Nghiên cứu tuyển chọn vi sinh vật tổng hợp chất phân tán sinh học nhằm giảm khả năng tạo mảng bám vi sinh trong sản xuất giấy

Nghiên cứu tuyển chọn vi sinh vật tổng hợp chất phân tán sinh học nhằm giảm khả năng tạo mảng bám vi sinh trong sản xuất giấy

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Lê Thị Trà

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT TỔNG HỢP CHẤT PHÂN TÁN SINH HỌC NHẰM GIẢM KHẢ NĂNG TẠO MẢNG BÁM

VI SINH TRONG SẢN XUẤT GIẤY

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2023

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Lê Thị Trà

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT TỔNG HỢP CHẤT PHÂN TÁN SINH HỌC NHẰM GIẢM KHẢ NĂNG TẠO MẢNG BÁM

VI SINH TRONG SẢN XUẤT GIẤY

Chuyên ngành: Khoa học môi trường Mã số: 8440301.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS Phan Thị Hồng Thảo PGS TS Nguyễn Kiều Băng Tâm

Hà Nội – Năm 2023

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Phan Thị Hồng Thảo và PGS TS Nguyễn Kiều Băng Tâm đã hướng dẫn, quan tâm và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn Xin cảm ơn

nguồn kinh phí từ đề tài “Nghiên cứu tạo chế phẩm phân tán sinh học ứng dụng cho xử lý mảng bám vi sinh trong dây chuyền sản xuất giấy bao bì công nghiệp” Mã số:

ĐTKHCN.016/22 thuộc Đề tài cấp Bộ Công thương do TS Phan Thị Hồng Thảo làm chủ nhiệm

Em xin gửi lời cảm ơn các thầy cô đang công tác tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, đặc biệt là các thầy cô Khoa Môi trường đã giảng dạy và trang bị cho em những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập

Em xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị đồng nghiệp đang công tác tại phòng Vi sinh vật đất – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hỗ trợ nhiệt tình và cung cấp điều kiện cơ sở vật chất tốt nhất cho em trong thời gian thực hiện luận văn

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã luôn ủng hộ, động viên trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu

Mặc dù đã cố gắng hoàn thiện luận văn, tuy nhiên không tránh khỏi nhiều sự thiếu sót, kính mong nhận được sự góp ý của các thầy cô

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2023

Học viên

Lê Thị Trà

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên

cứu mà tôi tham gia trong đề tài “Nghiên cứu tạo chế phẩm phân tán sinh học ứng dụng cho xử lý mảng bám vi sinh trong dây chuyền sản xuất giấy bao bì công nghiệp”

Mã số: ĐTKHCN.016/22 thuộc Đề tài cấp Bộ Công thương do TS Phan Thị Hồng Thảo Chủ nhiệm Các tài liệu tham khảo được xem xét, chọn lọc kỹ lưỡng, trích dẫn và liệt kê đầy đủ

Học viên

Lê Thị Trà

1.1.1.Mảng bám vi sinh và vi sinh vật sinh mảng bám 3

1.1.2.Nguyên nhân và cơ chế hình thành mảng bám 5

1.1.3.Ảnh hưởng của mảng bám vi sinh đến sản xuất giấy 7

1.2.Chất phân tán sinh học và vi sinh vật tổng hợp chất phân tán sinh học

10

1.2.1.Chất phân tán sinh học 10

1.2.2.Phân loại chất phân tán sinh học 11

1.2.3.Vi sinh vật sinh tổng hợp chất phân tán sinh học 14

1.3.Sử dụng chất phân tán sinh học nhằm xử lý mảng bám vi sinh trong công nghiệp sản xuất giấy 16

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1.Vật liệu và phạm vi nghiên cứu 18

2.2.Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1.Phương pháp sàng lọc, tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh tổng hợp chất phân tán sinh học 19

2.2.2.Phương pháp thu hồi chất phân tán sinh học thô 19

2.2.3.Phương pháp kiểm tra hoạt tính chất phân tán sinh học 19

2.2.4.Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại vi sinh vật theo 16S rDNA 22

2.2.5.Phương pháp lựa chọn điều kiện môi trường lên men thích hợp 26

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28

3.1.Sàng lọc và tuyển chọn vi sinh vật sinh tổng hợp chất phân tán sinh học

28

3.1.1 Sàng lọc chủng vi khuẩn sinh tổng hợp chất phân tán sinh học 28

3.1.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh tổng hợp chất phân tán sinh học 32

3.2.Đặc điểm sinh học và phân loại vi sinh vật 34

3.2.1 Đặc điểm hình thái tế bào và sinh lý, sinh hóa của vi sinh vật 34

3.2.2 Tách DNA tổng số và so sánh trình tự gen 16S rDNA 39

3.3.Ảnh hưởng của môi trường lên men đến hoạt tính chất phân tán sinh học 42

3.3.1 Lựa chọn môi trường lên men 42

3.3.2 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến chất phân tán sinh học 45

3.3.3 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến chất phân tán sinh học 48

3.3.4 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến chất phân tán sinh học 52

3.3.5 Ảnh hưởng của chất cảm ứng đến hoạt tính chất phân tán sinh học 55

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

PHỤ LỤC 68

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 2 1 Trình tự đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng PCR gen 16S rDNA 25

Bảng 2 2 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 26

Bảng 3 1 Bảng số liệu sàng lọc chủng sinh tổng hợp chất phân tán sinh học 28

Bảng 3 2 Hoạt tính chất phân tán thu nhận từ chủng tuyển chọn 32

Bảng 3 3 Đặc điểm nuôi cấy và hình thái tế bào vi khuẩn 34

Bảng 3 4 Kết quả so sánh trình tự gen mã hóa 16S rDNA của chủng S343 40

Bảng 3 5 Hàm lượng sinh khối ướt và pH sau lên men của chủng Bacillus subtilis S343 trên các môi trường khác nhau 43

Bảng 3 6 Hoạt tính chất phân tán sinh học thu nhận từ các môi trường khác nhau 43 Bảng 3 7 Hàm lượng sinh khối ướt và pH sau lên men của chủng Bacillus subtilis S343 theo thời gian 46

Bảng 3 8 Hoạt tính chất phân tán sinh học thu nhận theo thời gian 46

Bảng 3 9 Hàm lượng sinh khối ướt và pH sau lên men của chủng Bacillus subtilis S343 trên các nguồn cacbon khác nhau 49

Bảng 3 10 Hoạt tính chất phân tán sinh học thu nhận từ các nguồn C khác nhau 49

Bảng 3 11 Hàm lượng sinh khối ướt và pH sau lên men của chủng Bacillus subtilis S343 trên các nguồn nitơ khác nhau 52

Bảng 3 12 Hoạt tính chất phân tán sinh học thu nhận từ các nguồn N khác nhau 52

Bảng 3 13 Hàm lượng sinh khối ướt và pH sau lên men của chủng Bacillus subtilis S343 trên các chất cảm ứng khác nhau 56

Bảng 3 14 Ảnh hưởng của chất cảm ứng đến khả năng thu nhận và hoạt tính của chất phân tán sinh học từ chủng Bacillus subtilis S343 56

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1 1 Các vi sinh vật hình thành mảng bám trong môi trường nhà máy 4

Hình 1 2 Minh họa quá trình hình thành màng sinh học và hình ảnh kính hiển vi điện tử quét tiêu biểu cho từng bước 7

Hình 1 3 Các loại tổn thất khác nhau trong quy trình hoặc sản phẩm của nhà máy giấy do lắng đọng mảng bám 8

Hình 1 4 Phân loại chất hoạt động bề mặt sinh học dựa trên bản chất hóa học 12

Hình 3 1 Hoạt tính lan truyền dầu của các chủng tuyển chọn 31

Hình 3 2 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến sinh trưởng của chủng vi khuẩn 35

Hình 3 3 Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của chủng vi khuẩn 36

Hình 3 4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của chủng vi khuẩn 37

Hình 3 5 Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon của vi khuẩn tuyển chọn 38

Hình 3 6 Khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào của vi khuẩn tuyển chọn 39

Hình 3 7 Điện di kiểm tra DNA tổng số (a) và điện di sản phẩm PCR (b) của vi khuẩn tuyển chọn 40

Hình 3 8 Cây tương đồng di truyền của chủng Bacillus subtilis S343 Các chỉ số trên hình thể hiện khoảng cách di truyền 41

Hình 3 9 Hoạt tính chất phân tán sinh học thu nhận từ các môi trường khác nhau 45 Hình 3 10 Hoạt tính chất phân tán sinh học thu nhận theo thời gian 47

