Nghiên cứu chọn tạo bộ giống vi khuẩn phân hủy hiệu quả ddt nhằm phục vụ xử lý Đất nông nghiệp Ô nhiễm

Nghiên cứu chọn tạo bộ giống vi khuẩn phân hủy hiệu quả ddt nhằm phục vụ xử lý Đất nông nghiệp Ô nhiễm Nghiên cứu chọn tạo bộ giống vi khuẩn phân hủy hiệu quả ddt nhằm phục vụ xử lý Đất nông nghiệp Ô nhiễm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VŨ SƠN TÙNG

NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO BỘ GIỐNG VI KHUẨN PHÂN HỦY HIỆU QUẢ DDT NHẰM PHỤC VỤ

XỬ LÝ ĐẤT NÔNG NGHIỆP Ô NHIỄM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI – 01/2024

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VŨ SƠN TÙNG

NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO BỘ GIỐNG VI KHUẨN PHÂN HỦY HIỆU QUẢ DDT NHẰM PHỤC VỤ

XỬ LÝ ĐẤT NÔNG NGHIỆP Ô NHIỄM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 8420201.22

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Kim Nữ Thảo

PGS.TS Phạm Thế Hải

HÀ NỘI - 01/2024

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu

sắc đến TS Nguyễn Kim Nữ Thảo và PGS TS Phạm Thế Hải - Khoa Sinh học,

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, người đã định hướng, giúp đỡ và chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành luận văn này; đồng thời là người truyền cho tôi niềm đam mê, sự hứng thú với nghiên cứu khoa học

Tôi cũng chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô, anh chị cùng các bạn thuộc phòng thí nghiệm GREENLAB, Trung tâm nghiên cứu Khoa học Sự sống (CELIFE), Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn và trân trọng đến gia đình và bạn bè đã sát cánh bên tôi, luôn ủng hộ, tin tưởng và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Nghiên cứu trình bày trong luận văn này được tài trợ bởi đề tài Quỹ Gen, mã số NVQG-2021/ĐT.02

Hà Nội, tháng 01 năm 2024

Vũ Sơn Tùng

1.2.1 Các phương pháp xử lý thông thường 10

1.2.2 Phương pháp xử lý sinh học bằng vi sinh vật 11

1.3 Phân hủy DDT bởi vi sinh vật 12

1.3.1 Tổng quan về phân lập vi sinh vật phân giải DDT 12

1.3.2 Một số nhóm vi sinh vật phân giải DDT 14

1.3.3 Con đường phân hủy sinh học DDT bởi vi sinh vật 15

1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân hủy DDT của vi sinh vật 17

1.4 Chế phẩm sinh học xử lý ô nhiễm DDT trong đất 20

1.4.1 Chế phẩm sinh học phân hủy thuốc BVTV 20

1.4.2 Tình hình nghiên cứu chế phẩm xử lý tồn dư DDT 22

1.4.3 Quy trình sản xuất chế phẩm sinh học 22

1.4.3.1 Quy trình lên men thu sinh khối vi khuẩn 22

1.4.3.2 Thu hồi và bảo quản sinh khối vi khuẩn sau lên men 24

1.4.3.3 Ảnh hưởng điều kiện thực tế đến hiệu quả của chế phẩm sinh học khi được đưa vào trong đất 25

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28

2.1 Vật liệu và đối tượng nghiên cứu 28

2.1.1 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 28

2.1.2 Môi trường nuôi cấy 29

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 30

2.1.3.1 Mẫu đất phân lập 30

2.1.3.2 Các chủng vi khuẩn bổ sung 31

2.2 Phương pháp nghiên cứu 31

2.2.1 Phương pháp phân lập 31

2.2.1.1 Phương pháp phân lập thường quy 31

2.2.1.2 Phương pháp phân lập bằng làm giàu thông qua pha loãng 31

2.2.1.3 Phương pháp phân lập định hướng xạ khuẩn 32

2.2.2 Phương pháp đánh giá khả năng phân giải DDT bởi vi sinh vật 32

2.2.2.1 Khảo sát khả năng sinh trưởng của vi sinh vật trong môi trường bổ sung DDT 32

2.2.2.2 Khảo sát khả năng sinh các enzyme liên quan đến quá trình phân giải DDT 33

2.2.2.2.1 Phương pháp đánh giá khả năng sinh enzyme loại Cl- 33

2.2.2.2.2 Phương pháp đánh giá khả năng sinh enzyme oxy hóa 34

2.2.2.3 Phương pháp khảo sát khả năng phân giải DDT bằng GC-FID 34

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học và định danh các chủng vi sinh vật nghiên cứu 35

2.2.3.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái 35

2.2.3.2 Định danh vi khuẩn bằng phân tích gen 16S rRNA và gen đặc trưng (house-keeping genes) 35

2.2.3.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học 36

2.2.3.4 Nghiên cứu khả năng sinh chất hoạt động bề mặt (biosurfactant) 37

2.2.4 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng các điều kiện thực tế đến khả năng xử lý DDT của các chủng vi sinh vật nghiên cứu 38

2.2.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 38

2.2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường 38

2.2.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ DDT 38

2.2.4.4 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn Cac-bon bổ sung 39

2.2.4.5 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn Ni-tơ bổ sung 39

2.2.4.6 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ dịch vi lượng 39

2.2.4.7 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ cấp giống 39

2.2.5 Các thí nghiệm nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm sinh học xử lý ô nhiễm DDT trong đất ở quy mô phòng thí nghiệm 40

2.2.5.1 Nghiên cứu môi trường lên men thu sinh khối vi khuẩn 40

2.2.5.1.1 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nguồn cac-bon 40

2.2.5.1.2 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nguồn ni-tơ 40

2.2.5.1.3 Thí nghiệm khảo sát tỷ lệ tiếp giống 41

2.2.5.2 Nghiên cứu giải pháp thu hồi sinh khối vi khuẩn sau lên men 41

2.2.5.2.1 Thí nghiệm thu hồi sinh khối bằng phương án đông khô 42

2.2.5.2.2 Thí nghiệm thu hồi sinh khối bằng phương án ly tâm 42

2.2.5.2.3 Thí nghiệm thu hồi sinh khối bằng phương án lọc 42

2.2.5.3 Nghiên cứu chất mang bảo quản sinh khối vi khuẩn sau thu hồi 43

2.2.6 Các thí nghiệm nghiên cứu xử lý đất ô nhiễm DDT bằng chế phẩm sinh học ở quy mô phòng thí nghiệm 43

2.2.6.1 Thử nghiệm xử lý ô nhiễm DDT bằng chế phẩm sinh học với các tỷ lệ bổ sung nước khác nhau 44

2.2.6.2 Thử nghiệm xử lý ô nhiễm DDT bằng chế phẩm sinh học với các tỷ lệ bổ sung chế phẩm khác nhau 45

2.2.6.3 Thử nghiệm xử lý ô nhiễm DDT bằng chế phẩm sinh học với sự bổ sung các chất hoạt động bề mặt khác nhau 45

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46

3.1 Phân lập vi sinh vật từ mẫu đất 46

3.2 Kết quả khảo sát khả năng phân giải DDT của bộ chủng phân lập 47

3.2.1 Khả năng sinh trưởng của các chủng phân lập được trong môi trường bổ

3.3.2 Kết quả phân tích gen 16S rRNA 52

3.3.3 Kết quả phân tích gen đặc trưng (house-keeping genes) 55

3.3.4 Kết quả phân tích đặc điểm sinh hóa 59

3.3.5 Khả năng sinh chất hoạt động bề mặt (biosurfactant) 63

3.4 Ảnh hưởng của các điều kiện thực tế đến khả năng phân giải DDT của bộ chủng được chọn 65

3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 65

3.4.2 Ảnh hưởng của pH 66

3.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ DDT 67

3.4.4 Ảnh hưởng của nguồn Cac-bon bổ sung 68

3.4.5 Ảnh hưởng của nguồn Ni-tơ bổ sung 69

3.4.6 Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch vi lượng 70

3.4.7 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống 71

3.4.8 Lựa chọn các chủng tiềm năng nhất để sử dụng tạo chế phẩm sinh học 72

3.5 Kết quả xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm sinh học từ các chủng được chọn nhằm xử lý ô nhiễm DDT trong đất ở quy mô phòng thí nghiệm 73

3.5.1 Xây dựng môi trường lên men thu sinh khối các chủng được chọn 74

3.5.1.1 Kết quả khảo sát nguồn Cac-bon 74

3.5.1.2 Kết quả khảo sát nguồn Ni-tơ 75

3.5.1.3 Kết quả khảo sát tỷ lệ cấp giống 77

3.5.2 Kết quả nghiên cứu giải pháp thu hồi sinh khối các chủng được chọn sau lên men 78

3.5.3 Kết quả nghiên cứu chất mang bảo quản sinh khối các chủng được chọn

sau thu hồi 81

3.5.4 Tổng hợp quy trình sản xuất chế phẩm sinh học từ các chủng được chọn 84

3.6 Kết quả nghiên cứu xử lý đất ô nhiễm DDT bằng chế phẩm sinh học từ các chủng được chọn ở quy mô phòng thí nghiệm 85

3.6.1 Thử nghiệm xử lý ô nhiễm DDT bằng chế phẩm sinh học với các tỷ lệ bổ sung nước khác nhau 85

3.6.2 Thử nghiệm xử lý ô nhiễm DDT bằng chế phẩm sinh học với các tỷ lệ bổ sung chế phẩm khác nhau 88

3.6.3 Thử nghiệm xử lý ô nhiễm DDT bằng chế phẩm sinh học với các tỷ lệ bổ sung chất hoạt động bề mặt khác nhau………90

3.6.4 Sản phẩm của quá trình phân hủy sinh học DDT trong đất của chế phẩm chứa S maltophilia Y042 94

KẾT LUẬN 97

KIẾN NGHỊ 99

TÀI LIỆU THAM KHẢO 100

PHỤ LỤC 109

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1 (a) Đồng phân hóa học của DDT, (b) Cấu trúc hóa học của DDT 3

