Nghiên cứu Ứng dụng vi sinh vật bản Địa Để xử lý rơm rạ tại Đồng ruộng làm phân hữu cơ

Nghiên cứu Ứng dụng vi sinh vật bản Địa Để xử lý rơm rạ tại Đồng ruộng làm phân hữu cơ Nghiên cứu Ứng dụng vi sinh vật bản Địa Để xử lý rơm rạ tại Đồng ruộng làm phân hữu cơ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

Đoàn Tuấn Anh

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI SINH VẬT BẢN ĐỊA ĐỂ XỬ LÝ RƠM RẠ TẠI ĐỒNG RUỘNG LÀM PHÂN HỮU CƠ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2023

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

Đoàn Tuấn Anh

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI SINH VẬT BẢN ĐỊA ĐỂ XỬ LÝ RƠM RẠ TẠI ĐỒNG RUỘNG LÀM PHÂN HỮU CƠ

Chuyên ngành: Khoa học môi trường Mã số: 8440301.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS.TS Nguyễn Kiều Băng Tâm 2 TS Lương Hữu Thành

Hà Nội - 2023

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu thực tế của cá nhân tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Nguyễn Kiều Băng Tâm và TS Lương Hữu Thành

Trong luận văn, những thông tin tham khảo từ những công trình nghiên cứu khác đã được tác giả chú thích rõ nguồn

Các số liệu, những kết luận nghiên cứu được trình bày trong luận văn này là trung thực và chưa từng được công bố dưới bất cứ hình thức nào Tôi xin chịu trách nhiệm về công trình nghiên cứu của mình

Hà Nội, ngày tháng năm 2024

HỌC VIÊN

Đoàn Tuấn Anh

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Kiều Băng Tâm và TS Lương Hữu Thành đã hướng dẫn, quan tâm và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong Khoa Môi trường - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội nói chung và Bộ môn Sinh thái Môi trường nói riêng đã giảng dạy và trang bị cho em những kiến thức quý giá trong suốt khóa học

Em xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã luôn chia sẻ, ủng hộ và động viên em trong suốt thời gian qua

Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Hội đồng khoa học

đã tạo điều kiện để em bảo vệ luận văn này

Học viên

Đoàn Tuấn Anh

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 6

1 Tính cấp thiết của đề tài 6

2 Mục tiêu của đề tài 7

3 Nội dung nghiên cứu 7

Chương 1 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 8

1.1 Tổng quan về nguyên liệu rơm rạ 8

1.1.1 Hiện trạng sản xuất lúa và sử dụng rơm rạ 8

1.1.2 Thành phần, cấu trúc của rơm rạ 9

1.1.3 Hiện trạng sử dụng rơm rạ trên địa bàn Hà Nội 11

1.2 Tổng quan về vi sinh vật 14

1.3 Tổng quan về phân hữu cơ 18

1.4 Nghiên cứu ứng dụng công nghệ vi sinh trong xử lý phụ phẩm nông nghiệp 20

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu đất 23

2.2.2 Phương pháp phân lập xạ khuẩn 23

2.2.3 Phương pháp tuyển chọn chủng xạ khuẩn có hoạt tính cao 25

2.2.4 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái 25

2.2.5 Phương pháp xác định đặc điểm sinh hóa 26

2.2.6 Phương pháp định danh của chủng xạ khuẩn được chọn 26

2.2.7 Phương pháp xác định độ an toàn của chủng xạ khuẩn được lựa chọn 27

2.2.8 Phương pháp xác định khả năng tồn tại và sống sót của các chủng trong điều kiện hỗn hợp 28

2.2.9 Phương pháp xác định thành phần dinh dưỡng trong sản phẩm sau khi ủ 29

2.2.10 Phương pháp thu thập tài liệu 29

2.2.11 Phương pháp xử lý số liệu 29

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật 30

3.3 Kết quả đánh giá hoạt tính cellulose 32

3.2 Kết quả phân lập vi sinh vật có hoạt tính cellulose 34

3.4 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng được chọn 36

3.5 Kết quả định danh của chủng bằng phương pháp sinh học phân tử 40

3.6 Đánh giá độ an toàn của chủng vi sinh vật được lựa chọn 46

3.7 Xác định khả năng tồn tại và sống sót của các chủng trong điều kiện hỗn hợp 47

3.8 Xác định thành phần dinh dưỡng trong sản phẩm sau khi ủ 48

CTRNN Chất thải rắn nông nghiệp

PPPNN Phế phụ phẩm nông nghiệp

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.2 Hàm lượng tiêu chuẩn các nguyên tố dinh dưỡng trong nguyên liệu hữu

cơ 19

Bảng 3.1 Địa điểm và số mẫu thu thập 30

Bảng 3.2 Các chủng xạ khuẩn được phân lập trên các mẫu đất tại Hà Nội 30

Bảng 3.3 Vòng phân giải của 37 chủng đã phân lập 35

Bảng 3.4 Đặc điểm sinh hoá của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu 40