Hình 3 11 Ảnh hưởng của nguồn C đến hoạt tính phân tán dầu và nhũ tương của chất phân tán sinh học thu nhận từ chủng Bacillus subtilis S343 50

Hình 3 12 Hoạt tính chất phân tán sinh học thu nhận từ các nguồn N khác nhau 54

Hình 3 13 Hoạt tính chất phân tán sinh học thu nhận từ các chất cảm ứng khác nhau 57

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

EPS HĐBM PTSH VSV

Exopolysaccharide Hoạt động bề mặt Phân tán sinh học Vi sinh vật

MỞ ĐẦU

Mảng bám vi sinh (gọi tắt là “mảng bám”) là thuật ngữ chung để chỉ sự tập trung của vi sinh vật trong nhà máy sản xuất giấy, tạo ra các đám nhầy bám dính trên các thiết bị Thành phần của mảng bám thường là vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, tảo v.v.), các exopolysaccharide (EPS) do vi khuẩn sinh ra, xơ sợi gỗ và các chất phụ gia của quá trình sản xuất Exopolysaccharide có thành phần gồm các polysaccharide với cấu trúc khá đa dạng, có thể chứa protein, axit nucleic và hợp chất lipid [11] Các vi sinh

vật thường gây ra mảng bám chủ yếu là vi khuẩn (Bacillus spp., Achromobacter spp., Enterobacter spp., Pseudomonas spp., Clostridium,…), nấm (Aspergillus, Penicillium, Saccharomyces,…) và tảo [61] Sự phát triển của vi sinh vật này tạo

thành mảng bám, gây ra các vấn đề liên quan đến công nghiệp, môi trường và sức khỏe, gây ra lỗi vận hành và giảm chất lượng sản phẩm dẫn đến thiệt hại về kinh tế [29]

Kiểm soát mảng bám trong sản xuất giấy là điều quan trọng để duy trì chất lượng của sản phẩm giấy và đảm bảo vận hành không gặp sự cố, không có thời gian ngừng hoạt động của máy do đứt giấy, do mảng bám và cặn bẩn của máy móc giấy gây ra Các chất diệt khuẩn hóa học thường được các nhà máy giấy sử dụng để kiểm soát vấn đề mảng bám, nhưng chưa thực sự hiệu quả và ngày càng có nhiều đòi hỏi khắt khe hơn về vấn đề bảo vệ môi trường và pháp lý Những phương pháp thay thế bao gồm: sử dụng enzyme, sử dụng thể thực khuẩn, sử dụng các vi sinh vật cạnh tranh, cân bằng sinh học và các chất phân tán sinh học [11]

Chất phân tán sinh học là giải pháp tốt về mặt sinh thái để kiểm soát mảng bám trong ngành công nghiệp giấy và bột giấy bằng cách loại bỏ hoặc giảm sử dụng chất diệt khuẩn hóa học [11] Chất phân tán sinh học hòa tan và phân tán các chất kết bám tạo thành mảng bám, nhờ đó ngăn ngừa sự tái tạo của mảng bám Chất này hoạt động theo cơ chế thẩm thấu, mở màng sinh học và cho phép hoạt chất diệt khuẩn xâm nhập vào các polysaccharide ngoại bào Tác dụng này không những giúp làm bong tróc mảng bám, mà còn khiến cho các vi sinh vật ở bên trong mảng bám bị tiếp xúc

trực tiếp với chất diệt khuẩn nên bị tiêu diệt hiệu quả hơn Công nghệ phân tán sinh học dựa trên các polyme không ion Chúng không độc hại, không màu, không tạo bọt và không chứa dung môi hữu cơ nên chúng không ảnh hưởng đến tính anion của hệ thống và không ảnh hưởng đến các hóa chất sản xuất giấy khác [11]

Do khả năng ứng dụng hiệu quả của chất phân tán sinh học từ vi sinh vật, trong những năm qua, các nhà khoa học đã không ngừng tìm kiếm các vi sinh vật mới có tiềm năng sản xuất chất phân tán sinh học mới và nâng cao khả năng sinh tổng hợp của vi sinh vật [76] Quá trình tổng hợp chất phân tán sinh học phụ thuộc nhiều vào loại cơ chất, công nghệ lên men và chủng vi sinh vật [45] Tại Việt Nam, nghiên cứu sử dụng các chất phân tán sinh học trong lĩnh vực công nghiệp sản xuất giấy còn chưa

được thực hiện Xuất phát từ những lý do trên, luận văn bước đầu “Nghiên cứu tuyển chọn vi sinh vật tổng hợp chất phân tán sinh học nhằm giảm khả năng tạo mảng bám vi sinh trong sản xuất giấy” Đề tài được tiến hành với mục đích phát triển và

ứng dụng công nghệ xanh trong lĩnh vực xử lý ô nhiễm môi trường các ngành nghề sản xuất nói chung và trong ngành công nghiệp giấy nói riêng

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Tuyển chọn và định danh được ít nhất 01 chủng vi sinh vật sinh tổng hợp chất phân tán sinh học, bước đầu đánh giá, nghiên cứu một số tính chất của chất phân tán thu nhận

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Sàng lọc và tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh tổng hợp chất phân tán sinh học - Nghiên cứu đặc điểm sinh học và định danh vi sinh vật tuyển chọn

- Nghiên cứu môi trường và điều kiện lên men thích hợp, đánh giá khả năng sinh tổng hợp chất phân tán sinh học và khả năng giảm mảng bám vi sinh tại phòng thí nghiệm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Mảng bám vi sinh

1.1.1 Mảng bám vi sinh và vi sinh vật sinh mảng bám

Mảng bám (slime) là tên gọi chung của chất cặn có nguồn gốc vi sinh vật trong nhà máy giấy Vi khuẩn bám vào bề mặt và bắt đầu hình thành màng sinh học (biofilm) Bề mặt mà vi khuẩn bám vào để tạo thành màng sinh học rất quan trọng và phụ thuộc vào tính ưa nước và kỵ nước của bề mặt Ví dụ: khả năng bám dính của polyme Glycocalyx trước hết liên quan đến việc gắn glycoprotein với bề mặt tiếp xúc, sau khi gắn kết, tập hợp của vi khuẩn được hình thành và cuối cùng là sự hình thành màng sinh học bằng cách tiết ra EPS EPS thường bao gồm các polysaccharit, cũng có thể chứa protein, axit nucleic và các hợp chất béo (lipophilic polyme) [61] EPS được coi là thành phần cấu trúc chính của màng sinh học hỗ trợ tương tác bề mặt của các vi khuẩn với nhau [28, 56] Màng sinh học hoạt động như một lớp bảo vệ chống lại các tác nhân gây hại cũng như là nguồn dự trữ carbon và năng lượng cho vi sinh vật trong các thời điểm thiếu hụt chất dinh dưỡng Màng sinh học có khả năng chống lại tia UV và tăng tỷ lệ trao đổi gen giữa các vi sinh vật Các chất cặn hữu cơ của màng sinh học đóng vai trò là môi trường sống cho vi sinh vật và giúp liên kết các màng sinh học lại với nhau để chúng tồn tại lâu dài Lớp màng hữu cơ còn bảo vệ tế bào vi sinh vật khỏi những thay đổi lý hóa trong hệ thống [61]

Trong tự nhiên, khoảng 99% vi sinh vật tồn tại ở dạng màng sinh học (biofilm) và chỉ có 1% tồn tại ở dạng tế bào tự do Màng sinh học (biofilm) được định nghĩa là tập hợp quần xã vi sinh vật bám trên một bề mặt của vật thể rắn hoặc bề mặt chất lỏng, sau khi gắn trên 1 bề mặt, chúng sẽ bắt đầu sản xuất lớp polyme ngoại bào (EPS - extracellular polymeric substance) bao phủ bề mặt đó Các EPS này được cấu thành bởi các polyme có tính kết dính cao (như: alginate, pel, psl ), sẽ kéo theo việc bám dính của nhiều chất hữu cơ, dầu mỡ hay các chất rắn lơ lửng trong các đường ống thoát nước sinh hoạt Đây là nguyên chính gây ra mùi hôi và gây tắc các đường ống thoát nước [2]

Màng sinh học (biofilm) là một cấu trúc phức tạp, được tạo ra bởi các vi sinh vật sinh trưởng và bám dính trên bề mặt vật liệu, chúng có thể được tạo ra từ các nhóm vi sinh vật khác nhau bao gồm vi khuẩn, nấm mốc, nấm men… nhưng phổ biến nhất vẫn là vi khuẩn Các nghiên cứu đã xác định hầu hết các loài vi khuẩn đều có khả năng tạo màng sinh học Vi khuẩn có thể hình thành màng sinh học trên các loại bề mặt môi trường rắn, lỏng hoặc trên bề mặt môi trường bán lỏng [1]