Hình 1.2 Vị trí các kho chứa DDT chính trên thế giới 8

Hình 1.3 Phân bố DDT trong trầm tích ở một số địa điểm tại Việt Nam 9

Hình 1.4 Tổng hợp các con đường phân giải DDT bởi vi sinh vật đã biết 16

Hình 3.1 Số lượng các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn được phân lập từ mẫu đất Nghệ An 46

Hình 3.2 So sánh khả năng sinh trưởng trong MSM và MSM bổ sung DDT 48

Hình 3.3 Khả năng sinh enzyme loại Chloride và Oxy hóa liên quan đến con đường phân giải DDT của vi khuẩn và xạ khuẩn 49

Hình 3.4 Sự thay đổi nồng độ DDT theo thời gian trong môi trường bán rắn 51

Hình 3.5 Cây phát sinh loài được tạo dựa trên phân tích trình tự tương đồng của gen 16S rRNA 54

Hình 3.6 Cây phát sinh loài được tạo dựa trên phân tích trình tự tương đồng của gen đặc trưng 58

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ loại Cl- của các chủng được chọn 65

Hình 3.8 Hình 3.8 Ảnh hưởng của pH đến tốc độ loại Cl- của các chủng được chọn 67

Hình 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ DDT đến tốc độ loại Cl- của các chủng được chọn 68

Hình 3.10 Ảnh hưởng của nguồn cac-bon đến tốc độ loại Cl- của các chủng được chọn 69

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nguồn ni-tơ đến tốc độ loại Cl- của các chủng được chọn 70

Hình 3.12 Ảnh hưởng của nguồn vi lượng đến tốc độ loại Cl- của các chủng được chọn 71

Hình 3.13 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống đến tốc độ loại Cl- của các chủng được chọn 72

Hình 3.14 Khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn trong môi trường bổ sung

các nguồn cac-bon khác nhau theo thời gian 75

Hình 3.15 Khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn trong môi trường bổ sung

các nguồn ni-tơ khác nhau theo thời gian 76

Hình 3.16 Khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn với tỷ lệ tiếp giống khác

nhau theo thời gian 77

Hình 3.17 Hiệu suất thu hồi sinh khối sau lên men vi khuẩn bằng các phương án

khác nhau 79

Hình 3.18 Khả năng sống sót của vi khuẩn bảo quản trong chất mang và hoạt tính

loại Cl- của chế phẩm tương ứng theo thời gian 83

Hình 3.19 Tổng hợp quy trình sản xuất chế phẩm sinh học xử lý DDT bằng các

chủng nghiên cứu được chọn 85

Hình 3.20 Khả năng xử lý DDT trong đất bằng chế phẩm sinh học bổ sung các tỷ lệ

Hình 3.23 Sắc ký đồ ion tổng số (TIC) thể hiện sản phẩm chuyển hóa của DDT trong

đất bởi chế phẩm chứa S maltophilia Y042 95

Hình 3.24 Giả thuyết về quá trình phân hủy sinh học DDT trong đất bởi chế phẩm

chứa S maltophilia Y042 96

DANH MỤC BẢNG BIỂUBảng 2.1 Thông tin mẫu đất thu thập tại Nghệ An 30 Bảng 3.1 Tỷ lệ tương đồng về trình tự gen 16S rRNA của bộ chủng được chọn khi tham chiếu với cơ sở dữ liệu NCBI 52 Bảng 3.2 Tỷ lệ tương đồng gen đặc trưng của bộ chủng được chọn với cơ sở dữ liệu

DANH MỤC VIẾT TẮT

BVTV: Bảo vệ thực vật DDT: 1,1,1-dichloro diphenyl trichloroethane EPA: Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (Environmental Protection

Agency) GC-FID: Sắc ký khí - Đầu dò ion hóa ngọn lửa (Gas Chromatography -

Flame Ionization Detector) GC-MS: Sắc ký khí - Quang phổ khối (Gas Chromatography - Mass

Spectroscopy) rpm: Vòng/ phút (Revolutions per minute) WHO: Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization) MSM: Môi trường muối khoáng tối thiểu (Mineral salt medium) LB: Môi trường Luria Bertani

YS: Môi trường cao nấm men - tinh bột (Yeast extract - Starch) Tw80: Tween80

RLs: Rhamnolipids DGDG: Digalactosyl Diglyceride

MỞ ĐẦU

Từ những năm 1940, nhằm phục vụ cho hoạt động sản xuất nông nghiệp, lượng lớn thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) đã được sản xuất và ứng dụng rộng rãi trên khắp thế giới; trong đó, DDT là loại thuốc BVTV được sử dụng phổ biến bởi khả năng diệt côn trùng gây hại hiệu quả Tuy nhiên, sau những chiến chiến dịch phun phủ DDT quy mô lớn trong thời gian dài, những tác động tiêu cực của chất này đã được phát hiện DDT là chất ô nhiễm hữu cơ có độc tính cao, có khả năng tích lũy sinh học theo chuỗi thức ăn gây ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe con người và cộng đồng, làm rối loạn nội tiết, có tiềm năng gây ung thư cho người; tính kị nước cao của DDT khiến chất này tồn tại thời gian dài trong các sinh vật bị phơi nhiễm Do vậy, từ những năm 1970, DDT đã bị cấm ở nhiều quốc gia và đến năm 2001 DDT bị cấm sản xuất, sử dụng cho mục đích nông nghiệp trên toàn thế giới theo Công ước Stockholm Ở Việt Nam, DDT được liệt kê vào danh mục thuốc BVTV cấm sử dụng theo quyết định số 23/BVTV-KHKT/QĐ ngày 20 tháng 1 năm 1992 của Bộ Nông nghiệp và Công nghiệp Thực phẩm Tuy nhiên, do cấu trúc phức tạp, tính kỵ nước cao, đặc tính bền vững trong môi trường, dư lượng DDT vẫn được phát hiện tồn dư ở nhiều vùng khác nhau trên thế giới Riêng ở Việt Nam, tính đến tháng 6 năm 2015, trên địa bàn toàn quốc có 1562 điểm nghi ngờ tồn lưu chất bảo vệ thực vật, trong đó phần lớn là DDT với nồng độ ô nhiễm trong mẫu đất lên đến 268mg/kg, mẫu nước là 4µg/L Điều này ảnh hưởng nghiêm trọng tới môi trường đất nông nghiệp cũng như sức khỏe con người

Hiện nay, DDT chủ yếu được xử lý bằng các phương pháp hóa lý, nhưng các biện pháp này lại gây ảnh hưởng độc hại đến môi trường Vậy nên, việc sử dụng biện pháp sinh học thân thiện hơn với môi trường, tiết kiệm chi phí đồng thời loại bỏ hiệu quả tồn dư DDT là một giải pháp đầy hứa hẹn Phân hủy tồn dư DDT trong đất bằng vi sinh vật là phương pháp ít phức tạp, có tính linh hoạt cao trong khâu sử dụng, nhắm đến mục tiêu xử lý tại chỗ, phù hợp ứng dụng tại Việt Nam Xuất phát từ những thực

tế trên, đề tài “Nghiên cứu chọn tạo bộ giống vi khuẩn phân hủy hiệu quả DDT nhằm phục vụ xử lý đất nông nghiệp ô nhiễm” được thực hiện với các mục tiêu sau:

- Phân lập, sàng lọc các chủng vi khuẩn, xạ khuẩn từ đất có khả năng phân giải hiệu quả DDT

- Định danh, nghiên cứu đặc điểm sinh học các chủng vi khuẩn, xạ khuẩn được chọn

- Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học có khả năng phân hủy DDT từ các chủng được chọn; thử nghiệm xử lý đất ô nhiễm DDT bằng chế phẩm sinh học quy mô phòng thì nghiệm

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tình hình ô nhiễm DDT

1.1.1 Giới thiệu chung

Trong vài thập kỷ qua, lượng lớn thuốc BVTV được đưa vào môi trường nhằm phục vụ công nghiệp, nông nghiệp Trong đó, DDT là một loại thuốc BVTV phổ biến, được sử dụng rộng rãi trên thế giới DDT là tên viết tắt của Dichloro-Diphenyl-Trichloroethane Hỗn hợp DDT kỹ thuật được sử dụng trong phòng trừ sâu có chứa khoảng 14 các đồng phân khác nhau của DDT, với thành phần chủ đạo (65-80%) là đồng phân p,p’-DDT [59] Không chỉ có vai trò trong việc diệt trừ sâu bệnh, DDT còn được ứng dụng trong điều trị y học nhằm kiểm soát các vector truyền bệnh do DDT có hiệu quả rõ rệt trong việc tiêu diệt muỗi và làm giảm số ca mắc sốt rét, đặc biệt là tại những nước đang phát triển [23] Tuy nhiên, đây là chất có tính bền vững, có tính độc, có khả năng tích lũy sinh học gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người Do đó, từ những năm 1970, nhiều quốc gia đã cấm sử dụng DDT trong nông nghiệp Theo Công ước Stockholm năm 2001, DDT bị cấm sử dụng cho mục đích nông nghiệp trên toàn thế giới và chỉ được sử dụng với mục đích kiểm soát việc lây lan của bệnh sốt rét [23]

Hình 1.1 (a) Đồng phân hóa học của DDT, (b) Cấu trúc hóa học của DDT [59]

Tính bền của DDT

DDT có cấu trúc là một phân tử ethane, trong đó một cac-bon được gắn thêm ba gốc chlorine và cac-bon còn lại được gắn hai nhóm p-chlorophenyl DDT có nhiệt độ nóng chảy từ 108,5-109oC, nhiệt độ hóa hơi từ 185-187oC, khối lượng riêng 1,55 g/cm3, khối lượng phân tử 345,5 đvC DDT có tính ưa béo cao, dễ tan trong dung môi hữu cơ nhưng ít tan trong nước Do độ hòa tan thấp trong nước, DDT có ái lực mạnh với các hạt lơ lửng trong nước, các hạt này có vai trò là nơi lưu trữ các hợp chất nhóm DDT, làm tăng tính ổn định của phân tử và tăng khả năng chống lại tác nhân gây phân hủy sinh học của chúng [77] Sau khi lắng xuống, DDT bị hấp thụ trong đất đá, trầm tích, điều đó khiến cho DDT cực kỳ bền vững trong môi trường Hai dạng đồng phân bền nhất của DDT là p,p’-DDT và o,p’-DDT có thời gian bán rã khoảng 4 đến 30

năm [59]