Bảng 3.5 Độ an toàn của các chủng vi sinh vật 46

Bảng 3.6 Khả năng tồn tại của các chủng vi sinh vật 47

Bảng 3.7 Hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật trong điều kiện hỗn hợp sau 1 tháng bảo quản 48

Bảng 3.8 Chất lượng rơm rạ sau xử lý ở các công thức thí nghiệm 49

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc của lignocellulose 9

Hình 1.2 Công thức hóa học và cấu trúc không gian của cellulose 10

Hình 1.3 Cấu trúc và thành phần của hemicellulose 10

Hình 1.4 a – Cấu trúc tổng quát lignin; b – Các đơn vị cơ bản của lignin 11

Hình 1.5 Khảo sát hiện trạng đốt rơm rạ trên địa bàn thành phố Hà Nội năm 2019 12

Hình 3.1 Hình ảnh khuẩn lạc xạ khuẩn được phân lập 32

Hình 3.2 Vòng phân giải của một số chủng xạ khuẩn đã phân lập 33

Hình 3.3 Vòng phân giải của 3 chủng xạ khuẩn đã phân lập 34

Hình 3.4 Hình thái cấu trúc sợi và bào tử chủng xạ khuẩn ĐT9-1 37

Hình 3.5 Hình thái cấu trúc sợi và bào tử chủng xạ khuẩn ĐT9-1 37

Hình 3.6 Khuẩn lạc chủng xạ khuẩn TL3-4 38

Hình 3.7 Hình thái cấu trúc sợi và bào tử chủng xạ khuẩn TL3-4 38

Hình 3.8 Đặc điểm khuẩn lạc chủng ML7-2 39

Hình 3.9 Hình thái cấu trúc sợi và bào tử của chủng xạ khuẩn ML7-2 39

Hình 3.10 Vị trí phân loại của chủng ĐT 9-1 với các loại có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự 16S rDNA 42

Hình 3.11 Vị trí phân loại của chủng TL 3-4 với các loại có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự 16S rDNA 44

Hình 3.12 Vị trí phân loại của chủng ML 7-2 với các loại có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự 16S rDNA 46

Hình 3.13 Nhiệt độ tối đa ở các công thức thí nghiệm 49

Hình 3.14 Biểu đồ thể hiện giá trị hàm lượng chất hữu cơ trong sản phẩm rơm rạ sau xử lý 51

Hình 3.15 Rơm rạ sau xử lý ở 2 công thức thí nghiệm tại xã Hương Ngải, huyện Thạch Thất 52

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Việt Nam là một trong số các quốc gia có nền nông nghiệp phát triển hàng đầu thế giới trong đó chiếm tỷ trọng cao nhất trong cơ cấu nông nghiệp của Việt Nam chính là cây lúa Sự phổ biến của các ruộng lúa trên cả nước khiến sau mỗi vụ thu hoạch thì lượng rơm rạ phát sinh cũng là con số khổng lồ Đối với rơm rạ sau mỗi vụ mùa, người nông dân thường đốt trực tiếp tại đồng ruộng nhằm giải quyết nhanh rơm rạ và đồng thời trả lại một phần dinh dưỡng cho đất thông qua việc bón tro đốt, ngoài ra một phần đáng kể rơm rạ cũng được sử dụng như là một loại chất đốt ở nông thôn, rất ít rơm rạ được ủ làm phân và làm thức ăn cho gia súc Việc đốt rơm rạ tại đồng ruộng hay làm chất đốt sử dụng trong bếp của người nông dân đã có từ lâu đời tại nước ta tuy nhiên đi cùng với sự gia tăng ngày một nhiều của các ruộng lúa, việc đốt rơm rạ dần lộ ra nhiều vấn đề môi trường nghiêm trọng