Thành phần sinh học của mảng bám nhà máy giấy đều là các vi sinh vật đơn bào Vi khuẩn, nấm men và nấm thường được tìm thấy nhiều nhất trong mảng bám (Hình 1.1)

Hình 1 1 Các vi sinh vật hình thành mảng bám trong môi trường nhà máy [61] Vi khuẩn thường thấy nhất trong mảng bám là Aerobacter aerogenes hình que

không sinh bào tử, có khả năng thích nghi tùy theo lượng oxy sẵn có trong môi trường xung quanh Chúng kết hợp với sợi giấy tạo thành mảng bám mềm và sền sệt Vi khuẩn này có khả năng di động và di chuyển ở một mức độ nhất định để chọn những

vị trí thuận lợi nhất trong máy giấy để xâm chiếm Escherichia coli, Pseudomonas, Arthrobacter, Proteus, v.v là những loài vi khuẩn khác chịu trách nhiệm trong việc

hình thành mảng bám Những loài này chịu trách nhiệm cho sự phát triển về độ dày

và cuối cùng tách mảng bám ra khỏi bề mặt vật liệu Pseudomonas chủ yếu được tìm

thấy trong các nhà máy sử dụng nước xử lý không tái chế Mảng bám có thể cung cấp

vùng kỵ khí cho sự phát triển của vi khuẩn khử sunfat Ví dụ, Desulphovibrio desulphuricans khử sunfat thành hydro sunfua và cũng khử sunfit, thiosulphat và

hyposulphit Đây là một trong nhiều loại vi khuẩn thúc đẩy sự ăn mòn và đổi màu bề mặt sơn, bột giấy và các thiết bị khác nhau [61]

Nấm mốc hoặc nấm sợi: Mảng bám được hình thành rất khác nhau với nhóm nấm, từ sự phát triển dạng keo nặng đến mảng bám dạng da hoặc mờ Nấm mốc có khả năng sử dụng nhiều loại cơ chất như cellulose, tinh bột hoặc đường Một số loài

nấm mốc hình thành khuẩn lạc kết hợp với các loài vi khuẩn như: Cladosporium, Geotrichum, Mucor và các loài nấm khác Các chi nấm Aspergillus, Penicillium và Cephalosporium chịu trách nhiệm trong việc hình thành mảng bám [61] Nấm chịu

nhiệt thường hiện diện trong hệ thống nước với quy trình khép kín trong nhà máy giấy có nhiệt độ dao động trên 30°C [26] Những loại nấm này tạo ra EPS hình thành mảng bám từ vật liệu dự trữ và các sản phẩm bài tiết của chúng Cấu trúc giống như

xơ sợi do nấm Basidiomycetes và các loài Penicillium tạo ra giúp tích tụ mảng bám

dẫn đến tạo ra các mảng màu trong bột giấy, làm hỏng bột giấy ướt xếp chồng lên nhau và các sản phẩm giấy thành phẩm [61]

1.1.2 Nguyên nhân và cơ chế hình thành mảng bám

Sự hình thành mảng bám là một quá trình rất phức tạp do có nhiều yếu tố liên quan đến quá trình phát triển của chúng Sự hình thành mảng bám xảy ra một cách tự nhiên do sự phát triển của các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm và nấm men khi có chất dinh dưỡng, độ ẩm và nhiệt độ thích hợp Các nhà máy giấy sử dụng sợi tái chế thường sử dụng quy trình khép kín có điều kiện tối ưu cho sự phát triển của vi sinh vật do hàm lượng chất dinh dưỡng cao, nhiệt độ và độ pH tối ưu [61] Nước trắng trong nhà máy giấy cũng chứa nhiều chất dinh dưỡng, tạo môi trường thích hợp cho vi sinh vật phát triển, đặc biệt là nước có nhiệt độ dao động trong khoảng 30°C Trong nhà máy giấy, loại và tính chất của mảng bám tạo ra sẽ thay đổi tùy theo từng khu vực [11]

Khi nồng độ oxy hòa tan tăng sẽ thúc đẩy sự phát triển của vi khuẩn hiếu khí chính là tác nhân hình thành mảng bám, còn khi nồng độ oxy hòa tan giảm thì vi khuẩn kỵ khí tăng trưởng Nhiệt độ tăng giúp cho sự tăng trưởng và phát triển của vi khuẩn ưa nhiệt đến vi khuẩn chịu nhiệt Tái sử dụng nước trắng làm tăng vi sinh vật dạng sợi trong hệ thống nước Ô nhiễm vi khuẩn và nấm thường xảy ra trong trường hợp sử dụng bột giấy tái chế Mật độ vi sinh vật trong bột giấy tái chế cao hơn nhiều lần so với bột giấy nguyên chất [11]

Đôi khi, bột giấy là nguồn gây ô nhiễm chính cho nhà máy Các khúc gỗ gần đáy đống thường bị bao phủ bởi mảng bám của vi khuẩn và nấm mốc phát triển Đống càng thấp thì số lượng vi khuẩn càng cao Vi khuẩn hình thành bào tử, các bào tử của

Bacillus subtilis thường xuyên chịu được nhiệt độ cao, còn các vi khuẩn không tạo bào tử thường bị tiêu diệt Nhiễm vi khuẩn Aerobacter aerogenes do bột giấy bị tái

chế nhiều lần Nhiệt độ nghiền không thể loại bỏ được các mảng bám đã tồn tại và chúng được đưa vào hệ thống nghiền gỗ và nhà máy giấy [61]

Sự hình thành mảng bám thường được thiết lập thông qua một số bước và theo tiến trình phân lớp Đầu tiên, các tế bào sinh vật phù du bám vào bề mặt, thông qua lực tương tác tĩnh điện, liên kết hydro và lực phân tán London [46] Những vi khuẩn xâm chiếm ban đầu, thường là vi khuẩn đặc hiệu, có khả năng bám dính nhờ khả năng tạo ra các polyme ngoại bào, bao gồm chủ yếu là các polysaccharide không ion và anion [88] Sự bám dính của vi khuẩn là một quá trình phức tạp bị ảnh hưởng bởi (i) một số đặc điểm của bề mặt (kết cấu, độ nhám, tính kỵ nước, hóa học bề mặt và điện tích); (ii) điều kiện môi trường (nhiệt độ, pH, thời gian tiếp xúc, nồng độ vi khuẩn, xử lý hóa học hoặc sự hiện diện của thuốc kháng khuẩn và điều kiện dịch); và (iii) các đặc tính hóa lý nội tại của vi khuẩn (tính kỵ nước, điện tích bề mặt, sản xuất polysaccharit và khả năng vận động của tế bào) [73, 74] Một khi bề mặt tiếp xúc được vi sinh vật xâm chiếm, các tế bào sẽ phát triển và tạo ra EPS, các vi khuẩn sẽ phát triển và sự kết dính và đông tụ của các tế bào vi khuẩn khác nhau sẽ góp phần phát triển màng sinh học đa loài [24] Các đặc tính bề mặt tế bào, cụ thể là sự hiện diện của các phần phụ ngoại bào, các tương tác liên quan đến giao tiếp giữa tế bào và

sản xuất EPS rất quan trọng cho sự hình thành và phát triển màng sinh học EPS chịu trách nhiệm kết dính các bề mặt, tạo mạng lưới cho các tế bào kết dính lại với nhau, duy trì cấu trúc ba chiều của màng sinh học và bảo vệ tế bào chống lại các điều kiện bất lợi Các thành phần của nó bao gồm các polysaccharit, axit nucleic, protein, lipid và các polyme sinh học khác Sau khi trưởng thành, tế bào rời khỏi màng sinh học ở giai đoạn phân tán [38] Quá trình này được minh họa trong Hình 1.2

Hình 1 2 Minh họa quá trình hình thành màng sinh học và hình ảnh kính hiển vi

điện tử quét tiêu biểu cho từng bước [67]

1.1.3 Ảnh hưởng của mảng bám vi sinh đến sản xuất giấy

Sự hình thành mảng bám trong hệ thống dây chuyền sản xuất khép kín của nhà máy giấy đã gây nên những vấn đề nghiêm trọng Các loại tổn thất khác nhau trong các quy trình hoặc sản phẩm của nhà máy giấy do mảng bám được tóm tắt trong Hình 1.3 Màng sinh học có thể xuất hiện ở các bề mặt tiếp xúc khác nhau như rắn-lỏng, rắn- khí, lỏng-lỏng và lỏng- khí Sự hình thành màng sinh học trong thiết bị thường xuyên dẫn đến lỗi giấy hoặc gây đứt giấy [61]