Độc tính của DDT

Đích tác động của DDT và các dẫn xuất của nó chủ yếu nhắm đến hệ thần kinh Độc tính của DDT thể hiện ở khả năng ngăn không cho kênh Na+ trên màng tế bào thần kinh đóng lại sau giai đoạn khử cực trong quá trình phát xung thần kinh, gây hiện tượng hưng phấn quá mức, có thể dẫn đến co giật và tử vong [37, 83] DDT không chỉ tiêu diệt sâu bệnh mà còn gây tác dụng phụ không mong muốn đến nhiều loài sinh vật khác, trong đó có con người và nhiều nhóm động vật như cá, lưỡng cư, chim, thú [65] DDT tích tụ trong mô mỡ của các sinh vật sống, từ đó DDT tích lũy sinh học theo chuỗi thức ăn theo hiệu ứng khuếch đại sinh học [35, 36] Các sinh vật dưới nước chủ yếu tiếp nhận DDT từ nước, trong khi nguồn phơi nhiễm ở các sinh vật trên cạn chủ yếu thông qua thức ăn [65]

Con người tiếp xúc với DDT theo nhiều con đường: từ nguồn thức ăn và do phơi nhiễm thông qua sự hấp thụ qua da hoặc qua hô hấp [59] Phơi nhiễm DDT ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người, phổ biến nhất là ảnh hưởng thần kinh và suy giảm miễn dịch DDT và các dẫn xuất của nó cũng được công nhận là hóa chất gây rối loạn nội tiết [34] Qua thời gian, ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy tác

động tiêu cực của việc phơi nhiễm DDT đến sức khỏe con người Từ lâu, nhiều nghiên cứu đã chứng minh ô nhiễm DDT và các chất chuyển hóa của nó ở nồng độ 50-250mg/kg có liên quan đến rối loạn nội tiết, ức chế hoạt động của enzyme acetylcholinase và tác động tiêu cực đến chu kỳ tế bào, có nguy cơ gây ung thư [33] Dựa trên dữ liệu từ 494 nghiên cứu trong khoảng thời gian 2003 - 2008, Eskenazi và các cộng sự tổng hợp được nhiều kết quả chỉ ra mối liên hệ giữa DDT và sức khỏe con người [40] Nhiều loại ung thư có liên quan đến ô nhiễm DDT ung thư gan và ung thư tụy đã được ghi nhận; bên cạnh đó, những bé gái phơi nhiễm DDT trước độ tuổi dậy thì cho thấy nguy cơ cao hơn phát triển ung thư vú sau này Tuy nhiên, cần thực hiện thêm nhiều nghiên cứu để làm sáng tỏ hơn bản chất ảnh hưởng của DDT tới sức khỏe con người

DDT và các chất chuyển hóa của nó cũng được nghiên cứu và cho thấy ảnh hưởng tiêu cực đến các loài cá, lưỡng cư cũng như động vật không xương sống trên cạn [65] Các chất chuyển hóa dính như DDD (1,1-dichloro-2,2-bis(p-chlorophenyl) ethane), DDE (1,1-dichloro- 2,2-bis(p-chlorophenyl) ethylene), DBP (4,4′-dichlorobenzophenone), DDMU (1-chloro-2-2-bis-(4′-chlorophenyl) ethylene) có độc tính cao với nhiều loại động vật có xương sống và không xương sống Chúng có độ bền cũng như độc tính cao hơn DDT [90] Tuy nhiên, tác động được biết đến nhiều nhất của DDT về mặt sinh thái học là làm giảm khả năng sinh sản ở các loài chim thông qua cơ chế làm mỏng vỏ trứng bởi DDE, từ đó khiến số lượng chim cắt Falco peregrinus trưởng thành đã giảm đến hơn 80% trong hai năm 1961 và 1962 ở Anh [69, 72]

Xem xét độc tính của các hợp chất nhóm DDT cũng như tồn dư lâu dài của chúng, việc xử lý DDT khỏi các khu vực ô nhiễm là một vấn đề cần ưu tiên nhằm cải tạo môi trường tự nhiên

Lịch sử sử dụng DDT

Khả năng diệt côn trùng của DDT được Paul Hermann Müller phát hiện vào năm 1939 Đây là loại thuốc BVTV tổng hợp đầu tiên được phát triển và sử dụng trên

toàn thế giới từ những năm 1940 [59] Trước khi những tác động tiêu cực của DDT được phát hiện, chất này đã được sử dụng rộng rãi nhằm diệt trừ sâu bệnh trong nông nghiệp cũng như kiểm soát sốt phát ban và sốt rét [59] Sau các chiến dịch phun DDT diện rộng, số ca sốt rét đã giảm rõ rệt, từ khoảng 400.000 ca vào năm 1946 xuống gần không ca vào năm 1950 [29] Chương trình Môi trường Liên Hợp Quốc (UNEP) ước tính mức tiêu thụ DDT trên toàn thế giới từ năm 1950-1963 khoảng 175.000 tấn/ năm; mức sử dụng cao nhất là 550.000 tấn/ năm vào năm 1970 sau đó giảm xuống 68.800 tấn/ năm trong khoảng thời gian từ 1971-1996; từ những năm 2000-2010, mức độ tiêu thụ giảm từ 19.677 xuống 4.822 tấn/ năm [59]

Năm 1962, cuốn sách Silent Spring của nhà hoạt động người Hoa Kỳ Rachel Carson được xuất bản, đề cập đến tác hại do phun thuốc BVTV đồng thời khẳng định DDT là nguyên nhân của bệnh ung thư và nguy hại đến sinh sản của chim do làm mỏng lớp vỏ trứng [23] Những miêu tả về ảnh hưởng của thuốc BVTV trong cuốn sách này đã tạo ra làn sóng phản đối kịch liệt của công chúng, từ đó thúc đẩy các phong trào bảo vệ môi trường và tẩy trừ việc sử dụng các chất BVTV, trong đó có DDT [23] Kể từ tháng 6 năm 1972, DDT bị EPA cấm sử dụng hoàn toàn trong nông nghiệp Trong Công ước Stockholm năm 2001, DDT được xếp vào phụ chương B: hạn chế sử dụng và chỉ được sử dụng với mục đích kiểm soát các vector truyền bệnh do DDT có hiệu quả rõ rệt trong việc tiêu diệt muỗi và làm giảm số ca mắc sốt rét, đặc biệt là tại những nước đang phát triển Việc tái sử dụng DDT ở Châu Á và Châu Phi nhằm kiểm soát bệnh sốt rét đã làm giảm ngay lập tức số ca bệnh từ 42.000 xuống dưới 2.100 ca trong 2 năm từ 2000 đến 2002 [59] Điều đó đã giải thích lý do DDT vẫn được sử dụng rộng rãi ở các nước đang phát triển ở Châu Á, trong đó có Việt Nam

Tại Việt Nam, DDT được sử dụng trong cả hai vai trò là ngăn chặn vector truyền bệnh và làm thuốc BVTV Tuy vậy, chỉ các số liệu về việc sử dụng DDT trong phòng chống sốt rét được ghi lại cụ thể Số liệu thống kê cho thấy, trong giai đoạn từ 1957 đến 1990, 24.042 tấn DDT đã được sử dụng nhằm phòng chống bệnh sốt rét [60] DDT được liệt kê vào danh mục thuốc BVTV cấm sử dụng trong nông nghiệp

theo quyết định số 23/BVTV-KHKT/QĐ ngày 20 tháng 1 năm 1992 của Bộ Nông nghiệp và Công nghiệp Thực phẩm Dù đã bị cấm sử dụng trong thời gian dài, do đặc tính bền vững của mình, dư lượng DDT vẫn được phát hiện ở nhiều vùng khác nhau, điều này ảnh hưởng nghiêm trọng tới môi trường đất nông nghiệp cũng như sức khỏe con người

1.1.2 Tình hình ô nhiễm DDT

Thực trạng ô nhiễm trên thế giới

Các số liệu thống kê gần đây và hoàn chỉnh nhất về tồn dư các thuốc BVTV trong đất được tổng hợp trong bài nhận xét của Tzanetou và Karasali [93] Năm 2011, một nghiên cứu được thực hiện ở đồng bằng Campanian ở nước Ý đã khảo sát 119 mẫu đất, kết quả cho thấy dư lượng DDT dao động từ 0,08 đến 1231μg/kg [71] Năm 2013, một nghiên cứu quy mô lớn được tiến hành ở Đức trên phạm vi cả nước, dư lượng DDT được phát hiện lên tới 4000μg/kg [15] Trong nghiên cứu của Silva và các cộng sự vào năm 2019, 317 mẫu đất từ 11 quốc gia Châu Âu đã được kiểm tra, p,p’-DDE, o-p’-DDD, p-p’-DDT được phát hiện với nồng độ cao nhất lần lượt là 310, 40, 10 μg/kg [82] Ở Châu Phi, nghiên cứu phân tích các địa điểm lưu trữ cũ ở Tanzania năm 2014 đã phát hiện nồng độ DDT tồn dư dao động từ 0,01 đến 250.000 μg/kg mặc dù các vùng đất này đã được xử lý trong 4 đến 15 năm [56] Ở Châu Á cũng có rất nhiều nghiên cứu về tình trạng tồn dư lượng lớn DDT trong đất Năm 2020, Yu và cộng sự đã tóm tắt kết quả gần 120 nghiên cứu với hơn 2000 mẫu đất trên khắp Trung Quốc, cho thấy nồng độ DDT trong các mẫu có thể lên đến 139 μg/ kg với p,p’-DDE, 57 μg/ kg p,p’-DDD, 505 μg/ kg o,p’-DDT, 488 μg/ kg p,p’-DDT [100] Một nghiên cứu khác cũng đã thống kê nồng độ p.p’-DDT trong khoảng 90 đến 5240 μg/kg ở các cánh đồng trồng lúa ở Malaysia vào năm 2018 [67] Ở Hoa Kỳ, đất ở Bang Texas, Hoa kỳ được báo cáo có chứ nồng độ DDE từ 1 đến 60ng/L; các khu vực trầm tích tại 18 địa điểm ở Thung lũng San Jouqiun, California thấy nồng độ DDT cao từ 1000 đến 2000 g/kg; nồng độ DDT ở Long Island, New York dao động từ 3,5 đến 4460 g/kg [54]