Việc đốt rơm rạ tại ruộng đồng thường xuyên làm phá hủy nghiêm trọng hệ sinh thái sinh vật và vi sinh vật trong đất ngoài ra nó cũng làm cho đất trở nên chai, cứng hơn, khó canh tác hơn Việc đốt một lượng lớn rơm rạ trong một thời điểm làm phát sinh rất nhiều khói bụi đặc biệt là CO và CO2 vào không khí Lượng khói bụi khổng lồ này có thể góp phần làm thay đổi điều kiện môi trường và khí hậu của địa phương, gây ra các hiện tượng như sương mù quang hóa hay mưa axit, tác động lên nhiều loài sinh vật và quan trọng nhất là ảnh hưởng lớn tới sức khỏe con người

Ở khía cạnh môi trường, phế phụ phẩm nông nghiệp là một nguồn tài nguyên Việc đốt rơm rạ trên đồng ruộng đang dần hình thành một thói quen xấu, không những gây ảnh hưởng tới hệ sinh thái mà còn rất lãng phí nguồn nguyên liệu có nguồn gốc thực vật này Do vậy, việc sử dụng rơm rạ làm phân hữu cơ là giải pháp tối ưu hiện nay vì vừa giảm chất thải lại vừa tận dụng để làm phân hữu cơ cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng Thành phần chủ yếu của rơm rạ gồm có Cellulose, Hemicellulose và Lignin Cellulose là nhóm hợp chất cao phân tử rất bền vững Chúng chỉ bị phân giải dưới tác dụng của axit và kiềm đặc hoặc dưới tác dụng của một hệ thống các enzyme Cellulase do vi sinh vật sinh ra Qua nhiều nghiên cứu ở

Việt Nam và trên thế giới cho thấy các phương pháp vật lý và hóa học dùng để phân hủy cellulose rất phức tạp và tốn kém Việc xử lý rơm rạ bằng công nghệ vi sinh, đặc biệt sử dụng các enzyme cellulase, peroxidase ngoại bào từ vi sinh vật đem lại rất nhiều lợi ích Các loài vi sinh vật này đều có sẵn trong tự nhiên không những thế số lượng của chúng cũng rất phong phú

Vì vậy việc lựa chọn và thực hiện đề tài “Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật bản địa để xử lý rơm rạ tại đồng ruộng làm phân hữu cơ” là cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn nhằm góp phần kiểm soát và giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường trong việc xử lý rơm rạ sau thu hoạch và đồng thời cũng tạo ra nguồn phân bón trả lại chất dinh dưỡng cho đất

2 Mục tiêu của đề tài

- Tuyển chọn và nghiên cứu khả năng sử dụng nguồn vi sinh vật bản địa có khả năng phân hủy rơm rạ tạo nguồn phân bón hữu cơ trả lại dinh dưỡng cho đất

3 Nội dung nghiên cứu

- Thu thập mẫu đất và phân lập các chủng vi sinh vật - Tuyển chọn các chủng có hoạt tính phân giải cellulose - Xác định đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hoá của các chủng lựa chọn - Xác định vị trí phân loại của các chủng lựa chọn

- Đánh giá độ an toàn của các chủng lựa chọn - Xác định khả năng tồn tại và sống sót của các chủng trong điều kiện hỗn hợp - Xác định thành phần dinh dưỡng trong sản phẩm sau khi ủ

Chương 1 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan về nguyên liệu rơm rạ

1.1.1 Hiện trạng sản xuất lúa và sử dụng rơm rạ

Ở Việt Nam hiện nay thì ngành trồng lúa gạo là ngành chủ lực trong phần trăm cơ cấu cây trồng và phân công lao động xã hội ở nước ta[18] Việt Nam có một thế mạnh về sản xuất lúa gạo và là một trong những nước xuất khẩu gạo đứng đầu trên thế giới [2], vì thế lúa gạo còn có vai trò to lớn trong việc thu ngoại tệ về cho đất nước và đảm bảo an ninh lương thực

Trước đây rơm rạ được coi là một loại sản phẩm phụ hữu ích thu hoạch được: chất đốt, lợp nhà, thức ăn cho gia súc, vật che phủ cho trồng trọt Nhưng do nhu cầu về lương thực mà sản lượng lúa ngày càng gia tăng, cùng với đó là nguồn rơm rạ không thể tận dụng hết, nên rơm rạ đã trở thành một nguồn phế thải khó xử lý trong nông nghiệp

