CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.5. Các thí nghiệm nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm sinh học xử lý ô nhiễm DDT trong đất ở quy mô phòng thí nghiệm
2.2.5.1. Nghiên cứu môi trường lên men thu sinh khối vi khuẩn
Việc tối ưu môi trường dùng cho lên men vi khuẩn được khảo sát bằng cách đánh giá khả năng sinh trưởng của vi khuẩn thông qua giá trị OD600 ở các mốc thời gian khác nhau. Các thí nghiệm được tiến hành theo các bước như sau:
Chuẩn bị giống: Các chủng nghiên cứu sẽ được hoạt hóa trên đĩa LB hoặc YS để thu khuẩn lạc tươi mới. Khuẩn lạc vi khuẩn được nuôi lắc trong LB, lắc 150
vòng/phút, 30oC. Sau 24 giờ, thu sinh khối vi khuẩn bằng ly tâm 6000 vòng/phút trong 15 phút. Sinh khối được rửa 2 lần bằng MSM, ly tâm bỏ dịch, cuối cùng được hòa lại bằng MSM. Bào tử xạ khuẩn được thu trực tiếp trên đĩa YS và hòa lại bằng MSM. Các loại dịch huyền phù có OD600 khoảng 1,0 sẽ được dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.5.1.1. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nguồn cac-bon
Dịch huyền phù được tiếp giống 5% vào các ống nghiệm chứa môi trường MSM bổ sung một trong các nguồn cac-bon thử nghiệm sau với tỷ lệ 1%: glucose, sucrose, maltose, tinh bột tan, hoặc rỉ đường. Sau đó, nuôi lắc ở 150 vòng/phút, 30oC.
OD600 được xác định sau các mốc thời gian cố định, sau đó được phân tích so sánh để đánh giá khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn nghiên cứu trong MSM bổ sung các nguồn cac-bon thay thế; từ đó lựa chọn nguồn cac-bon phù hợp nhất cho thí nghiệm tiếp theo.
2.2.5.1.2. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nguồn ni-tơ
Dịch huyền phù được tiếp giống 5% vào các ống nghiệm chứa MSM đã tối ưu nguồn cac-bon, bổ sung một trong các nguồn ni-tơ thử nghiệm với tỷ lệ 0,1%
amonium sulfate, potassium nitrate, nước mắm, cao nấm men, bột đậu tương, lắc 150vòng/phút, 30oC. OD600 được xác định sau các mốc thời gian cố định, sau đó được
41 phân tích so sánh để đánh giá khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn nghiên cứu trong MSM bổ sung các nguồn ni-tơ thay thế, từ đó lựa chọn nguồn ni-tơ phù hợp nhất cho thí nghiệm tiếp theo.
2.2.5.1.3. Thí nghiệm khảo sát tỷ lệ tiếp giống
Dịch huyền phù được tiếp giống với một tỷ lệ thử nghiệm là 5%, 10%, hoặc 15% vào các ống nghiệm chứa môi trường MSM bổ sung 1% nguồn cac-bon phù hợp nhất và 0,1% nguồn ni-tơ phù hợp nhất, lắc 150vòng/phút, 30oC. OD600 được xác định
sau các mốc thời gian cố định, sau đó được phân tích so sánh để đánh giá khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn nghiên cứu trong MSM; từ đó lựa chọn tỷ lệ tiếp giống phù hợp cho quá trình lên men.
2.2.5.2. Nghiên cứu giải pháp thu hồi sinh khối vi khuẩn sau lên men
Các phương án thu hồi sinh khối được thử nghiệm sau quá trình lên men bằng cách tính hiệu suất trước và sau thu hồi dựa vào mật độ vi sinh vật, xác định theo công thức thường quy xác định mật độ vi sinh vật như sau:
Công thức xác định mật độ vi sinh vật:
𝑁 = 𝛴𝐶
𝑛1𝑉𝑑1+⋯+𝑛𝑛𝑉𝑑𝑛 (CFU/mL) Trong đó: - N: Mật độ (đơn vị hình thành khuẩn lạc) trong 1 ml dịch mẫu.
- ΣC: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa xác định được số khuẩn lạc.
- n1: Số lượng đĩa cấy đếm được khuẩn lạc tại độ pha loãng i.
- V: Thể tích dịch mẫu [58] đã pha loãng cấy vào mỗi đĩa.
