđđ Vết trên giấy lọc KOH 10%
Flavonoid Acid béo Anthraglycosid
Tinh dầu
Phytosterol Carotenoid Dịch cồn
KOH 10%
Dịch
ether Cắn có mùi
TT Liebermann H2SO4 đđ
TT Mayer, Bouchardat, Dragendoff Dịch
Lớp ether Chiết
bằng ether
Alkaloid
Saponin
Anthocyanosid Đường khử Alkaloid Acid hữu cơ
Tanin Anthraglycosid Flavonoid Sterolic Dịch acid
KOH, HCl TT Fehling A,B Nguyên
liệu
TT Mayer, Bouchardat Na2CO3
Na acetate + FeCl3 3%
KOH 10%
Mg/HClđđ
TT Liebermann Dịch
chiết cồn
Chiết bằng Bã cồn
nguyên liệu
Bã nguyên liệu H2SO4
Bã 1%
nguyên liệu
Cồn cao độ
FeCl3 TT Fehling A, B
TT Mayer, Bouchardat
H/c uronic Tanin Đường khử Alkaloid Dịch acid
Sterolic