Các hình thức sử dụng rơm phổ biến bao gồm [31]: - Sử dụng rơm tại ruộng: vùi gốc rạ, phủ rơm, ủ phân rơm, đốt đồng - Mang rơm ra khỏi ruộng: làm thức ăn chăn nuôi, chất đốt, khí hóa, biogas, làm chất đốt dạng lỏng, vật liệu xây dựng, sản xuất giấy, chống sạt lở, trồng nấm,…

Sử dụng rơm rạ tại ruộng

- Vùi gốc rạ: Rơm bị mục nát và phân hủy khi có sự có mặt của độ ẩm và oxy Rơm sẽ phân hủy nhanh hơn khi được vùi trong đất có độ ẩm khoảng 60% và nhiệt độ trên 250C Trong điều kiện hiếu khí (aerobic), vi khuẩn phân hủy rơm thành chất hữu cơ, khoáng và CO2

- Phủ rơm: Rơm có thể dùng để phủ cho lúa hoặc các loại cây trồng khác Việc phủ rơm có thể làm giảm bốc hơi nước từ đất, làm tăng lượng nước thấm vào đất (giữ nước) và bảo vệ đất không bị xói mòn (đặc biệt ở vùng đất dốc) Lớp rơm có tác dụng làm giảm bốc hơi nước nhiều hơn làm xói mòn đất

- Ủ phân rơm: Bón phân rơm làm tăng việc tái sử dụng chất dinh dưỡng có trong rơm, cung cấp lại cho đồng ruộng Với 1 tấn rơm (trọng lượng khô) trả lại cho

đất, có khoảng 5 – 8 kg N; 0.5 – 1 kg P; 13 – 20 kg K; 0.5 – 1 kg S; 0.3 – 1.7 kg Ca và 1.5 – 1.6 kg Mg Để rút ngắn thời gian ủ phân bón lại cho đất, nhiều nghiên cứu về ủ rơm có sự trợ giúp của nấm Trichoderma sp đang được nghiên cứu và áp dụng tại Philippines, Ấn Độ và Việt Nam [9] [10] Với cách ủ này, thời gian ủ để rơm hoai mục rút ngắn còn 30 – 36 ngày

- Đốt đồng: Đốt đồng được nông dân xem là biện pháp ít chi phí nhất đối với hộ nông dân trong các hình thức quản lý và sử dụng rơm Khi đốt rơm, nhiều khí thải phát sinh làm ô nhiễm môi trường không khí như bụi, CO, CH4, H2, HCl, poly aromatic hydrocacbons (PAH), NO và sợi silica (biogenic silica fibres) kéo dài thời gian phát thải các khí trên vào không khí có thể gây nguy hiểm đến sức khỏe cộng đồng

1.1.2 Thành phần, cấu trúc của rơm rạ

Rơm là các thân cây khô của cây ngũ cốc, sau khi đã thu hoạch các hạt Thành phần hóa học của rơm rạ tính theo khối lượng khô gồm cellulose – 60%, lignin 14%, protein – 3,4%, lipid – 1,9% Nếu tính theo nguyên tố thì C chiếm 44%, H – 5%, oxy – 49%, N khoảng 0,92%, một lượng nhỏ photpho, lưu huỳnh và kali Rơm rạ được coi là một dạng vật liệu lignocellulose [5]

Cấu trúc của lignocellulose được miêu tả như sau:

Hình 1.1 Cấu trúc của lignocellulose [5]

Thành phần chính của vật liệu lignocellulose là cellulose, hemicellulose, lignin, các chất trích ly và tro; trong đó, thành phần cellulose chiếm chủ yếu

- Cellulose là loại polymer phổ biến nhất trên trái đất, là một polymer mạch thẳng của d-glucose, các d-glucose được liên kết với nhau bằng liên kết β,1-4 glucosid [27]

Hình 1.2 Công thức hóa học và cấu trúc không gian của cellulose [41]

- Hemicellulose là một loại polymer phức tạp chứa cả đường 6 gồm glucose, mannose và galactose và đường 5 gồm xylose và arabinose [36] Thành phần cơ bản của hemicellulose là β-d xylopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết β-(1,4) [38]:

Hình 1.3 Cấu trúc và thành phần của hemicellulose [37]

- Lignin là một loại polyphenol có cấu trúc mở Trong tự nhiên, lignin chủ yếu đóng vai trò chất liên kết trong thành tế bào thực vật, liên kết chặt chẽ với mạng cellulose và hemicellulose [12]

Hình 1.4 a – Cấu trúc tổng quát lignin; b – Các đơn vị cơ bản của lignin [12]