Hình 1 3 Các loại tổn thất khác nhau trong quy trình hoặc sản phẩm của nhà máy

giấy do mảng bám [61]

Các chất chuyển hóa được giải phóng bởi quá trình trao đổi chất của vi khuẩn trong màng sinh học là các axit hữu cơ và vô cơ [11] Do đó, màng sinh học tạo ra nồng độ oxy khác nhau ở các vùng khác nhau, gây ra các mảng trên giấy do tính ăn mòn của nó Mùi được tạo ra bởi vi khuẩn khử sunfat ở bất cứ nơi nào sử dụng chất tẩy trắng và đặc biệt là trong nhà máy giấy có chu trình nước khép kín dẫn đến sự gia tăng nồng độ axit hữu cơ dễ bay hơi hoặc các hợp chất có mùi hôi Vấn đề trở nên nghiêm trọng hơn đối với những máy sử dụng sợi tái chế và có chu trình nước khép kín Vi khuẩn khử sunfat tạo ra khí H2S gây độc, đặc biệt ở khu vực thông gió kém [11, 82] Để đánh giá và kiểm soát mảng bám của nhà máy sản xuất cần phải xem xét tổng tổn thất do mảng bám gây ra như: thất thoát thành phẩm, tổn thất nhiệt, hóa chất, phụ gia, nước, bộ lọc, sợi, thời gian sản xuất, giảm tuổi thọ của thiết bị… Trong các nhà máy, thường gặp hiện tượng xuất hiện các mảng bám màu hồng và đỏ do nhiều

vi sinh vật khác nhau tạo ra như: Micrococcus agilus, Serratia marcescens, S

piscotora, Monilia, Rhodotorula, Fusarium sp., Penicillium pinophilum Sử dụng các

chất diệt khuẩn khác nhau có bản chất không chọn lọc, được nhiều nhà máy sản xuất giấy sử dụng để tránh sự hình thành mảng bám, làm phát triển khả năng kháng chất diệt khuẩn của các vi sinh vật này Do đó, hầu hết các nhà sản xuất giấy tránh sử dụng một chất diệt khuẩn duy nhất và sử dụng chất diệt khuẩn theo cách xen kẽ [82]

Nếu sự phát triển của vi khuẩn không được kiểm soát, các vấn đề có thể xảy ra trong quá trình sản xuất giấy bao gồm các vấn đề về khả năng vận hành thiết bị, ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm cuối cùng và gây thất thoát và hỏng nguyên liệu thô Mảng bám tích tụ có thể gây tắc nghẽn đường ống dẫn đến nhiều vấn đề trong sản xuất của máy giấy Người ta ước tính rằng 10–20% thời gian ngừng hoạt động của máy giấy là do vấn đề về mảng bám [9] Phần lớn chi phí là do hư hỏng bởi các khối mảng bám rơi xuống lô cuốn và máy xeo giấy, trên đó nước bị tách ra khỏi bột giấy và gây ra các lỗ thủng Người ta ước tính rằng tùy thuộc vào quy mô của nhà máy, quy trình và chất lượng của giấy, một sự cố có thể tốn từ 2000 USD đến 10.000 USD Nếu sự cố xảy ra hai lần mỗi ngày, hiệu suất của nhà máy sẽ giảm đáng kể Không phải tất cả các vết nứt đều là do mảng bám sinh học, nhưng 1 đến 2 trong số 5 vết nứt có thể liên quan đến khối vi sinh vật Ngoài ra, chi phí cho thời gian ngừng hoạt động trong quá trình vệ sinh và chi phí liên quan đến nhân công và hóa chất cũng phải được xem xét Khả năng sản phẩm bị hư hỏng và chi phí bảo trì cao cũng cần được xem xét [29]

Việc kiểm soát sự hình thành mảng bám do vi sinh vật gây nên trong dây chuyền sản xuất giấy là thiết yếu, nhằm đảm bảo chất lượng giấy cao và vận hành thuận lợi, tránh những vấn đề do mảng bám gây ra cho quá trình sản xuất Trên thị trường ngày nay, các biện pháp sử dụng với chất diệt khuẩn được sử dụng theo quy ước không mang lại kết quả khả quan cho ngành công nghiệp giấy trong lợi ích về chi phí, hiệu quả sản xuất và chất lượng thành phẩm Do đó, một phương pháp mới có thể dùng là việc sử dụng các tác nhân sinh học (như enzyme, thực khuẩn thể, chất phân tán sinh học…) để kiểm soát mảng bám hay tạo điều kiện để tác động trực tiếp lên tế bào do tiếp xúc với liều lượng thấp hơn so với chất diệt khuẩn hóa học Điều

này giúp giảm thiểu những vấn đề của môi trường một cách gián tiếp

1.2 Chất phân tán sinh học và vi sinh vật tổng hợp chất phân tán sinh học

1.2.1 Chất phân tán sinh học

Chất phân tán sinh học là chất hoạt động bề mặt do vi sinh vật tạo ra chứa các nhóm phân tử lưỡng tính gồm các gốc ưa nước và kị nước và không đồng nhất về mặt cấu trúc Chúng có khả năng làm giảm sức căng bề mặt và có nhiều ứng dụng trong công nghiệp và môi trường [50]

Chất hoạt động bề mặt sinh học là hợp chất trao đổi thứ cấp không độc hoặc có độc tính thấp được sinh ra bởi vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc, nấm men trong môi trường nuôi cấy chứa hợp chất hữu cơ là nguồn carbon Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các phân tử chất hoạt động bề mặt có thể tạo điều kiện thuận lợi cho sự gắn kết và phát triển của vi sinh vật trên một bề mặt Đồng thời, chất hoạt động bề mặt cũng tạo phức với các phân tử kim loại nặng, làm giảm độc tính cho vi sinh vật trong môi trường sống của chúng [1]

Các vi sinh vật tổng hợp một loạt các chất hoạt động bề mặt sinh học, các phân tử lưỡng tính thường tập trung ở các bề mặt phân cách giữa các pha hoặc bề mặt kỵ nước và ưa nước, có thể là chất rắn, chất lỏng hoặc khí Giống như các chất hoạt động bề mặt hóa học, chúng có chức năng làm giảm sức căng bề mặt hoặc bề mặt tiếp xúc để tạo thành nhũ tương và chúng có khả năng hình thành các tập hợp phân tử bao gồm cả các mixen Các chất hoạt động bề mặt sinh học này khác nhau về cấu trúc hóa học và điện tích và cũng khác nhau tùy theo nguồn vi sinh vật Trọng lượng phân tử của các chất hoạt động bề mặt sinh học vi sinh vật thường dao động từ 500-1500 Da Trong số các chất hoạt động bề mặt sinh học, glycolipid và glycopeptide có trọng lượng phân tử thấp hơn thường hiệu quả hơn trong việc giảm sức căng bề mặt và bề mặt tiếp xúc, trong khi các polysaccharit lưỡng tính và protein có trọng lượng phân tử cao cũng như lipopolysaccharit và lipoprotein là chất ổn định dầu trong nước Nồng độ chất hoạt động bề mặt tối thiểu cần thiết để hình thành các mixen, nồng độ mixen tới hạn (CMC) thường dao động từ 1-200 mg/L [85]

Màng tế bào hoặc thành tế bào của vi khuẩn đại diện cho bề mặt tiếp xúc chính của tế bào với môi trường và tương tác với các môi trường khác nhau bởi các chất hoạt động bề mặt sinh học ngoại bào được tiết ra Về mặt đó, yêu cầu cơ bản nhất cho sự tồn tại và phát triển của tế bào của các loài vi sinh vật liên quan đến việc cung cấp chất dinh dưỡng từ môi trường bên ngoài của tế bào Do đó, các chất hoạt động bề mặt sinh học đóng vai trò đa dạng trong việc tạo điều kiện thuận lợi cho việc cung cấp đó bằng cách làm trung gian quá trình hòa tan, huy động, gia nhập và/hoặc phân hủy sinh học của các phân tử hữu cơ tổng hợp Chúng cũng có thể tạo điều kiện cho tế bào hấp thu các chất dinh dưỡng hữu cơ tự nhiên hoặc vô cơ tự nhiên ngoại bào hoặc các chất dinh dưỡng liên quan đến các tế bào sống khác thông qua nhiều loại tương tác tế bào bao gồm cả sinh bệnh học Những hiện tượng bề mặt này có thể xảy ra một cách tự nhiên và thụ động trong môi trường hoặc có thể được thúc đẩy hoặc thiết kế trong các quá trình xử lý sinh học, đáng chú ý nhất là trong quá trình xử lý sinh học và xử lý chất thải sinh học Các chất hoạt động bề mặt sinh học cũng có thể tác động đến sinh lý của vi khuẩn bằng cách thể hiện tác dụng độc hại hoặc ức chế, trực tiếp hoặc gián tiếp, thông qua quá trình hòa tan các hóa chất có thể gây độc cho các loài vi sinh vật cụ thể Các quá trình phân hủy sinh học vi sinh vật qua trung gian chất hoạt động bề mặt đặc biệt phổ biến trong quá trình phân hủy sinh học các chất ô nhiễm hữu cơ tổng hợp do tất cả các quá trình tế bào đều yêu cầu hoạt độ nước cao (Aw) trong khi phần lớn các hóa chất hữu cơ tổng hợp và nguồn chủ yếu của các hóa chất này là kỵ nước [85]