Ngoài ra, tồn dư DDT trong nước cũng được ghi nhận khắp nơi trên thế giới Ở Hoa kỳ, mẫu nước mặt được phát hiện ô nhiễm DDT ở mức trung bình là 1ng/L [39] Ở Trung Quốc, dicohol (chứa 25% DDT) đã được sử dụng trực tiếp ở Đồng bằng sông Châu Giang Nồng độ DDT dao động trong khoảng 1-250ng/L và nồng độ cao nhất vượt mức 250ng/L ở lưu vực Taihu [45] Ở Ấn Độ, DDT được sử dụng với nhiều mục đích với nồng độ dao động từ 3,18 ng/L ở sông Tighra đến 5.794mg/L ở sông Bhopol [57]

Hình 1.2 Vị trí các kho chứa DDT chính trên thế giới [59]

Như vậy, nhiều nghiên cứu đã cho thấy sự tồn tại của DDT và các chất chuyển hóa của nó ở các mẫu đất, trầm tích, nước với nồng độ tương đối cao Điều này phản ánh tình trạng ô nhiễm DDT tương đối nghiêm trọng ở các quốc gia trên thế giới

Thực trạng ô nhiễm tại Việt Nam

DDT được sử dụng lần đầu tiên tại Việt Nam vào năm 1949 với mục đích phòng ngừa bệnh sốt rét Tuy không có số lượng chính xác về lượng DDT được sử

dụng ở Việt Nam, nhưng các báo cáo cho thấy nó được sử dụng rộng rãi với nồng độ cao hơn các nước khác trong khu vực Tính đến tháng 6 năm 2015, trên địa bàn toàn quốc có 1562 điểm nghi ngờ tồn lưu chất bảo vệ thực vật, trong đó phần lớn là DDT với nồng độ ô nhiễm trong mẫu đất lên đến 268mg/kg, mẫu nước là 4µg/L [11] Nghệ An là một trong những địa phương chịu ảnh hưởng nặng nề bởi DDT với 52 điểm tồn dư gây ô nhiễm môi trường đã được phát hiện trên toàn tỉnh Nồng độ DDT dao động từ 3,38 đến 960,6 mg/kg trong mẫu đất và từ 0,00012 đến 0,00168 mg/L trong các mẫu nước Nồng độ DDT cao nhất ở Vịnh Hạ Long và Vịnh Hải Phòng được công bố vượt mức 100ng/g [3] Việc khảo sát số lượng lớn mẫu đất ở Việt Nam cho thấy mẫu đất nông nghiệp có tồn dư DDT lớn hơn so với mẫu đất trên vùng cao, điều này chứng minh mức độ sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp trước đây Trong tầm tích vùng châu thổ sông Cửu Long, nồng độ DDT cao nhất được thống kê từ các mẫu phân tích có thể lên đến 6,3ng/g [28] Khảo sát lượng DDT tồn dư trong trầm tích vào những năm 1990-2000 cho thấy TP HCM là một trong số những nơi ô nhiễm DDT nặng nề nhất ở Việt Nam [60] Trong không khí nền, kết quả quan trắc tại Tam Đảo cho thấy, tổng nồng độ của các loại DDT cao chỉ sau HCB Tuy nhiên, nồng độ DDT có chiều hướng giảm qua số liệu của các năm (82,40pg/m3 vào năm 2005; 64,97pg/m3 vào năm 2006 và 22,7pg/m3 vào năm 2010 [2]

Hình 1.3 Phân bố DDT trong trầm tích ở một số địa điểm tại Việt Nam [60]

Từ các báo cáo trên, nồng độ DDT trong môi trường không khí, nước, đất và trầm tích ở Việt Nam là tương đối cao, thể hiện sự ô nhiễm quy mô lớn của chất này Điều này ảnh hưởng nghiêm trọng tới môi trường cũng như sức khỏe con người Việt Nam đã và đang tích cực lọai trừ và cấm sử dụng các hóa chất POP (chất ô nhiễm khó phân hủy), đặc biệt là DDT và các chất chuyển hóa của nó Tuy nhiên, việc phòng ngừa, kiểm soát và tiếp tục nghiên cứu các phương pháp xử lý các tồn dư của thuốc BVTV tồn tại trong các môi trường là vẫn rất cần thiết

1.2 Các phương pháp xử lý ô nhiễm DDT

Trong nhiều năm qua, các nhà khoa học đã có nhiều nghiên cứu nhằm loại bỏ DDT khỏi đất bị ô nhiễm bằng các phương pháp vật lý, hóa học, sinh học hoặc kết hợp các phương pháp này với nhau

1.2.1 Các phương pháp xử lý thông thường

Có nhiều biện pháp khác nhau được nghiên cứu để tách chiết và xử lý dư lượng DDT ở khu vực ô nhiễm, bao gồm các phương pháp vật lý, hóa học như nhiệt phản hấp phụ ở nhiệt độ thấp, rửa giải DDT bởi chất hoạt động bề mặt và xử lý sulfuric acid [98] Nguyên lý chung của những phương pháp này là phân tách DDT dựa vào sự khác biệt trong tính chất vật lý hoặc hóa học của nó trong một số điều kiện nhất định Ngoài ra, các nhóm nghiên cứu đã công bố nhiều biện pháp nhằm phân giải DDT dựa vào tác nhân vật lý, hóa học như quang phân li, thủy phân, loại hydrochlorine hóa và điện phân [98] Do DDT đã là một chất có mức độ oxy hóa cao vì các gốc chlorine, phản ứng khử DDT thường được diễn ra nhiều hơn là các phản ứng oxy hóa Các phương pháp khác nhau xúc tác phản ứng chuyển đổi này bằng cách thay đổi các điều kiện môi trường như ánh sáng hay điện thế, hoặc sử dụng các chất hóa học để tham gia phản ứng hoặc xúc tác phản ứng

Ở Việt Nam, các công nghệ xử lý ô nhiễm DDT vẫn còn rất hạn chế, chủ yếu là dựa trên công nghệ hóa lý, ví dụ như: (i) quy trình xử lý nguồn ô nhiễm DDT bằng phương pháp cô lập sử dụng hệ phản ứng Fe-TAML/H2O tuần hoàn nhiều lần được

đề xuất bởi Chu Tuấn Linh, (ii) thử nghiệm vật liệu sắt nano của Nguyễn Xuân Huân xử lý DDT ở tỉnh Bắc Ninh, (iii) phương pháp nhiệt xúc tác của Trần Vân Anh, hay (iv) sử dụng Tween 80 để rửa giải sau đó dùng than hoạt tính và phản ứng oxy hóa nâng cao để xử lý DDT của Phạm Thị Mai Phương và cộng sự [1, 8, 9, 12]

Các phương pháp hóa lý, dù rất hiệu quả, vẫn để lại một số ảnh hưởng độc hại tới môi trường do không xử lý triệt để được DDT, cũng như không hiệu quả về mặt kinh tế, khó áp dụng để xử lý DDT với quy mô lớn Trong khi đó, các giải pháp sinh học để xử lý DDT tỏ ra thân thiện hơn với môi trường, hứa hẹn khả năng xử lý tại chỗ cũng như xử lý triệt để với chi phí hợp lý

1.2.2 Phương pháp xử lý sinh học bằng vi sinh vật

Các biện pháp xử lý sinh học DDT tại chỗ bằng vi sinh vật gồm hai nhóm chính là bổ sung các tác nhân nhằm kích thích quần thể vi sinh vật bản địa xử lý DDT hoặc bổ sung vi sinh vật có khả năng phân giải DDT vào các địa điểm ô nhiễm Trong phương pháp này, thực vật cũng có thể đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra môi trường rễ giúp các vi sinh vật có thể phát triển hiệu quả và tiết ra một số chất hoặc enzyme để hỗ trợ cho quá trình chuyển hóa của vi sinh vật [30] Ngoài ra, việc bổ sung nguồn dinh dưỡng, ví dụ các nguồn cac-bon như phenol, hexane, toluene giúp kích thích quần thể vi sinh vật bản địa phân giải hiệu quả DDT [66] Việc bổ sung các chất cho điện tử như lactate, acetate cũng cho thấy hiệu quả tích cực tăng cường khả năng xử lý DDT của vi sinh vật [59] Vi sinh vật có thể phân giải DDT theo hai cơ chế là trực tiếp - trực tiếp chuyển hóa DDT thành các sản phẩm khác ít độ hơn, hoặc gián tiếp - thay đổi các điều kiện môi trường khiến DDT dễ bị biến đổi hơn Các vi sinh vật phân giải được DDT là các vi sinh vật có khả năng tận dụng chất này như là nguồn cac-bon hoặc chất nhận electron Tuy nhiên, khả năng tiếp cận của vi sinh vật tới các chất kỵ nước như DDT là một trở ngại lớn ảnh hưởng đến khả năng xử lý sinh học DDT Vì vậy, việc sử sụng vi sinh vật và bổ sung các chất hoạt động bề mặt có nguồn gốc sinh học như tween 20, tween 80, rhamnolipids cũng giúp gia tăng đáng kể khả năng phân giải DDT của vi sinh vật [59]

So sánh với các phương pháp vật lý, hóa học nhằm tách chiết và phân giải DDT, phân giải sinh học DDT có một số những ưu thế nổi bật với khả năng xử lý ô nhiễm DDT tại chỗ mà vẫn thân viện với môi trường dù cho có nhược điểm là thời gian xử lý dài hơn Mặt khác, việc sử dụng vi sinh vật cũng đem lại tính linh động cao cho phương pháp do vi sinh vật có thể thích ứng với nhiều điều kiện môi trường khác nhau Đồng thời, vi sinh vật không chỉ xử lý DDT mà còn có thể đồng thời xử lý tồn dư các chất độc hại khác có cấu trúc tương tự DDT trong khu vực ô nhiễm Với những lợi thế kể trên, phân giải bằng vi sinh vật hiện đang là một chiến lược được ưa chuộng trong việc xử lý chất ô nhiễm nói chung và DDT nói riêng