1.1.3 Hiện trạng sử dụng rơm rạ trên địa bàn Hà Nội

Tại thành phố Hà Nội tỷ lệ đốt rơm rạ ở các huyện trung bình khoảng 20% tổng lượng rơm rạ phát sinh sau vụ đông xuân 2021 (hơn 710.676 tấn rơm rạ tươi) Nhiều huyện có tỷ lệ đốt rơm rạ cao như: Gia Lâm, Thường Tín, Thạch Thất, Chương Mỹ, Đan Phượng, Hoài Đức, Quốc Oai Trong đó, xã Đắc Sở (huyện Hoài Đức) và Liệp Tuyết (huyện Quốc Oai) với tỷ lệ đốt rơm rạ cao nhất của các huyện này [5, 6], trong khi xã Thọ Xuân (huyện Đan Phượng) là 1 trong 2 điểm thực hiện mô hình “Cánh đồng không đốt rơm rạ” từ vụ xuân năm 2017 đến hết năm 2018 tại thành phố Hà Nội [13, 23],

Năm 2019 theo kết quả điều tra khảo sát thực tế của trưởng ĐH Khoa học Tự Nhiên- ĐHQGHN, hiện trạng sử dụng rơm rạ trên địa bàn ngoại thành thành phố Hà Nội như sau [8]:

- Tỉ lệ rơm rạ dùng để đun nấu trong gia đình là thấp nhất khoảng 1%; - Một phần rơm rạ được đốt cháy trong thôn làng chiếm 2%;

- Rơm rạ được sử dụng làm thức ăn gia súc chiếm 5%; - Rơm rạ đã được chôn vùi trong đất cho vụ tiếp theo và đốt rơm rạ ngoài

đồng ruộng chiếm lượng khá lớn (44%) - Các mục đích khác như vùi trong đất, che phủ các loại cây trồng, trồng

nấm chiếm 48%

Hình 1.5 Khảo sát hiện trạng đốt rơm rạ trên địa bàn thành phố Hà Nội

năm 2019 [8]

Tỷ lệ đốt rơm rạ ngoài đồng ruộng chiếm dưới 50%; đốt cháy 2 lần mỗi năm (2 vụ), mỗi lần trong khoảng 2 tuần đến 1 tháng Do đó, nó trở thành một vấn đề nghiêm trọng đối với môi trường và sức khỏe con người Các khí thải từ đốt rơm rạ trên cánh đồng tập trung nhiều ở các huyện Ứng Hòa, Ba Vì, Sóc Sơn, Chương Mỹ, sau đó là Đông Anh, Thường Tín, Mỹ Đức, Thanh Oai, Mê Linh, Quốc Oai, Thạch Thất, Phúc Thọ, Gia Lâm, Sơn Tây, Hoài Đức, Đan Phượng, Thanh Trì, Phú Xuyên, Từ Liêm

Ảnh hưởng của việc đốt rơm rạ

Rơm rạ chứa khoảng 0,6% N là nguồn cung cấp đạm quan trọng nếu trả lại cho đất Giả sử tỉ lệ hạt trên rơm rạ là 2/3 thì tổng lượng rơm rạ là trên 6 triệu tấn Khi đó, rơm rạ này chứa khoảng 3,6 triệu tấn P2O5 và 9,6 K2O [15] Đốt rơm là một giải

pháp dễ thực hiện và để diệt trừ các dịch bệnh có thể gây hại Tuy nhiên, có nhiều nghiên cứu cho rằng việc đốt rơm này đã làm cho môi trường sinh thái mất cân bằng và mất đi một số lượng đáng kể N, P và trên đồng ruộng, tăng lượng CO2 gây ô nhiễm môi trường Đốt rơm nhiệt độ lên đến 7000C, ở nhiệt độ này tất cả cacbon và đạm, 25% P, 21% K và phần lớn lưu huỳnh bị mất đi Với 1 vụ mùa có hàm lượng rơm là 5 tấn/ha thì sẽ bị mất vào khoảng 45 kg N, 2 kg P, 25 kg K và khoảng 2 kg S khi đốt Thêm vào đó, việc đốt rơm làm cho silica trở nên ít hòa tan hơn khi bón rơm rạ tươi [35] Theo nghiên cứu của Võ Thị Gương năm 2008 [11] cho thấy đốt rơm làm giảm chất hữu cơ trong đất nhưng lại tăng hàm lượng lân hữu dụng trong đất Ngoài ra, khi đốt rơm sẽ cung cấp cho đất khoảng 8 – 12 kg P2O5/ha ở mỗi vụ canh tác