- di: Độ pha loãng i
Công thức tính hiệu suất thu hồi:
H% = 𝑁 𝑠𝑎𝑢 𝑡ℎ𝑢 ℎồ𝑖
𝑁 𝑡𝑟ướ𝑐 𝑡ℎ𝑢 ℎồ𝑖 x 100%
42 Các thí nghiệm được tiến hành theo các bước sau: Các chủng nghiên cứu được nuôi lắc cấp 1 trong môi trường LB, 150 vòng/phút, 30oC. Sau 24 giờ, dịch huyền
phù có OD600 khoảng 1,2 được tiếp giống 10% vào bình bình cấp 2 chứa 600 mL môi trường LB, lắc 150 vòng/phút, 30oC. Sinh khối vi khuẩn sau lên men được thu hồi bằng các phương án đông khô, ly tâm, lọc.
2.2.5.2.1. Thí nghiệm thu hồi sinh khối bằng phương án đông khô
Thí nghiệm được thực hiện theo các bước cụ thể như sau: Sau nuôi lắc, chuyển 600mL dịch huyền phù vi khuẩn vào các đĩa petri chứa Skim milk 20% và Acid glutamic 1% (tỷ lệ 1:1). Đông khô mẫu trong 24 giờ ở -30oC. Sau đông khô, thêm nước muối sinh lý hòa loãng cặn sinh khối để đưa về thể tích trước đông khô. Trải dịch huyền phù đến độ pha loãng 10-8 trên đĩa LB để khảo sát mật độ CFU/mL trước và sau thu hồi. Tính hiệu suất thu hồi sau đông khô (%) so với đối chứng trước đông khô.
2.2.5.2.2. Thí nghiệm thu hồi sinh khối bằng phương án ly tâm
Thí nghiệm được thực hiện theo các bước cụ thể như sau: Sau nuôi lắc, chuyển 600mL dịch huyền phù vào các ống Falcon, ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 15 phút, bỏ dịch, giữ sinh khối. Chuyển sinh khối vào bình tam giác, thêm nước muối sinh lý để đạt thể tích 600mL (ngang thể tích trước ly tâm). Trải dịch nuôi lắc đến độ pha loãng 10-8 trên đĩa LB để khảo sát mật độ CFU/mL trước và sau thu hồi. Tính hiệu suất thu hồi sau ly tâm (%) so với đối chứng trước ly tâm.
2.2.5.2.3. Thí nghiệm thu hồi sinh khối bằng phương án lọc
Thí nghiệm được thực hiện theo các bước sau: Sau nuôi lắc, lọc 600mL dịch huyền phù vi khuẩn bằng hệ thống lọc tiếp tuyến, tốc độ máy bơm 300 vòng/ phút, kớch cỡ cột lọc 0,2àm. Sau lọc, thờm nước muối sinh lý để đưa về thể tớch 600mL (ngang thể tích trước lọc). Trải dịch nuôi lắc đến độ pha loãng 10-8 trên đĩa LB để khảo sát mật độ CFU/mL trước và sau thu hồi. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần. Tính hiệu suất thu hồi sau lọc (%) so với đối chứng trước lọc.
43
2.2.5.3. Nghiên cứu chất mang bảo quản sinh khối vi khuẩn sau thu hồi.
Sinh khối vi khuẩn sau khi thu hồi sẽ được thử nghiệm bảo quản bằng các chất mang khác nhau bao gồm than bùn, xỉ than, tinh bột sắn, cám gạo. Sau các mốc thời gian, khả năng sống sót của vi khuẩn được khảo sát bằng cách xác định mật độ CFU/g chế phẩm, hoạt tính phân hủy DDT được đánh giá thông qua khả năng loại Cl-. Thí nghiệm được tiến hành theo các bước sau:
Sinh khối sau thu hồi được trộn với chất mang (than bùn, xỉ than, tinh bột sắn,
hoặc cám gạo) theo công thức Chất mang : Silica : Sinh khối vi khuẩn theo tỷ lệ khối lượng 9:1:1. Hỗn hợp được rây 2 lần để trộn đều các thành phần với nhau, sau đó được bảo quản ở nhiệt độ phòng và kiểm tra ở các mốc thời gian 0,1,2,3 tháng.
Đánh giá khả năng sống sót của vi khuẩn: Lấy 1g chế phẩm trộn với 9mL MSM lỏng thu được huyền phù độ pha loãng 10-1, tiếp tục pha loãng cấy trải đếm CFU bằng phương pháp thường quy.
Đánh giá hoạt tính phân hủy DDT của chế phẩm thông qua khả năng loại
chloride: Hút 1mL dịch huyền phù 10-1 bên trên vào ống nghiệm chứa 1mL MSM lỏng bổ sung 60ppm DDT để đạt nồng độ cuối cùng 30ppm, lắc 150 vòng/phút, 30oC.
Sau 7 ngày, mẫu được ly tâm 6000 vòng/phút, 15 phút. Phần dịch trong được phân tích lượng Cl- tự do theo phương pháp trình bày ở mục 2.2.2.2.1; qua đó đánh giá được hoạt tính loại Cl- của mẫu tại thời điểm nghiên cứu.