1.3 Phân hủy DDT bởi vi sinh vật 1.3.1 Tổng quan về phân lập vi sinh vật phân giải DDT

Khả năng phân hủy DDT của vi sinh vật, được đánh giá dựa trên việc kết hợp các phương pháp phân lập, sàng lọc, phân tích con đường phân giải DDT qua chú thích bộ gene kết hợp phân tích sắc ký khối phổ Phương pháp chủ yếu được sử dụng để phân lập vi sinh vật phân hủy DDT là làm giàu vi sinh vật thông qua pha loãng [68] Trong quá trình này, vi sinh vật dần thích nghi với các điều kiện sinh trưởng nghèo nàn, chỉ có các chủng thích nghi được mới tiếp tục sinh trưởng Qua đó, các chủng có tiềm năng phân hủy DDT được chọn lọc và phân lập

Theo Pan và cộng sự, nhóm nghiên cứu đã phân lập và sàng lọc được chủng

Stenotrophomonas sp DDT-1 bằng cách sử dụng môi trường muối tối thiểu MSM bổ

sung nguồn cac-bon duy nhất là DDT để tiến hành phân lập các chủng tiềm năng Vi sinh vật trong mẫu đất được làm giàu thông qua pha loãng với nồng độ DDT bổ sung tăng dần từ 1mg/ L đến 10mg/L, các khuẩn lạc thu được sau mỗi lần pha loãng được tinh sạch và tiếp tục nghiên cứu [68] Phương pháp tương tự được tiến hành bởi Wang

và cộng sự năm 2023, chủng Arthrobacter globiformis DC-1 được phân lập từ mẫu

đất nông nghiệp ô nhiễm DDT [95] Quá trình làm giàu được tiến hành lặp lại qua 5 lần pha loãng trong môi trường muối tối thiểu MSM bổ sung nồng độ DDT tăng dần

từ 100mg/L đến 500mg/L Các khuẩn lạc phân lập được kiểm tra khả năng phân hủy DDT sau đó bằng phân tích sắc ký khối phổ Theo một cách tiếp cận hơi khác,

Kamanavalli và cộng sự phân lập chủng Pseudomonas sp có khả năng phân hủy DDT

[51] Vi sinh vật được phân lập từ đất ô nhiễm DDT bằng phương pháp làm giàu trong môi trường muối khoáng có chứa biphenyl Vi sinh vật có khả năng phân hủy DDT được nuôi trên môi trường yeast extract - peptone - glucose và được sàng lọc bằng phương pháp phun phủ 1% DDT hòa tan trong ether Các chủng phân hủy DDT sẽ tạo vòng hoạt tính màu vàng, đây có thể là sản phẩm của sự phân cắt vòng meta tạo 2,3-dihydroxy-DDT

Xạ khuẩn có khả năng phân hủy DDT cũng có thể được phân lập theo cách tương tự như trên, nhưng thường kết hợp với phương pháp làm giàu Theo Wang và cộng sự, xạ khuẩn được làm giàu trong hỗn hợp mô hình 6g đất và than củi, 200mL môi trường yeast mineral salt medium YMM chứa 20mg/L DDT được bổ sung định

kỳ mỗi tuần trong 7 tuần liên tiếp [94] Sau đó, chủng Streptomyces sp D3 có khả

năng phân hủy DDT được phân lập từ mảnh than trong mô hình thí nghiệm bằng phương pháp cấy trải pha loãng

Ngoài ra, có một hướng dễ tiếp cận hơn để sàng lọc các chủng có khả năng phân hủy DDT dựa vào phương pháp đo nồng độ chloride tự do trong môi trường nuôi cấy theo phương pháp của Bergman và cộng sự [18] Chlorine sẽ thay thế thicyanate trong mercury thiocyanate, thiocyanate sẽ phản ứng với sắt và tạo thành hỗn hợp iron-thiocyanate màu cam và hấp thụ tối đa ở bước sóng 460nm Khi phân hủy DDT, một bước tất yếu là vi sinh vật phải loại bỏ gốc chlorine, giải phóng ở dạng ion Cl- tự do trong môi trường nuôi cấy Vì vậy đây là phương pháp nhanh chóng xác định các chủng có khả năng phân hủy DDT

Sau khi xác định được các chủng sơ bộ, khả năng phân hủy DDT của các chủng được xác định chính xác qua phân tích sắc ký khối phổ Dư lượng DDT còn lại trong môi trường theo các mốc thời gian xác định được tính toán, quy đổi thành hiệu quả phân giải Đồng thời, bằng việc sử dụng khối phổ, các hợp chất chuyển hóa trong quá

trình phân hủy DDT được xác định, từ đó phản ánh con đường phân hủy sinh học DDT Ngoài ra, bằng việc kết hợp phân tích bộ gene vi sinh vật, các con đường phân giải DDT được dự đoán với độ chính xác cao hơn

1.3.2 Một số nhóm vi sinh vật phân giải DDT

Các nghiên cứu cho thấy, các đại diện vi khuẩn phân hủy DDT điển hình là

Alcaligenes eutrophus, nhóm vi khuẩn Bacillus, nhóm vi khuẩn Pseudomonas, một số Sphingobacterium, hay Stenotrophomonas với hiệu quả phân giải DDT lên tới 99%

[59]

Từ những năm 1978, Pseudomonas aeruginosa 640X đã được nghiên cứu có

khả năng phân hủy hoàn toàn DDT [85] Năm 2005, Santacruz và cộng sự đã có

nghiên cứu về khả năng phân hủy sinh học DDT của Pseudomonas fluorescens, chủng

có thể phân giải 55-99% từ nồng độ DDT ban đầu là 150mg/L trong thời gian ngắn khi được cố định trên vật liệu rẻ tiền là tezontle theo con đường chuyển hóa hiếu khí tạo ra các chất trung gian dạng chlorophenol [78]

Năm 2007, Barragán-Huerta đã phân lập được 5 chủng vi khuẩn từ hạt cà phê,

trong đó Stenotrophomonas maltophilia có khả năng xử lý hoàn toàn 15ppm DDT

trong môi trường muối khoáng, tuy nhiên bị ức chế ở nồng độ 50ppm [17] Gần đây,

năm 2016, chủng Stenotrophomonas sp DDT-1 được công bố lại có khả năng phân

giải DDT theo cách khử Chlorin trước rồi sau đó hydroxyl hóa và carboxyl hóa trước khi khoáng hóa hoàn toàn, cũng đạt hiệu suất phân giải hơn 90% sau 82 ngày [68] Đầu năm 2022, nghiên cứu thực địa quá trình xử lý sinh học bằng sử dụng chủng

Stenotrophomonas sp DXZ9 cho thấy hiệu quả xử lý DDT là 81%, DDE là 55% [99] Alcaligenes eutrophus (Ralstonia eutropha) A5 phân giải hơn 99% DDT trong 45

ngày, sản phẩm cuối cùng tạo ra axit 4-chlorobenzoic [61] Năm 2019, Mansouri và

cộng sự phân lập được chủng Cupriavidus metallidurans (Ralstonia metallidurans) LBJ và Pseudomonas stutzeri LBR có khả năng phân hủy lần lượt 79% và 87% lượng

DDT từ nồng độ ban đầu 10mg/L trong 30 ngày Khi thiết lập các tổ hợp với từ trường

sinh học, khả năng phân hủy DDT của hai chủng này đạt đến lần lượt 90% và 98% sau 30 ngày [58]

Bên cạnh vi khuẩn, nhiều vi nấm cũng có khả năng phân giải DDT, ví dụ như nấm mục trắng và nấm mục nâu Một số loại nấm mục trắng đã cho thấy khả năng

phân giải DDT như Boletus edulis, Gomphidius viscidus, Laccaria bicolor, Leccinum scabrum, Arbuscular mycorrhizal, và Phanerochaete chrysosporium [59]

Ở Việt Nam, tính đến nay chỉ có các công bố của Đặng Thị Cẩm Hà và công sự về chủng nấm FNA1 có khả năng xử lý hơn 92% hỗn hợp DDT, DDE từ nồng độ 200ppm sau 7 ngày nuôi cấy, chủng FNA4 phân hủy 94,48% hỗn hợp trên sau 14 ngày nuôi cấy Các chủng nấm sợi này được phân lập từ đất ô nhiễm hỗn hợp thuốc

BVTV tại Nghệ An, và đều được xếp vào chi Aspergillus [4] Tuy nhiên, hiện vẫn

chưa có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn phân giải DDT ở Việt Nam

1.3.3 Con đường phân hủy sinh học DDT bởi vi sinh vật

Phân hủy sinh học dựa trên việc sử dụng nhóm vi sinh vật như vi khuẩn, nấm để phân giải chất ô nhiễm tạo ra các sản phẩm cuối cùng thân thiện với môi trường trong điều kiện hiếu khí hoặc kị khí Việc loại bỏ nguyên tử chlorine ra khỏi cấu trúc phân tử là một bước quan trọng trong phân giải DDT, việc này có thể xảy ra tự phát do cấu trúc phân tử không bền hoặc diễn ra nhờ sự xúc tác bởi các enzyme đặc trưng [59] Các con đường phân giải DDT được thể hiện trong Hình 1.4

Phân hủy sinh học hiếu khí là sự phân hủy các hợp chất hữu cơ ô nhiễm bởi vi sinh vật trong điều kiện có oxy Vi sinh vật sử dụng oxy làm chất nhận điện tử để tạo ra năng lượng Cụ thể, oxy được sử dụng để oxy hóa cac-bon trong chất ô nhiễm một

phần hoặc hoàn toàn R eutropha A5 được Nadeau chứng minh rằng có khả năng phân hủy DDT trong điều kiện hiếu khí [61] Bước đầu tiên trong con đường này là oxy hóa DDT ở vị trí ortho và meta tạo chất trung gian 2,3-dihydrodiol-DDT Sản phẩm này sau đó sẽ được tiếp tục phân giải thành 2,3- dihydoxy-DDT bởi một enzyme dehydrogenase 2,3-dihydroxy-DDT trải qua phản ứng cắt mở vòng meta và cuối cùng sẽ được dị hóa thành 4-chlorobenzoate (4-CBA), sản phẩm cuối cùng trong con

đường phân giải của R eutropha A5 Một nghiên cứu khác cho thấy, một chủng Pseudomonas sp cũng có khả năng phân hủy DDT thành 4-CBA thông qua con