Vùi rơm ở đất ngập lũ kéo dài đưa đến các tiến trình sinh hóa trong đất như: thay đổi điện hóa học và làm giảm sự liên kết trong đất, sự cố định đạm và bất động đạm, sản xuất ra nhiều acid hữu cơ đồng thời phóng thích ra các khí như: CO2, H2S, CH4, NH3 [24] Đồng thời trở ngại lớn nhất của việc phân hủy là lignin là một trong những thành phần ngăn cản sự phân hủy của vi sinh vật trong điều kiện yếm khí, trong đó hàm lượng rơm lúa chứa khoảng 15% lignin Chính các quá trình này ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến sự hấp thu dưỡng chất của lúa Sự tích lũy phenolic là một đặc trưng của điều kiện phân hủy yếm khí hay gần yếm khí và thường xảy ra trong giai đoạn đầu của sự mùn hóa chất hữu cơ trong điều kiện ngập liên tục của lúa nước Thiếu oxy trong điều kiện ngập nước thường xuyên làm hạn chế sự hoạt động của vi sinh vật đất, đưa đến sự suy giảm hoạt động phân hủy lignin vào thành phần mùn của đất [34], kết hợp N làm giữ chặt N trong đất nên cây trồng không hấp thu được Các nhóm chất này sẽ kết hợp với các dưỡng chất đặc biệt là N, làm giảm khả năng khoáng hóa cung cấp N từ đất và ảnh hưởng đến năng suất lúa

Trong điều kiện ngập nước thì nguồn cung cấp đạm khá tốt là vật chất hữu cơ [40] Lợi ích của hàm lượng hữu cơ đất cao làm tăng khả năng trao đổi cation, hoàn trả lân và sắt ở dạng dễ tiêu cho cây Nhưng khi hàm lượng chất hữu cơ quá cao sẽ

làm giảm sự hữu dụng của kẽm Vì vậy việc vùi rơm sẽ làm tăng cacbon trong đất và sẽ ảnh hưởng nhiều đến sự sinh trưởng của cây lúa Việc chôn vùi rơm rạ khi chưa được phân hủy cũng ảnh hưởng đến cây trồng như gây ngộ độc hữu cơ cho bộ rễ, làm giảm hiệu quả hấp thu dinh dưỡng, giảm sự sinh trưởng và năng suất lúa [14] Kết quả sử dụng phân rơm hữu cơ và phân sinh học kết hợp nitơ hóa học ở mức 25 kg/ha cho cây lúa ở An Giang, Cần Thơ, Long An cho thấy năng suất gia tăng, giảm lượng phân hóa học, các vi sinh vật có lợi trong đất tăng chất mùn

Ngoài ra số lượng và chất lượng chất hữu cơ trong đất đều có ảnh hưởng đến tiến trình phân hủy nhanh hay chậm [20] Số lượng chất hữu cơ càng nhiều thì sự phân hủy trong điều kiện yếm khí xảy ra càng chậm Nghiên cứu về phân hữu cơ trên đất lúa của [4] cho biết khi bón rơm rạ ở mức trung bình có thể có lợi cho năng suất lúa nếu thời điểm bón không gây cạnh tranh dinh dưỡng đạm với cây lúa Khi bón lượng rơm rạ 12 tấn/ha, sự sinh trưởng của cây lúa bị đình trệ, nguyên nhân chủ yếu là do bị ngộ độc hữu cơ và thiếu đạm ở giai đoạn đầu sinh trưởng cây lúa do bị vi sinh vật cố định đạm Vì vậy, nếu sau khi thu hoạch lúa, phần rơm rạ được giữ lại và có biện pháp xử lý thích hợp thì lượng dinh dưỡng từ rơm rạ sẽ góp phần cung cấp thêm chất dinh dưỡng cho đất từ 22,8 – 33,5 kg N/ha; 10 – 11,8 kg P2O5/ha và 38,5 – 49,3 kg K2O/ha

1.2 Tổng quan về vi sinh vật

Mặc dù thành phần trong rơm rạ có chứa cellulose và lignin là chất hữu cơ không tan trong nước, bền vững nhưng lại bị thuỷ phân dễ dàng bởi enzyme cellulase do vi sinh vật (VSV) tiết ra [17, 28, 32] Hệ VSV phân huỷ cellulose rất phong phú và đa dạng bao gồm cả vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm Các vi khuẩn có khả năng phân huỷ mạnh cellulose đã được chỉ ra là Bacillus, Cellulomonas, Vibrio, Archomobacter, [17]