1.2.2 Phân loại chất phân tán sinh học

Dựa trên thành phần hóa học và loại vi khuẩn sản sinh ra chúng, các chất hoạt động bề mặt sinh học được chia thành năm nhóm lớn: glycolipid, lipopeptide và lipoprotein, phospholipid, hydroxyl hóa và liên kết ngang và axit béo, chất hoạt động bề mặt polyme và chất hoạt động bề mặt dạng hạt [50]

Glycolipid

Glycolipid là các carbohydrate như mono-, di-, tri- và tetrasacarit bao gồm

glucose, mannose, galactose, axit glucuronic, rhamnose và galactose sulphate kết hợp với axit béo chuỗi dài hoặc axit béo hydroxy Các ví dụ tốt nhất về glycolipids bao gồm lipid trehalose, rhamnolipids, sophorolipids, diglycosyl diglycerides và lipid mannosylerythritol Các loại glycolipid khác đã được báo cáo trong tài liệu như glycoglycerolipid [53], chất nhũ hóa sinh học gốc đường [41, 80], mannosylerythritol lipid A và nhiều lipid hexose khác nhau [50]

Hình 1 4 Phân loại chất hoạt động bề mặt sinh học dựa trên bản chất hóa học [60]

Lipopeptide và lipoprotein

Surfactin, một lipopeptide vòng là một trong những chất hoạt động bề mặt sinh

học hiệu quả nhất được biết đến cho đến nay, được báo cáo lần đầu tiên ở B subtilis

ATCC-21332 [7] Các nhóm hợp chất Surfactin được chứng minh là lipoheptapeptid vòng có chứa axit béo β-hydroxy ở chuỗi bên của nó Nhóm hợp chất iturin là các lipoheptapeptid vòng có chứa axit béo β-amino ở chuỗi bên của nó Lipopeptid thuộc họ iturin là chất chống nấm mạnh và cũng có thể được sử dụng làm thuốc trừ sâu sinh học để bảo vệ thực vật [81]

Axit béo

Một số vi khuẩn phân hủy hydrocarbon nhất định tạo ra axit béo tự do ngoại bào khi phát triển trên ankan và thể hiện hoạt tính hoạt động bề mặt tốt Các chất hoạt động bề mặt sinh học axit béo là các axit béo bão hòa trong khoảng từ C12 đến C14 và các axit béo phức tạp chứa các nhóm hydroxyl và các nhánh alkyl Người ta đã chứng

minh rằng chủng Arthobacter AK-19 và P aeruginosa 44T1 tích lũy tới 40-80%

(w/w) lượng lipid đó khi nuôi cấy trên hexadecane và dầu ô liu tương ứng [50]

Polymer

Chất hoạt động bề mặt sinh học polyme là các polyme sinh học có trọng lượng phân tử cao, thể hiện các đặc tính như độ nhớt cao, độ bền kéo và khả năng chống

đứt Acinetobacter calcoaceticus RAG-1 tạo ra chất nhũ hóa sinh học đa bào ngoại

bào mạnh được gọi là emulsan [68] được đặc trưng như một dị polysacarit lưỡng tính đa anion Việc loại bỏ phần protein sẽ tạo ra sản phẩm apoemulsan, có hoạt tính nhũ hóa thấp hơn nhiều trên các chất kỵ nước như n-hexadecane Một trong những protein

quan trọng liên quan đến phức hợp emulsan là enzyme esterase bề mặt tế bào [8] C lipolytica tạo ra một chất nhũ hóa hòa tan trong nước ngoại bào gọi là Liposan, bao

gồm 83% (w/v) carbohydrate và 17% (w/v) protein Phần carbohydrate là một loại dị polysacarit bao gồm glucose, galactose, galactosamine và axit galacturonic [16]

Dạng hạt

Một số ví dụ về chất hoạt động bề mặt dạng hạt là các túi màng ngoại bào của tế bào vi sinh vật, giúp nhũ hóa hydrocarbon Sự tích tụ các túi màng ngoại bào có đường kính 20-50 mm và mật độ nổi 1,158 g/cm2 đã được báo cáo ở tế bào

Acinetobacter sp HO1-N Các túi tinh khiết bao gồm protein, phospholipid và

lipopolysacarit [50]

1.2.3 Vi sinh vật sinh tổng hợp chất phân tán sinh học

Các vi sinh vật sinh tổng hợp chất HĐBM phân bố rộng rãi trong nước, đất và các môi trường khác nhau, v.v Các chất HĐBM của vi sinh vật có thể được sản xuất ngoại bào hoặc nội bào, và chúng thường được phân loại dựa trên thành phần hóa học và nguồn vi sinh vật của chúng [12, 83] Bản chất của chất hoạt động bề mặt sinh học cũng phụ thuộc vào nguồn vi sinh vật và phương pháp phân lập; ví dụ, một chủng phân lập từ một địa điểm bị ô nhiễm được coi là một lựa chọn thích hợp cho sự phân hủy của chất gây ô nhiễm cụ thể đó Lý do có thể xảy ra cho khái niệm này là vi sinh vật được phân lập có thể sử dụng chất gây ô nhiễm đó làm nguồn năng lượng hoặc chất nền, nơi các vi sinh vật khác hoặc vi sinh vật không sản xuất chất hoạt động bề mặt không thể tồn tại Loại, số lượng và chất lượng chủ yếu bị ảnh hưởng bởi bản chất của cơ chất carbon và nồng độ của nitơ, phốt pho và các ion magie, sắt, mangan trong môi trường và điều kiện nuôi cấy, bao gồm pH, nhiệt độ, tốc độ khuấy và tỷ lệ giống, v.v

Các chất hoạt động bề mặt sinh học vi sinh vật được biết là được sản xuất ngoại bào bởi nhiều loại vi khuẩn, nấm men, nấm, v.v dưới dạng hợp chất lưỡng tính từ màng tế bào của chúng và có hoạt tính bề mặt cao giống như các chất hoạt động bề mặt hóa học Chúng được phát hiện lần đầu tiên vào cuối những năm 1960 trong các thí nghiệm lên men hydrocarbon [4] Nói tóm lại, chúng có khả năng làm giảm sức căng bề mặt cũng như sức căng bề mặt của các mảng bám dẫn đến sự hình thành bọt và cuối cùng làm tăng khả năng hòa tan trong nước và khả dụng sinh học của chất lỏng không pha nước (NAPLS) [27] Chúng được biết là được tạo ra bởi nhiều vi sinh

vật khác nhau bao gồm nhiều loại vi khuẩn, nấm và nấm men Ví dụ, một số chủng

Pseudomonas aeruginosa được biết đến với khả năng sản xuất các chất hoạt động bề mặt sinh học nhóm rhamnolipid; Candida bombicola, một trong những loại nấm men

ít được biết đến, được biết là sản xuất chất hoạt động bề mặt sinh học nhóm

sophorolipid từ dầu thực vật và cơ chất tinh bột; Bacillus subtilis có khả năng sản

xuất các chất hoạt động bề mặt sinh học nhóm Surfactin, v.v [51] Các chất hoạt động bề mặt sinh học có bản chất lưỡng tính, mang cả hai phần kỵ nước và ưa nước, giúp chúng có khả năng tự tích lũy trong pha nước như nhũ tương dầu-nước hoặc không khí-nước bằng cách giảm sức căng bề mặt của dầu [37]