đường tương tự [51]

Hình 1.4 Tổng hợp các con đường phân giải DDT bởi vi sinh vật đã biết [59] DDT 1,1,1-dichlorodiphenyl trichloroethane; DDE 1,1-dichloro-2,2-bis(p-

chlorophenyl) ethylene; DDD 1,1-dichloro 2,2-bis(p-chlorophenyl) ethane; DDMU

1-chloro-2-2-bis-(4′-chlorophenyl) ethylene; DDMS

1-chloro-2,2-bis(4′-chlorophenyl) ethane; DDNU 1,1-bis(4-1-chloro-2,2-bis(4′-chlorophenyl) ethylene; DDOH 2,2-bis (4′- chlorophenyl) ethanol; DDA 2,2-bis(p-chlorophenyl) acetate; DBP 4,4′-

dichlorobenzophenone; DDM bis(4′-chlorophenyl) methane 1 Proteus vulgaris, 2 Klebsiella pneumoniae, 3 Ralstonia eutropha A5, 4 Pseudomonas acidovorans M3GY, 5 Aeromonas hydrophila, 6 Pseudomonas putida, 7 Bacillus sp., 8 Chryseobacterium sp PYR2

Phân hủy sinh học kị khí là sự phân hủy các hợp chất hữu cơ ô nhiễm bởi vi sinh vật trong điều kiện không có oxy Vi sinh vật sử dụng một chất khác ngoài oxy làm chất nhận điện tử; trong một số trường hợp, bản thân chất ô nhiễm có thể đóng

vai trò chất nhận điện tử [92] Khả năng phân hủy DDT trong điều kiện kị khí được biết đến chủ yếu là quá trình khử loại chloride Phản ứng diễn ra bởi sự khử gốc chlorin mạch thẳng và thay bằng nguyên tử hydro Con đường phân giải DDT trong điều kiện kị khí có thể được hiểu rõ hơn qua nghiên cứu về khả năng phân giải DDT

ở Aeromonas hydrophila HS01 Sau khi hình thành DDD, sản phẩm này sẽ được tiếp

tục bị loại chloride theo kiểu khử để tạo nên DDMS; tương tự, DDMS sẽ được chuyển thành DDNS DDMS và DDNS sau đó trải qua các phản ứng oxy hóa để tạo nên DDOH và DBP DDOH và DBP không được quan sát thấy biến đổi tiếp trong điều kiện kị khí [27] Tuy nhiên, con đường trao đổi hiếu khí và kị khí phân hủy DDT của vi sinh vật có những sản phẩm trùng lặp với nhau, điều này cho thấy hai con đường phân giải này có mối liên hệ thống nhất

1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân hủy DDT của vi sinh vật

Sự phân hủy DDT của vi sinh vật liên quan mật thiết đến đặc điểm của từng loài, các yếu tố môi trường, các yếu tố tự nhiên có ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật cũng như khả năng sinh enzyme phân giải DDT Vì vậy, việc xác định các loài có khả năng phân hủy DDT, cũng như các yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH, nồng độ DDT ảnh hưởng trực tiếp, đóng vai trò quan trọng trong quá trình xử lý DDT và các chất chuyển hóa của nó

Định danh các chủng vi sinh vật

Trên thế giới, nhiều nghiên cứu về các loài vi sinh vật phân giải DDT đã được công bố [59] Vì vậy, việc xác định các chủng thuộc các loài có khả năng phân hủy DDT là một yếu tố quan trọng Cho đến nay, việc định danh các chủng vi khuẩn trong sinh học chủ yếu dựa trên trình tự gen 16S rRNA, tuy nhiên khả năng xác định bị giới hạn đến cấp độ chi [42] Do đó, việc kết hợp phân tích gen đặc trưng có thể được sử dụng để xác định chính xác vi khuẩn ở cấp độ loài [42] Theo công bố của Girard và

cộng sự năm 2020, việc định danh các loài thuộc chi Pseudomonas chủ yếu dựa vào gen rpoD với giá trị ngưỡng giới hạn (cut-off value) trên 98% [42] Đối với chi Stenotrophomonas, nghiên cứu của Svensson-Stadler và cộng sự năm 2021 đã công

bố các loài thuộc chi này được định danh chủ yếu dựa vào phân tích gen gyrB với

ngưỡng giới hạn khoảng 93% [89] Ryan và cộng sự năm 2011 đã nghiên cứu và phát

hiện gen hisKA chỉ có ở Cupriavidus metallicidurans và thậm chí không được phát hiện trong số 148 chủng có liên quan chặt chẽ thuộc Cupriavidus campinensis, Cupriavidus eutrophus, Cupriavidus respiraculi, Ralstonia insidiosa, Ralstonia pickettii, Ralstonia solanacearum… [75] Tương tự với việc định danh các chủng vi

khuẩn, gen 16S rRNA thường chỉ định danh xạ khuẩn ở cấp độ chi [80] Theo Sharma và cộng sự năm 2014, cách tiếp cận cổ điển để phân loại xạ khuẩn đến loài dựa trên việc kết hợp phân tích gen 16S rRNA và phân tích các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, chuỗi bào tử và các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng xạ khuẩn [80]

Nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng quan trọng đến sự sống sót của vi sinh vật Nhiệt độ thấp có thể ức chế hoạt động trao đổi chất và enzyme của vi sinh vật, trong khi nhiệt độ cao có thể gây bất hoạt protein ở vi sinh vật Nghiên cứu của Pan và cộng sự năm

2016 cho thấy, Stenotrophomonas sp DDT-1 có tốc độ phân giải DDT tốt nhất ở

35oC, đây là ngưỡng tối ưu cho hoạt động phân giải DDT của chủng vi khuẩn này [68] Trong nghiên cứu gần đây, năm 2023, Wang và cộng sự đã khảo sát khả năng

phân hủy DDT của chủng Arthrobacter globiformis DC-1, kết quả cho thấy chủng

này có ngưỡng phân hủy sinh học DDT tốt trong khoảng 25 đến 35oC, tốt nhất ở 30oC, giảm mạnh ở 20oC và 40oC [95] Các kết quả này cho thấy, 25oC-35oC là ngưỡng nhiệt độ phù hợp để vi khuẩn sinh trưởng tốt và phân giải DDT hiệu quả

Độ pH

Các nghiên cứu đã cho thấy pH là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự phân hủy DDT của vi sinh vật, vi khuẩn phân hủy DDT tốt nhất trong

điều kiện pH trung tính Stenotrophomonas sp DDT-1 có tốc độ phân giải DDT tốt

ở pH5, 7, 9 [68] Kết quả phân tích thống kê cho thấy thời gian phân hủy DDT ở pH7 nhanh hơn ở pH5, 9; điều đó cho thấy DDT-1 có khả năng phân giải DDT tốt nhất trong điều kiện pH trung tính Kết quả này cũng khá tương đồng với nghiên cứu của

Wang, A globiformis DC-1 phân hủy DDT tốt nhất ở pH7,5; chủng có khả năng

chống chịu và phân hủy DDT ở môi trường kiềm tốt hơn trong môi trường acid [95]

Nồng độ chất ô nhiễm

Nồng độ DDT cao hoặc thấp sẽ có khả năng thúc đẩy hoặc ức chế quá tình phân giải DDT của vi sinh vật Hầu hết vi khuẩn đã được nghiên cứu có thể phân giải DDT ở nồng độ thấp và ức chế ở nồng độ DDT khoảng 30ppm Năm 2016, Pan và

công sự đã nghiên cứu về ảnh hưởng của nồng độ DDT đến Stenotrophomonas sp DDT-1 và công bố một số kết quả thú vị [68] Cụ thể, sau 21 ngày, Stenotrophomonas

sp DDT-1 có tốc độ phân hủy DDT ở ba nồng độ 0,1; 1; và 10mg/L lần lượt là 0,004; 0,038; 0,086 mg/L/ ngày Như vậy, tốc độ phân hủy DDT tăng gần như tuyến tính khi tăng nồng độ cơ chất (r=0,94), đạt cực đại ở ngưỡng bổ sung DDT 10mg/L Một

kết quả tương tự được quan sát bởi Wang và cộng sự, A globiformis DC-1 phân hủy

DDT tăng dần đạt tối đa ở 10mg/L, tuy nhiên việc tăng nồng độ DDT lên 20, 30mg/L đã ức chế DC-1 và làm giảm tốc độ phân hủy DDT của chủng này [95]

Độ ẩm

Độ ẩm là một yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến sự sống của vi sinh vật Mọi loại vi sinh vật đều sinh trưởng trong một giới hạn độ ẩm nhất định, từ đó ảnh hưởng đến khả năng phân giải DDT của vi sinh vật Trong thí nghiệm của Bumpus và cộng

sự, Phanerochaete chrysosporium đã được sử dụng để hỗ trợ quá trình khoáng hóa

DDT Ảnh hưởng của độ ẩm được xác định bằng cách thay đổi độ ẩm 20, 40, 50, 80 và 90%, các kết quả cho thấy rằng độ ẩm khoảng 40% là tối ưu [24] Trong một nghiên cứu khác, Boul đã phát hiện dư lượng DDT giảm mạnh hơn trong các cánh đồng có tưới nước so với các cánh đồng không được tưới nước [22] Sự tụt giảm DDT này có thể do sự gia tăng độ ẩm trung bình của đất, tuy nhiên, thời gian để tạo ra sự khác biệt về dư lượng DDT lên đến 30 năm [22]

Nguồn cac-bon bổ sung

Việc bổ sung các nguồn cac-bon khác nhau ảnh hưởng đến sự phân hủy sinh học DDT và phát triển của vi sinh vật Đơn cử, trong nghiên cứu của Wang và cộng

sự năm 2023, tốc độ phân hủy DDT của A globiformis DC-1 đạt gần 80% sau 24 giờ

ở mẫu không bổ sung nguồn cac-bon [95] Sau khi bổ sung glucose, sucrose và

fructose, sự phân hủy sinh học DDT của A globiformis DC-1 bị ức chế đáng kể, tốc

độ phân giải chỉ đạt 50,6 - 63,9% Tác giả đã đặt giả thiết chủng DC-1 ưu tiên sử dụng các nguồn cac-bon dễ chuyển hóa như glucose, sucrose hoặc fructose để phát triển nên ảnh hưởng đến tốc độ phân hủy DDT Hiệu quả phân hủy của việc bổ sung cao nấm men tương tự như mẫu đối chứng không có nguồn cac-bon bổ sung, trong khi sự

có mặt đồng thời của peptone được coi là nguồn cac-bon phù hợp nhất cho A globiformis DC-1 và tốc độ phân hủy của DDT đạt tới 84,2% [95] Từ đó có thể thấy,

việc bổ sung các nguồn cac-bon thích hợp hỗ trợ tốt quá trình phân giải DDT của vi khuẩn