- Vi sinh vật phân giải cellulose

Hệ vi sinh vật phân hủy tàn dư thực vật chủ yếu là xenlulozo khá phong phú gồm có vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm mốc Chúng có khả năng tiết vào môi trường enzym thủy phân xenlulozo là enzym xenlulaza Hệ enzym này gồm 3 enzym là

endoglucanaza, exoglucanza và β - glucozidaza Quá trình thủy phân glucan theo trình tự như sau [33]:

Xenlulozơ → Xenlulozơ biến tính → Xenlobiozơ → Glucozơ Endoglucanaza + Exoglucanza β - glucozidaza

Trong tự nhiên, hệ vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose rất đa dạng và phong phú Nhiều loại nấm và vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose mạnh mẽ trong cả điều kiện hiếu khí và kị khí, ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau Một số vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose như sau:

- Nấm: nấm mốc (nấm sợi) là nhóm có khả năng tiết ra ngoài môi trường một lượng lớn enzyme cellulase có cấu trúc hoàn chỉnh, đầy đủ các thành phần nên có thể phân giải cellulose mạnh và triệt để

- Vi khuẩn: những năm đầu thế kỷ 20 người ta phân lập được các vi khuẩn hiếu khí có khả năng phân giải cellulose, trong đó niêm vi khuẩn là quan trọng nhất, chúng thường có hình que nhỏ, hơi uốn cong, có thành tế bào mỏng, bắt màu nhuộm kém chủ yếu ở các chi Cytophaga, Sporocytophaga và Soragium

- Xạ khuẩn: là nhóm vi sinh vật phân hủy cellulose cao, nó đóng vai trò quan trọng thứ hai sau nấm mốc Người ta rất chú ý việc dùng xạ khuẩn để xử lý phụ phế phẩm nông nghiệp, bởi vì so với nấm mốc, vi khuẩn thì nó ít phát tán lây lan cho các đối tượng khác Người ta thường sử dụng xạ khuẩn đặc biệt là chi Streptomyces, những xạ khuẩn này thường thuộc nhóm ưa nóng, sinh trưởng và phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 45-50oC rất thích hợp với quá trình ủ phân hữu cơ

- Vi sinh vật phân giải hemixenlulozo

Sự phân giải hemixenlulozo (xylan) bởi một phức hệ gồm Endo - 1,4 - β - D - mannaza và 1,4 - β - D - xylozidaza Enzym mannaza thủy phân xylan thành các oligosaccarit hòa tan trong nước và enzym xylozidaza sẽ tiếp tục thủy phân Sản phẩm cuối cùng là xylozo và mannozo

Các enzym hemixenlulaza (xylanaza) rất phổ biến trong tự nhiên, chúng được tiết ra từ các vi sinh vật sống ở đất, nước, trong dạ cỏ động vật nhai lại, bao gồm:

Vi nấm (nấm sợi, nấm mốc): Các enzym phân hủy hemixenlulozơ có nguồn

gốc từ nấm như enzym từ Tricoderma, Aspergillus, Fusarium Các loài nấm

Tricoderma khi phát triển trên xác thực vật sinh ra một lượng lớn xylanaza, có khả

năng phân hủy không những xylan mà còn phân hủy cả glucan, cacboxy - metyl - xenlulo, P - nitrophenyl - β – glucozit và xylosligome

Aspergillus niger cũng sinh ra xylanaza, chúng thủy phân arabinoxylan của

rơm rạ tạo ra arabinoxylotriozo, sau đó hợp chất này lại thủy phân tiếp để giải phóng ra arabinozo và phân giải thành xylotriozo

Vi khuẩn cũng có khả năng sinh xylanaza tổ hợp Trong số vi khuẩn được

nghiên cứu nhiều nhất là Bacillus Vi khuẩn này sinh enzym thủy phân rơm rạ (cơ

chất là arabinoxylan) và sản phẩm chủ yếu là xylobiozo và một lượng nhỏ xylooligosaccarit có độ trùng hợp cao Enzym này phân hủy xylan của rơm rạ và gỗ thông rụng lá theo phương thức endoxylanaza và giải phóng ra xylobiozo, xylotriozo và xylozo

Các loài xạ khuẩn khi phân hủy xylan tạo ra xylobiozo Các xylan này tạo thành ở giai đoạn đầu của quá trình thủy phân Tiếp theo tiến trình phản ứng thủy phân xylooligosaccarit có độ trùng hợp thấp sẽ phân hủy tiếp thành xylobiozo và xylozo