Chất hoạt động bề mặt sinh học được sản xuất bởi một số vi khuẩn, phổ biến

nhất là các chủng Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Pseudomonas cepacia, Serratia arcescens, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus mycoides, Bacillus mojavensis, Acinetobacter bouvetii, v.v., và một số loại nấm Candida petrophilum, Candida lipolytica, Candida tropicalis, Penicillium sp., Aspergillus sp., v.v Các loại vi sinh vật khác nhau tạo ra các loại chất hoạt động bề

mặt sinh học khác nhau xét về đặc tính hóa học của chúng Tuy nhiên, hiệu quả của việc sản xuất chất hoạt động bề mặt sinh học phần lớn bị chi phối bởi các điều kiện tăng trưởng như nhiệt độ, độ pH, độ mặn, tốc độ khuấy trộn cũng như các thành phần môi trường như N, Fe, Mg, v.v [37]

Trong số tất cả các loại chất hoạt động bề mặt được báo cáo, sinh học phân tử

về sinh tổng hợp rhamnolipids qua trung gian Pseudomonas aeruginosa và tổng hợp Surfactin qua trung gian Bacillus subtilis đã được báo cáo lần đầu tiên [19] Ngoài ra,

sinh tổng hợp arthrofactin, iturin và lichenysin, lipid mannosylerythritol và emulsan

lần lượt được tổng hợp bởi Pseudomonas sp., Bacillus sp., Candida sp và Acinetobacter sp cũng được ghi chép đầy đủ Ví dụ, operon srfA bao gồm bốn khung đọc mở (ORF) là srfAA, srfAB, srfAC và srfAD, chịu trách nhiệm tổng hợp các gốc axit amin của Surfactin, trong khi sfp là gen cần thiết cho quá trình tổng hợp enzyme

chuyển hóa phosphopantetheinyl kích hoạt Surfactin bằng cách sửa đổi sau dịch mã [19]

1.3 Sử dụng chất phân tán sinh học nhằm xử lý mảng bám vi sinh trong công

nghiệp sản xuất giấy

Để giảm việc sử dụng chất diệt khuẩn hóa học nhằm kiểm soát mảng bám trong ngành công nghiệp giấy và bột giấy, chất phân tán sinh học được xem như một giải pháp sinh thái, thân thiện môi trường Chất này ngăn cản sự tái thiết lập màng sinh học từ chính nó bằng cách hòa tan và phân tán cặn lắng, nó hoạt động như chất thẩm thấu, mở màng sinh học và cho phép các chất diệt khuẩn xâm nhập vào exo-polysaccharides Công nghệ phân tán sinh học dựa trên các polyme không ion, nên chúng không ảnh hưởng đến tính anion của hệ thống và không ảnh hưởng đến các hóa chất sản xuất giấy khác Chúng không độc hại, không màu, không tạo bọt và không chứa dung môi hữu cơ Chất phân tán sinh học có thể hoạt động ở bất kỳ độ pH nào và có thể được sử dụng trong cả sản xuất giấy có tính axit và kiềm [61]

Các chương trình kiểm soát màng sinh học có thể được thực hiện hiệu quả hơn thông qua việc sử dụng các sản phẩm thẩm thấu/phân tán sinh học [10] Việc sử dụng chất phân tán sinh học trong các hoạt động làm sạch và khử trùng để nâng cao hiệu quả của chất diệt khuẩn oxy hóa được khuyến nghị trong hướng dẫn của Châu Âu về kiểm soát và phòng ngừa bệnh Legionnaire [38] Việc lựa chọn chất kháng khuẩn phù hợp có khả năng xuyên qua màng sinh học là vô cùng quan trọng khi xây dựng kế hoạch khử trùng [6] Việc sử dụng chất phân tán sinh học mang lại một phương pháp kiểm soát mảng bám hấp dẫn về mặt sinh thái, vì chúng loại bỏ hoặc giảm nhu cầu về chất diệt khuẩn Chất phân tán sinh học là các tác nhân hoạt động bề mặt không diệt khuẩn, có thể xâm nhập vào mạng lưới phức tạp của các chuỗi polyme tạo thành ma trận của EPS và tạo điều kiện thuận lợi cho các bề mặt phát triển [23] Chúng hòa tan và phân tán cặn lắng, ngăn cản màng sinh học tự tái thiết lập Điều này không chỉ hỗ trợ trong việc làm bong tróc màng sinh học mà còn giúp các vi sinh vật tiếp xúc với chất diệt khuẩn Chúng có thể được áp dụng liên tục hoặc định kỳ Chất phân tán sinh học đặc biệt hiệu quả khi xử lý các hệ thống có tổng lượng carbon hữu cơ cao và có xu hướng gây mùi hôi Những sản phẩm này thường được cho bổ sung trước khi cho chất diệt khuẩn Bổ sung liên tục ở mức độ thấp cũng có thể có hiệu quả Tuy

nhiên, trong một số trường hợp, điều này có thể không hiệu quả vì nó có thể không đạt đến ngưỡng nhất định cần thiết để tạo ra hiệu ứng mong muốn [38]

Các chất phân tán được phân loại theo tính chất ion của nhóm ưa nước, cụ thể là anion, cation, không ion và ion lưỡng cực [43] Các hợp chất này có cơ chế hoạt động khác nhau chống lại vi sinh vật Các chất phân tán anion (ví dụ alkyl và aryl sulfonate) làm giảm tính thấm của thành tế bào và có thể hòa tan toàn bộ màng tế bào, trong khi các chất phân tán cation (ví dụ các hợp chất amoni bậc bốn, cũng có thể có đặc tính diệt khuẩn) hấp phụ trên bề mặt màng tế bào và phản ứng hóa học với các ion tích điện âm liên kết với thành tế bào Các chất phân tán cũng có thể làm thay đổi tính chất bề mặt của bề mặt ngập nước bằng cách giảm sức căng bề mặt, do đó ngăn chặn sự bám dính của các sinh vật bám bẩn sinh học vào nền ngập nước hoặc thúc đẩy sự tách rời của các sinh vật này khỏi nền ngập Tính chất hóa học của các chất phân tán có thể được thiết kế để mang lại các đặc tính phân tán/hòa tan và nhũ hóa khác nhau cho sản phẩm, có thể làm xáo trộn màng sinh học, ổn định nhũ tương với các tế bào và các thành phần màng sinh học, đồng thời tạo thành lớp bảo vệ trên bề mặt kỵ nước làm trì hoãn sự gắn kết của màng sinh học Kết quả sử dụng kỹ thuật sàng lọc đơn giản chỉ ra rằng chất phân tán không ion hoạt động hiệu quả hơn chất phân tán anion hoặc cation [38]

Chất phân tán không tiêu diệt hoặc thậm chí không phải lúc nào cũng ức chế sự phát triển của vi sinh vật Do đó, liều lượng hoặc đánh giá tác dụng của chúng không thể dựa trên số lượng tế bào trong nước tuần hoàn và cần phải có các phương

pháp hiệu quả mới để đánh giá hiệu quả của chúng trong điều kiện nhà máy [10]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu và phạm vi nghiên cứu

- Vật liệu nghiên cứu: Bộ sưu tập 31 chủng vi khuẩn phân lập từ cây dương xỉ,

tại mỏ Núi Pháo, Đại Từ, Thái Nguyên, được lưu giữ tại phòng Vi sinh vật Đất, Viện Công nghệ Sinh học

- Phạm vi nghiên cứu: mảng bám (slime) tại nhà máy giấy Mục Sơn, tỉnh Thanh

Hoá

Hình 2 1 Mảng bám (slime) tại nhà máy giấy Mục Sơn, Thanh Hoá

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp sàng lọc, tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh tổng hợp chất

phân tán sinh học

Vi khuẩn được nuôi cấy hiếu khí trong ống nghiệm với môi trường muối khoáng chứa (g/L): 1,0 K2HPO4, 0,2 MgSO4.7H2O, 0,05 FeSO4.7H2O, 0,1 CaCl2.2H2O, 0,001 Na2MoO4.2H2O, 30 NaCl và dầu oliu (1% w/v) Các ống nuôi cấy được duy trì trong máy lắc trong 7 ngày ở tốc độ 200 vòng/phút và 30ºC Sau 7 ngày ủ, dịch nuôi cấy từ mỗi ống được ly tâm ở tốc độ 13000 vòng/phút trong 15 phút và phần nổi phía trên được lọc qua giấy lọc cỡ lỗ 0,45µm (Millipore) Môi trường nuôi cấy không có tế bào này được sử dụng để kiểm tra một số hoạt tính chất phân tán thu nhận [54]