Các nguồn dinh dưỡng khác

Ngoài các yếu tố chính như nhiệt độ, pH, nồng độ chất ô nhiễm, các yếu tố dinh dưỡng khác như nguồn ni-tơ, phosphorus hay các yếu tố vi lượng cũng ảnh hưởng đến quá trình phân hủy DDT của vi sinh vật Trong nghiên cứu của Sun và cộng sự năm 2015, việc bổ sung các chất này từ nguồn vô cơ NH4Cl và KH2PO4 cũng làm tăng hiệu quả xử lý DDT lên 85,4% [88] Trong một nghiên cứu khác, việc bổ sung các nguyên tố vi lượng như (NH4)2SO4, MgSO4, KH2PO4, KH2PO4, CaCl2, NaCl, MnSO4, FeSO4 cũng giúp hỗ trợ phân hủy DDT lên đến 80% sau 18 ngày [74]

1.4 Chế phẩm sinh học xử lý ô nhiễm DDT trong đất

1.4.1 Chế phẩm sinh học phân hủy thuốc BVTV

Chế phẩm sinh học xử lý ô nhiễm thuốc BVTV sử dụng vi sinh vật đã được kiểm chứng về hoạt tính hoặc được phân lập từ chính các nguồn ô nhiễm để phân hủy thuốc BVTV Vi sinh vật sử dụng thuốc BVTV làm nguồn năng lượng chính hoặc tổng hợp các enzyme phân hủy chất ô nhiễm thành các hợp chất đơn giản và có độc

tính ít hơn [32] Kết quả lý tưởng nhất là sự khoáng hóa, phân hủy hoàn toàn thuốc BVTV thành H2O và CO2 mà không tích tụ các chất trung gian độc hại [50] Các sản phẩm phân hủy có độ an toàn cao, mang tính bền vững (không độc hại, thân thiện đối với sức khỏe con người, hệ sinh thái và không ảnh hưởng xấu đến hệ vi sinh vật đất) là một lựa chọn hiệu quả và rẻ tiền để xử lý ô nhiễm thuốc BVTV Hiệu quả phân hủy thuốc BVTV bằng chế phẩm sinh học phụ thuộc nhiều yếu tố, cụ thể như trình bày dưới đây

Quần thể vi sinh vật

Tốc độ phân hủy chất ô nhiễm phụ thuộc vào sự có mặt của vi khuẩn trong khu vực bị ô nhiễm, thông thường là vi sinh vật tại chỗ Khả năng phân hủy sinh học bị ảnh hưởng bởi mật độ vi sinh vật, sự tương tác giữa các vi sinh vật và sự phân bố của chúng Khả năng sản xuất enzyme của vi sinh vật cũng ảnh hưởng trực tiếp đến tốc độ phân hủy của thuốc BVTV ở các khu vực bị ô nhiễm [73]

Đặc điểm hóa học của thuốc BVTV

Tốc độ phân hủy sinh học phục thuộc vào thành phần của từng loại thuốc BVTV vì mỗi loại thuốc BVTV có tính chất vật lý, hóa học khác nhau Khả năng xử lý thuốc BVTV phụ thuộc vào cấu trúc, trọng lượng phân tử cũng như nhóm chất hóa học Chất trừ sâu có có cấu trúc phức tạp sẽ khó bị phân hủy sinh học hơn, ví dụ như DDT, DDD, DDE [73]

Yếu tố môi trường

Các yếu tố khác nhau như pH, độ ẩm, nhiệt độ, tính chất của đất, nguồn dinh dưỡng được xây dựng để xử lý thuốc BVTV trong các điều kiện khác nhau Vi sinh vật cần những điều kiện sinh trưởng, tồn tại và hoạt động trao đổi chất khác nhau Ở nhiệt độ thấp, sự phân hủy diễn ra chậm, tốc độ hoạt động của vi sinh vật tăng lên theo nhiệt độ cho đến giá trị tối ưu thì hoạt động sẽ dừng lại Đồng thời, cung cấp đủ nước, đủ độ ẩm giúp tăng cường hoạt động của vi sinh vật Sự tăng sinh của vi sinh vật cũng phụ thuộc vào môi trường có tính acid hay tính kiềm [73] Việc tăng tính

khả dụng sinh học của chế phẩm bằng cách bổ sung chất hoạt động bề mặt tự nhiên nhằm giúp vi sinh vật dễ tiếp cận chất ô nhiễm cũng là một yếu tố rất quan trọng

1.4.2 Tình hình nghiên cứu chế phẩm xử lý tồn dư DDT

Năm 2010, Yuechun và các cộng sự đã sử dụng chế phẩm dịch chiết xuất enzyme laccase từ nấm mục trắng để xử lý sinh học đất nhiễm DDT và đạt hiệu suất phân giải 69% sau 25 ngày [101] Việc kết hợp nhiều chủng vi sinh vật cũng thể hiện khả năng xử lý đất ô nhiễm DDT hiệu quả trong thực tế, thể hiện qua tác hiệu quả phân giải đến 65% của một số chế phẩm sử dụng hỗn hợp chủng như Daramend® và BioSite® [59] Năm 2003, Sasek và các cộng sự đã dùng hỗn hợp chủng Xenorem® để ủ phân trộn lên đất ô nhiễm DDT ở sông Savannah, kết quả thu được hiệu quả phân giải lên đến 95% [79] Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu chế phẩm sinh học phân hủy DDT vẫn còn hạn chế, điều này mở ra một hướng nghiên cứu triển vọng nhằm sản xuất chế phẩm xử lý hiệu quả ô nhiễm DDT tồn dư trong đất

1.4.3 Quy trình sản xuất chế phẩm sinh học

Việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học vi sinh vật nhằm xử lý ô nhiễm tồn dư thuốc BVTV trong đất là một hướng đi mới, hứa hẹn khả năng xử lý tại chỗ cũng như xử lý triệt để chất ô nhiễm với chi phí hợp lý Vì vậy, xây dựng được quy trình sản xuất chế phẩm sinh học là rất quan trọng trong quá trình đưa nghiên cứu từ phòng thí nghiệm đến áp dụng trong thực tế

1.4.3.1 Quy trình lên men thu sinh khối vi khuẩn

Công nghệ lên men là hệ thống quy trình nhằm định hướng quá trình nuôi vi sinh vật để sản xuất chế phẩm vi sinh đáp ứng các chỉ tiêu chất lượng cũng như hiệu quả kinh tế Trong đó, các khâu lên men vi sinh vật, thu hồi sinh khối, bảo quản và hoàn thiện chế phẩm là rất quan trọng trong quy trình sản xuất chế phẩm sinh học Lên men được hiểu là quá trình chuyển hóa cơ chất của vi sinh vật, từ đó phát triển sinh khối và tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất có hoạt tính sinh học [64] Do đây

là một bước quan trọng, trong nghiên cứu nhằm sản xuất chế phẩm sinh học, cần đánh giá ảnh hưởng của nhiều yếu tố đến quy trình lên men vi khuẩn

Hiệu suất sản xuất

Hiệu suất lên men ảnh hưởng trực tiếp đến chi phí sản xuất vì nó quyết định lượng nguyên liệu thô, chi phí vận hành cần thiết để sản thu sản phẩm Do vậy, việc phân tích, tính toán các yếu tố thiết yếu là vấn đề quan trọng hàng đầu

Nguồn cac-bon

Nguồn cac-bon cần được xác định ngay từ giai đoạn đầu của quá trình lên men vì nó ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi sinh vật, qua đó ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất sản xuất sản phẩm Chất thải thực phẩm như rỉ đường hoặc chất thải chăn nuôi được coi là nguồn cơ chất dạng thô ít tốn kém, có nguồn cung dồi dào đồng thời đáp ứng được nhu cầu dinh dưỡng cho vi sinh vật [53]

Môi trường lên men

Sau khi lựa chọn nguồn cac-bon thích hợp, môi trường lên men cần được lựa chọn sao cho phù hợp bởi nó liên quan trực tiếp đến hiệu suất lên men cũng như quá trình thu hồi sản phẩm Tuy nhiên, việc tối ưu môi trường lên men là một thách thức bởi tính phức tạp trong của trình trao đổi chất của vi sinh vật cần sản xuất [53] Vì vậy, việc bổ sung các nguồn ni-tơ, phosphorus, sulfur, chất phụ gia cũng cần được tính toán cẩn thận

Chế độ lên men

Chế độ lên men dựa trên sản phẩm và vi sinh vật sản xuất; từ đó, việc lựa chọn tiến hành lên men theo mẻ hoặc lên men liên tục cần được thay đổi linh hoạt [53] Trong công nghiệp, lên men theo mẻ dễ dàng vận hành hơn các phương thức khác bởi đây là hệ thống khép kín, dịch lên men được thu hoạch khi quá trình lên men kết thúc, đó đó hạn chế được nguy cơ lây nhiễm Khi thiết lập chế độ lên men khác nhau, các thông số lên men như mức oxy hòa tan DO, nhiệt độ, pH, tốc độ khuấy cũng cần phải tối ưu

Mở rộng quy mô lên men

Sau khi thiết lập quy trình lên men ở quy mô phòng thí nghiệm, các nghiên cứu mở rộng quy mô được thực hiện bằng cách sử dụng các nồi lên men lớn hơn, tuy nhiên sẽ có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất lên men trong quá trình này Dòng chất lỏng trong nồi lên men ở quy mô lớn khác với mô hình nhỏ hơn, và dó đó có thể gây ra sự chênh lệch chất dinh dưỡng, từ đó ảnh hưởng đến hiệu suất lên men [53] Vì vậy, cần có nhiều nghiên cứu các mô hình lên men nhằm giảm thiểu chi phí liên

quan đến quá trình lên men ở quy mô lớn

1.4.3.2 Thu hồi và bảo quản sinh khối vi khuẩn sau lên men

Việc thu nhận sinh khối vi khuẩn sau lên men với hiệu suất cao có ý nghĩa quyết định đối với tính kinh tế của một phương pháp thu hồi Thu hồi sản phẩm sau lên men thường bắt đầu bằng cách tách sinh khối vi sinh vật khỏi dịch nuôi bằng phương pháp như ly tâm, lọc… Việc thu hồi sản phẩm lên men rất phức tạp, mỗi loại hình yêu cầu những phương pháp tách, tinh sạch sản phẩm riêng biệt Tùy vào vi sinh vật lên men sẽ phù hợp với các phương pháp thu hồi khác nhau Ví dụ, trong nghiên cứu của của Prabakaran và Hoti, các tác giả kết luận rằng phương pháp lọc có hiệu

suất cao hơn so với phương pháp ly tâm, sinh khối Bacillus thuringiensis thu được từ

phương pháp lọc là 53.3 g/L so với ly tâm là 39,0 g/L [70] Vì vậy, việc lựa chọn phương pháp thu hồi sinh khối hiệu quả và kinh tế là vấn đề rất quan trọng

Việc sử dụng chất mang để bảo quản sinh khối vi sinh vật là quá trình quan trọng Theo Smith (1992), hai đặc tính cần thiết ở chất mang phải là hỗ trợ sự phát triển của vi sinh vật và duy trì các quần thể vi sinh trong chế phẩm trong một khoảng thời gian mong muốn Để đạt được những mục tiêu này, chất mang phải có khả năng giữ nước cao, thể hiện tính đồng nhất về mặt hóa học và vật lý, đồng thời không độc đối với các chủng trong chế phẩm cũng như an toàn với môi trường [86] Hiệu quả hoạt động của một số vật liệu ứng dụng làm chất mang đã được đánh giá như than bùn sinh học, khoáng sét… chúng đều có khả năng phân hủy sinh học, độc tính thấp, quy trình chuẩn bị đơn giản, phổ biến và chi phí khá thấp [102] Một số chất mang

thường được sử dụng để bảo quản vi sinh vật như than bùn, than củi, bột talc, cám gạo, bã mía, phân hữu cơ hay chất mang có nguồn gốc từ tro rơm với thành phần gồm 60% cac-bon và 35%SiO2 [27, 44] Ở Việt Nam, than bùn là chất mang được sử dụng khá nhiều để bảo quản vi sinh vật, bên cạnh đó còn một số chất mang khác như cám gạo, tinh bột sắn, phân hữu cơ cũng đã được nghiên cứu ứng dụng khá nhiều [6, 7] Đây đều là những vật liệu có số lượng lớn, giá thành rẻ, thích hợp để sử dụng làm chất mang để sản xuất chế phẩm sinh học

Tuy nhiên, hiện chưa có nghiên cứu sử dụng các vật liệu này làm chất mang trong chế phẩm sinh học nhằm xử lý ô nhiễm DDT tồn dư trong đất Do đó, đây là thách thức trong việc sản xuất chế phẩm sinh học xử lý ô nhiễm thuốc BVTV nói chung và DDT nói riêng nhằm cải tạo môi trường đất nông nghiệp

1.4.3.3 Ảnh hưởng điều kiện thực tế đến hiệu quả của chế phẩm sinh học khi được đưa vào trong đất

Đất là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều vật chất khác nhau với các đặc tính vật lý, hóa học và sinh học khác nhau Khả năng sinh trưởng, hoạt tính của chế phẩm vi sinh bổ sung vào đất dễ bị ảnh hưởng bởi các thay đổi về tính chất vật lý cấu trúc đất, tính chất hóa học hàm lượng chất dinh dưỡng và tính chất sinh học có sự hiện diện của vi khuẩn gây bệnh hoặc có lợi trong môi trường xung quanh Các yếu tố môi trường ảnh hưởng rất lớn đến vi khuẩn bổ sung vào đất từ chế phẩm sinh học, các kết quả có thể sai khác lớn với thí nghiệm trong phòng thí nghiệm do không sự biến đổi lớn các yếu tố môi trường Những thay đổi trong môi trường gây căng thẳng sinh học cho vi khuẩn, gây ức chế phát triển [76]

Độ pH đất

pH của đất ảnh hưởng đến khả năng hòa tan các chất dinh dưỡng như cac-bon, ni-tơ, phosphorus, potassium, những chất cần thiết cho sinh trưởng của vi khuẩn Độ pH còn ảnh hưởng mạnh mẽ tới vi khuẩn bởi phạm vi phát triển trong điều kiện pH hẹp hơn vi sinh vật khác trong đất như nấm Đồng thời, độ pH của đất là yếu tố dự

báo sự đa dạng của quần xã vi khuẩn tại chỗ Đối với đất nông nghiệp, quần xã vi khuẩn tại chỗ đa dạng nhất trong điều kiện pH gần trung tính, đây là yếu tố cần lưu ý khi bổ sung thêm chế phẩm vi sinh vào đất [76]

Nguồn dinh dưỡng trong đất

Những chất dinh dưỡng cần thiết nhất cho quá trình chuyển hóa tế bào và sự phát triển của vi khuẩn là nguồn cac-bon, ni-tơ, phosphorus Hàm lượng các nguyên tố này ảnh hưởng trực tiếp đến phát triển của vi khuẩn trong chế phẩm Tuy nhiên, tỷ lệ các nguyên tố này, đặc biệt là cac-bon, thay đổi tùy thuộc vào từng loại đất, vì vậy, việc cải tạo đất khi bổ sung chế phẩm sinh học là vấn đề cần lưu ý [76]

Hàm lượng nước và nhiệt độ đất

Tùy theo chu kỳ thời gian, nhiệt độ, lượng mưa, độ ẩm có thể thay đổi, ảnh hưởng trực tiếp đến các quá trình sinh học của vi khuẩn Hàm lượng nước ảnh hưởng đến hoạt động của vi khuẩn Nhiệt độ biến thiên liên tục cũng ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi khuẩn Đây là hai yếu tố gắn liền với nhau, đồng thời cũng ảnh hưởng gián tiếp đến độ pH và hàm lượng dinh dưỡng trong đất [76]

Cấu trúc đất

Hàm lượng dinh dưỡng, nước, khả năng trao đổi cation trong mỗi loại đất là khác nhau Cấu trúc đất ảnh hưởng đến kích thước hạt đất, sự phân bố các hạt tạo khoảng trống, từ đó ảnh hưởng đến dòng nước và chất dinh dưỡng, từ đó ảnh hưởng đến hoạt động của vi khuẩn Mật độ vi sinh vật trong đất phụ thuộc vào kích thước hạt đất, mật độ vi sinh vật thường cao hơn ở đất phù sa và đất sét so với đất cát bởi kích thước hạt đất phù sa hay đất sét bé hơn đất cát [76]

Tương tác với vi sinh vật tại chỗ

Đất là nơi sinh sống của một hệ sinh thái rộng lớn của các sinh vật đất Vì vậy, việc bổ sung chế phẩm sinh học vào đất sẽ có những ảnh hưởng không thể đoán trước được Khi tỷ lệ bổ sung chế phẩm vào đất khá thấp, vi khuẩn được bổ sung cần sinh

trưởng, phát triển, cạnh tranh với lượng lớn vi sinh vật tại chỗ Đây có thể là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp ảnh hưởng đến hoạt tính của chế phẩm sinh học [19]

Tăng khả năng tiếp cận chất ô nhiễm của vi sinh vật

Trở ngại lớn đối với phân hủy sinh học DDT là khả năng tiếp cận kém của vi sinh vật tới các chất ô nhiễm do tính kỵ nước của các chất này Vì vậy, việc bổ sung chất hoạt động bề mặt nhằm giúp vi sinh vật dễ dàng tiếp cận chất ô nhiễm là vấn đề quan trọng Trong nghiên cứu của Betancur và cộng sự (2015), việc bổ sung 6,55mg/kg Tween 80 vào quần thể vi sinh vật tự nhiên trong đất làm giảm 94,3% DDT từ nồng độ ban đầu 99,46ppm sau 8 tuần Trong trường hợp không bổ sung Tween 80, lượng DDT chỉ giảm 4,28% [20] Nghiên cứu của Wang và cộng sự (2018)

cho thấy, việc sử dụng Arthrobacter globiformis bổ sung 5mg/kg Rhamnolipis làm

giảm 64,3% dư lượng DDT sau 150 ngày, cao hơn 12,2% so với khi không bổ sung chất hoạt động bề mặt này [96]

Vì những lý do trên, để tránh những hạn chế khi bổ sung chế phẩm sinh học từ vi khuẩn vào đất, khả năng hoạt động của chế phẩm cần được đánh giá nghiêm ngặt từ quy mô phòng thí nghiệm cho đến mô hình thực tế Mật độ vi khuẩn trong chế phẩm cần đảm bảo duy trì hoạt tính, chế phẩm cần được thử nhiệm xử lý đất từ quy mô phòng thí nghiệm đến quy mô mô hình và sau cùng là xử lý thực tế Đồng thời, quá trình bảo quản, đóng gói cần được chú ý để bảo vệ khả năng tồn tại của vi khuẩn Chế phẩm dạng lỏng ít tốn kém nhưng thời gian bảo quản ngắn hơn chế phẩm dạng rắn sử dụng các chất mang như than bùn, đất sét và các phụ phẩm nông nghiệp như bã mía, bột talc Việc bọc vi khuẩn trong các viên nang được chứng minh giúp nâng cao thời gian sử dụng, cho phép vi khuẩn giải phóng chậm hơn, bảo vệ tế bào vi khuẩn tốt hơn nhưng khá tốn kém [19] Tóm lại, cần nghiên cứu kỹ lưỡng các yếu tố có thể gây ảnh hưởng tới chế phẩm vi khuẩn, từ đó đưa ra phương án bổ sung chế phẩm sinh học phù hợp vào đất, hướng tới xử lý đất nông nghiệp ô nhiễm DDT nói riêng và các loại thuốc BVTV nói chung