2.2.2 Phương pháp thu hồi chất phân tán sinh học thô

Chất phân tán sinh học tạo ra bởi vi sinh vật được thu hồi từ bề mặt nuôi cấy sau khi loại bỏ các tế bào bằng cách ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 15 phút, sau đó được kết tủa bằng cách axit hóa phần nổi phía trên bằng HCl 6N ở pH 2 và để kết tủa hình thành ở 4ºC qua đêm Kết tủa thu được được ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 15 phút, được sử dụng làm chất phân tán sinh học thô [55]

2.2.3 Phương pháp kiểm tra hoạt tính chất phân tán sinh học

 Hoạt tính tan huyết

Chất hoạt động bề mặt sinh học có thể gây ly giải hồng cầu Nguyên tắc này được sử dụng cho xét nghiệm tan huyết được phát triển bởi Mulligan và cộng sự (1984) [52, 15] Chủng vi sinh vật được cấy trên đĩa thạch chứ 5% máu cừu và ủ trong 2 ngày ở 25°C Các chủng dương tính sẽ gây ly giải tế bào máu và tạo ra một vòng trong suốt, không màu xung quanh khuẩn lạc (Hình 2.2)

Hình 2 2 Pseudomonas aeruginosa sinh trưởng trên môi trường thạch máu, sự ly giải hồng cầu được biểu thị bằng các vùng ly giải xung quanh khuẩn lạc [84]

 Phương pháp đĩa thạch xanh CTAB

Phương pháp đĩa thạch CTAB là một xét nghiệm bán định lượng để phát hiện glycolipid ngoại bào hoặc các chất hoạt động bề mặt anion khác Nó được phát triển bởi Siegmund và Wagner (1991) [72] Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trên đĩa thạch muối khoáng màu xanh nhạt chứa chất hoạt động bề mặt cation cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) và thuốc nhuộm cơ bản xanh methylene Nếu chất hoạt động bề mặt anion được tiết ra bởi vi khuẩn phát triển trên đĩa, chúng sẽ tạo thành cặp ion màu xanh đậm, không hòa tan với cetyltrimethylammonium bromide và xanh methylene Do đó, các khuẩn lạc có phản ứng được bao quanh bởi quầng sáng màu xanh đậm (Hình 2.3)

Hình 2 3 Pseudomonas sp nuôi cấy trên môi trường thạch CTAB, quầng sáng màu xanh đậm xung quanh 4 khuẩn lạc cho thấy sự sản xuất chất HĐBM sinh học [84]

 Hoạt tính lan truyền dầu

Phương pháp được mô tả theo Nayarisseri và cộng sự (2018) có cải tiến 20 ml nước cất được thêm vào đĩa Petri, sau đó thêm 40 µl dầu thô lên bề mặt nước Sau đó, nhỏ 20 µl môi trường nuôi cấy không có tế bào lên bề mặt dầu thô Nếu chất hoạt động bề mặt sinh học có mặt trong môi trường, dầu sẽ bị dịch chuyển và vùng làm sạch được hình thành Đường kính của vùng làm sạch này trên bề mặt dầu tương quan với hoạt động của chất hoạt động bề mặt, còn được gọi là hoạt động dịch chuyển dầu Đường kính của vùng làm sạch trên bề mặt dầu được đo và so sánh với 20 µl nước

cất làm đối chứng âm [54]

 Hoạt tính tan dầu

2 µl dầu thô được thêm vào các vùng giếng được phân định trên nắp của các đĩa 96 giếng và giữ cần bằng trong 1 giờ Sau đó, thêm 5 µl môi trường nuôi cấy không có tế bào vào bề mặt dầu Hình thái giọt dầu được kiểm tra sau 1 phút Kết quả được coi là dương tính đối với việc sản xuất chất phân tán sinh học khi giọt nước phẳng và những mẫu có giọt tròn được cho là âm tính, cho thấy không sản xuất chất phân tán sinh học [89] Thử nghiệm này dựa vào sự mất ổn định của các giọt chất lỏng bởi chất hoạt động bề mặt Nếu chất lỏng không chứa chất hoạt động bề mặt, các phân tử nước phân cực sẽ bị đẩy ra khỏi bề mặt kỵ nước và các giọt vẫn ổn định Nếu chất lỏng chứa chất hoạt động bề mặt, các giọt sẽ lan rộng hoặc thậm chí sụp đổ do lực hoặc sức căng bề mặt giữa giọt chất lỏng và bề mặt kỵ nước bị giảm Độ ổn định của giọt phụ thuộc vào nồng độ chất hoạt động bề mặt và tương quan với sức căng bề mặt và bề mặt tiếp xúc

 Hoạt tính nhũ tương

Hỗn hợp của 2 ml môi trường nuôi cấy không có tế bào và 2 ml Hexan được xoáy ở tốc độ cao trong 2 phút Hoạt độ nhũ tương được đo sau 24 giờ ủ và được tính bằng cách chia chiều cao của lớp nhũ tương cho tổng chiều cao của hỗn hợp và nhân với 100 [65]

 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế hình thành mảng bám thông qua định lượng biofilm

Định lượng khả năng sản sinh biofilm được thực hiện trên đĩa 96 giếng [77] Vi khuẩn sinh mảng bám được nuôi trên đĩa nhựa vô trùng 96 giếng ở 37°C, mỗi giếng chứa 250 µl dịch nuôi lỏng Sau 24 giờ nuôi cấy, bổ sung thêm 50 µl chất phân tán thô thu nhận từ chủng tuyển chọn (nồng độ 0,25 g/ml) và ủ ở 37°C trong vòng 48 giờ Rửa trôi vi khuẩn không bám vào thành/đáy đĩa bằng PBS 1X và nhuộm biofilm bằng 300 µl dung dịch tím kết tinh 1% trong 10 phút ở nhiệt độ phòng Rửa sạch dung dịch tím kết tinh dư bằng nước, sau đó bổ sung 300 µl methanol và đo mật độ quang ở bước sóng 600 nm Mẫu đối chứng không bổ sung chất phân tán sinh học Sự ức chế khả năng hình thành mảng bám được đánh giá thông qua tỷ lệ % giá trị OD giảm so với mẫu đối chứng

2.2.4 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại vi sinh vật theo

16S rDNA

 Nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy và hình thái tế bào

Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường LB, điều kiện nuôi cấy ở 37oC Sau 48h, quan sát hình thái khuẩn lạc và khả năng sinh sắc tố của các chủng vi khuẩn Tế bào vi khuẩn trong dịch nuôi cấy được cố định trên tiêu bản để nhuộm Gram và quan sát hình dạng tế bào dưới kính hiển vi quang học [79]

Cách tiến hành nhuộm Gram: + Làm tiêu bản vi sinh vật + Cố định vết bôi

+ Nhuộm bằng tím gential (gential violet) Giữ trong 1 - 2 phút + Đổ hết thuốc nhuộm đi, nhỏ dung dịch Lugol lên tiêu bản và giữ trong 1 phút

+ Loại bỏ thuốc nhuộm rồi nhúng vào cồn 95ºC trong 30 - 40 giây

+ Rửa lại bằng nước + Làm khô vết bôi + Nhuộm bổ sung bằng Safranin O loãng trong 1 - 2 phút + Rửa lại bằng nước sau đó để khô tự nhiên và quan sát dưới kinh hiển vi quang học (x1000) qua đó có thể biết hình thái tế bào và nhóm vi sinh vật: Nếu là chủng Gram (+) sẽ có màu tím, chủng Gram (-) có màu hồng

 Nghiên cứu đặc điểm sinh lý-hóa

Vi khuẩn được nuôi trên môi trường LB ở nhiệt độ trong dải từ 10÷55ºC, pH từ 4÷11, nồng độ muối từ 0÷12% Khả năng đồng hóa các nguồn đường và sinh enzyme ngoại bào được đánh giá theo Phan Thị Hồng Thảo (2016) [79]

Khả năng chịu muối: Môi trường LB có bổ sung thêm NaCl với các nồng độ:

0; 5; 7; 10; 12 (%) Nuôi lắc vi khuẩn 200 vòng/phút ở 37ºC Sau 48h thu dịch và tiến hành xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn

Khả năng chịu nhiệt: Trên môi trường thạch LB, chủng vi khuẩn được nuôi

cấy ở các nhiệt độ: 10, 20, 30, 37, 45, 55ºC Sau 48h đánh giá khả năng sinh trưởng của vi khuẩn

Khả năng chịu pH: Chủng vi khuẩn lựa chọn được nuôi cấy trên môi trường

LB ở các pH 4 đến 11 ở điều kiện nhiệt độ 37ºC, nuôi lắc ở 200 vòng/phút Sau 48h đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn

Khả năng sử dụng nguồn đường: Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường

ISP9 có bổ sung thêm 1% các nguồn đường tương ứng: glucose, L-arabinose, xylose, D-manitolse, D-maltose, lactose, D-fructose, D-raffinose và sucrose Kiểm tra sinh trưởng sau 24 – 48 giờ ở nhiệt độ 28-30ºC Môi trường có glucose được coi là đối chứng dương, môi trường không có đường được coi là đối chứng âm

D-Khả năng sinh enzyme ngoại bào: Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường

LB Sau đó, ly tâm thu dịch, nhỏ dịch nuôi cấy không chứa tế bào vào các các lỗ trên

đĩa Petri chứa môi trường Gause I có bổ sung các cơ chất đặc hiệu (1%): tinh bột để xác định hoạt tính amylase, casein để xác định hoạt tính protease, CMC để xác định hoạt tính CMCase, cellulose để xác định hoạt tính cellulase Sau 2 ngày ở 28ºC, xác định khả năng sinh tổng hợp amylase bằng thuốc thử Lugol, protease bằng thuốc thử tricloacetic, CMCase và cellulase bằng Congo đỏ Khả năng sinh enzyme được xác định bằng giá trị D-d (mm), trong đó D là đường kính vòng phân hủy cơ chất, d là đường kính khuẩn lạc

 Phân tích trình tự gen 16S rDNA

Tách chiết DNA tổng số bằng KIT NucleoSpin® Tissue (Germany)

Trong nghiên cứu này, DNA tổng số của vi sinh vật tuyển chọn được tách chiết theo các bước sau:

Bước 1: Thu sinh khối và bổ sung đệm TE 1X, vontex đều, sau đó ly tâm 8000 vòng/phút trong 5 phút, lặp lại 3 lần Sau đó giữ lại phần kết tủa và 100 µl dịch

Bước 2: Bổ sung 300 µl lysis, ủ ở 65ºC trong 7 phút Bước 3: Bổ sung 400 µl precipitation, sau đó ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 5 phút, loại dịch

Bước 4: Bổ sung 500 µl washing 3 (búng đều), ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút, loại dịch

Bước 5: Bổ sung 200 µl dung dịch washing 4 vontex, sau đó ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút, loại dịch Sau đó làm khô bằng máy quay khô

Bước 6: Bổ sung 100 µl rRNA ủ ở 55ºC trong 10 phút, sau đó lý tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút Sau đó, thu dịch

Sau đó, sản phẩm DNA tổng số được tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 1%

Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose

- Chuẩn bị gel agarose: cân 1 g agarose (gel 1%) cho vào 100 ml dung dịch

đệm TAE 1X Đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn Để nguội xuống khoảng 50oC, bổ sung thuốc nhuộm RedSafe nồng độ 20 µl/L rồi đổ dung dịch agarose vào khay điện di có cài sẵn lược Sau khoảng 30 phút, gỡ lược ra và đặt bản gel vào bể điện di Đổ đệm TAE 1X vào bể để dung dịch ngập cách mặt gel 1 – 2 mm

- Tra mẫu DNA: Lấy khoảng 5 µl mẫu DNA trộn với 1 µl đệm màu loading dye (chất này vừa có tác dụng tạo màu để quan sát, vừa có tác dụng giúp cho mẫu DNA lắng xuống đáy giếng trước khi chạy điện di) và tra vào các giếng nhỏ trong gel Sử dụng marker thang chuẩn 100 bp hoặc 1kb tùy thuộc vào kích thước đoạn nhân để làm chỉ thị phân tử

- Chạy điện di ở hiệu điện thế 90V trong 30 phút DNA di chuyển từ cực âm đến cực dương Sau đó lấy bản gel ra quan sát và chụp ảnh dưới ánh sáng tia tử ngoại của máy soi chụp gel (Bio – Rad)

PCR nhân gen 16S rDNA

Gen mã hóa 16S rDNA của chủng vi khuẩn được khuếch đại bằng phản ứng PCR từ DNA tổng số sử dụng cặp mồi 27F và 1492R (Bảng 2 1)

Bảng 2 1 Trình tự đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng PCR gen 16S rDNA

Tên đoạn mồi Trình tự mồi

Nước deion 4 µl

- Phản ứng PCR được thực hiện theo chu trình (Bảng 2 2):

Bảng 2 2 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

2.2.5 Phương pháp lựa chọn điều kiện môi trường lên men thích hợp

 Xác định môi trường thích hợp

Chủng vi khuẩn được lên men trong các môi trường khác nhau:

- Môi trường 1 (g/L): K2HPO4 1, MgSO4.7H2O 0,2, FeSO4.7H2O 0,05, CaCl2

0,1, Na2MoO4.7H2O 0,001, NaCl 30; Glucose 10, Pepton 5, dầu oliu 1%; pH 7

- Môi trường 2 (g/L): Glucose 40, NH4NO3 4, KH2PO4 4,08, Na2HPO4 7,12, MgSO4 0,2, CaCl2 0,008, FeSO4 0,0011, EDTA 0,0012, dầu oliu 1%; pH 7

- Môi trường 3 (g/L): NaNO3 1; KH2PO4 0,1; MgSO4.7H2O 0,1; CaCl2 0,1; Cao nấm men 0,2, dầu oliu 3%; pH 7

- Môi trường 4 (g/L): NH4Cl 2, KH2PO4 5, Na2HPO4 4, MnSO4 0,2, MgSO4 0,2, FeCl3 0,05, CaCl2 0,001, dầu oliu 1%; pH 7

- Môi trường 5 (g/L): Cellulose 10, Cao nấm men 2, NaCl 10, dầu oliu 1%; pH

7

Sau 7 ngày ủ, dịch nuôi cấy từ mỗi môi trường được ly tâm ở tốc độ 13000 vòng/phút trong 15 phút và thu phần nổi phía trên Môi trường nuôi cấy không có tế bào này được sử dụng để kiểm tra một số hoạt tính chất phân tán thu nhận

 Xác định thời gian lên men

Chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong 7 ngày ở 37ºC, 180 vòng/phút trên môi trường lên men thích hợp Các mẫu nuôi cấy được lấy theo thời gian từ 2 ngày đến 7 ngày Dịch nuôi cấy từ mỗi môi trường được ly tâm ở tốc độ 13000 vòng/phút trong 15 phút và thu phần nổi phía trên Môi trường nuôi cấy không có tế bào này được sử dụng để kiểm tra một số hoạt tính chất phân tán thu nhận

 Xác định nguồn cacbon và nitơ

Chủng vi khuẩn được lên men trong môi trường thích hợp có bổ sung 1% nguồn cacbon (glucose, saccarose, glycerol, tinh bột tan, rỉ đường) và 0,5% nguồn nitơ (pepton, cao nấm men, khô đậu tương, urê) với tỷ lệ 1% giống Sau thời gian ủ thích hợp, dịch nuôi cấy từ mỗi môi trường được ly tâm ở tốc độ 13000 vòng/phút trong 15 phút và thu phần nổi phía trên Môi trường nuôi cấy không có tế bào này được sử dụng để kiểm tra một số hoạt tính chất phân tán thu nhận

 Xác định chất cảm ứng

Chủng vi sinh được lên men trong các môi trường thích hợp có bổ sung 1% chất cảm ứng (dầu ăn, dầu oliu, tween 80) hoặc 0,05 g/L EDTA với tỷ lệ 1% giống Sau thời gian ủ thích hợp, dịch nuôi cấy từ mỗi môi trường được ly tâm ở tốc độ 13000 vòng/phút trong 15 phút và thu phần nổi phía trên Môi trường nuôi cấy không có tế bào này được sử dụng để kiểm tra một số hoạt tính chất phân tán thu nhận

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Sàng lọc và tuyển chọn vi sinh vật sinh tổng hợp chất phân tán sinh học

3.1.1 Sàng lọc chủng vi khuẩn sinh tổng hợp chất phân tán sinh học

Từ 31 chủng vi khuẩn phân lập từ cây dương xỉ, được nuôi cấy trên môi trường lên men lỏng +1% dầu oliu Sau 7 ngày nuôi cấy, các chủng được thu hồi dịch và tiến hành kiểm tra một số hoạt tính của chất phân tán Các hóa chất có bản chất hoạt động bề mặt được kiểm tra làm đối chứng dương

Bảng 3 1 Bảng số liệu sàng lọc chủng sinh tổng hợp chất phân tán sinh học

STT Chủng Hoạt tính phân

tán dầu (mm)

Hoạt tính tan huyết

Phản ứng trên môi trường bổ sung xanh methylen