- Vi sinh vật hữu ích bản địa

Vi sinh vật hữu ích bản địa là những vi sinh vật tồn tại trong môi trường tự nhiên, chúng thích nghi tốt với điều kiện môi trường, nơi chúng tồn tại, có khả năng phân hủy nhanh các chất hữu cơ [39] Ưu điểm lớn nhất của việc ứng dụng vi sinh vật bản địa vào sản xuất nông nghiệp là có thể tận dụng vi sinh vật có ích để tạo ra chế phẩm sinh học dùng trong sản xuất nông nghiệp giúp tăng năng suất, chất lượng, đồng thời giảm giá thành đầu vào

Tính đến năm 2022, Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật (Vietnam Type Culture Collection, viết tắt là VTCC) trực thuộc Trung tâm Nghiên cứu Vi sinh vật học Ứng dụng đang lưu giữ trên 15.000 chủng vi sinh vật thuộc 4 nhóm gồm vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men và nấm sợi Trong số đó có khoảng 3.869 chủng đã được tư liệu hóa theo tiêu chuẩn quốc tế sẵn sàng cung cấp cho các đơn vị, cá nhân trong nước có nhu cầu Ngoài ra, trong số các chủng được tư liệu hóa trong catalogue online theo chuẩn quốc tế, 2082 chủng đã được đưa vào danh sách các chủng vi

sinh vật trong danh mục nguồn gen vi sinh vật của cơ sở dữ liệu các nguồn gen vi sinh vật toàn cầu (Global catalogue of microorganism) [1]

Trong số các chủng vi sinh vật hữu ích bản địa tại VIệt Nam có những chửng vi sinh vật được nghiên cứu, chế phẩm, ứng dụng vào sản xuất có thể kể đến như:

+ Chế phẩm xử lý rơm rạ Emuniv nhãn lúa

Là một sản phẩm của đề tài nghiên cứu cấp nhà nước do Trung tâm Nông nghiệp hữu cơ (Học viện Nông nghiệp Việt Nam) nghiên cứu và chuyển giao, chế phẩm xử lý rơm rạ Emuniv nhãn lúa là dạng chế phẩm vi sinh giúp phân giải nhanh các chất hữu cơ và cải tạo đất trồng, đặc biệt giúp phân giải nhanh rơm rạ trên đồng Với thành phần gồm 7 chủng vi sinh vật là Bacillus subtilis: 3 x 108 CFU/g, Bacillus licheniformis: 3 x 107 CFU/g, Bacillus megaterium: 3.5 x 107 CFU/g, Lactobacillus acidophilus: 2.5 x 108 CFU/g, Lactobacillus plantarum: 2.5 x 108 CFU/g, Streptomyces sp: 5.8 x 107 CFU/g, Saccharomyces cerevisiae: 2.5 x 107 CFU/g.[12]

+ Chế phẩm vi sinh Sumitri

Là sản phẩm đạt giải thưởng Môi trường TP Hồ Chí Minh năm 2018 và giải thưởng Thách thức Nông nghiệp vùng Mekong (MATCh) năm 2018, chế phẩm vi sinh Sumitri giúp xử lý rơm rạ thành phân bón cho cây trồng, thức ăn cho nuôi trồng thủy sản Được sản xuất bởi Công ty TNHH Phát triển nông nghiệp Phương Nam, Sumitri có thành phần gồm vi sinh vật phân giải hữu cơ Trichoderma spp 105 CFU, cùng 25% Acid Humic, 10% Acid Fulvic, cùng TE và một số chất hữu cơ dễ tan khác

+ Phân hữu cơ vi sinh Dascela

Thành phần chính của sản phẩm là vi khuẩn phân giải cellulose Cellulomonas flavigena 108 CFU/g có khả năng phân giải rơm rạ trong thời gian ngắn 7 - 10 ngày sau khi xử lý Giúp lúa không bị ngộ độc hữu cơ đầu vụ, cây sinh trưởng tốt, cung cấp lại cho đất một lượng các dinh dưỡng khoáng

Ngoài ra được bổ sung thêm 15% hữu cơ, 2% N, 1% P2O5 và 2% K2O, phân hữu cơ vi sinh Dascela giúp cung cấp thêm dưỡng chất cho cây lúa, giúp tang năng suất và hiệu quả kinh tế, đồng thời giảm công lao động

+ Chế phẩm Fito-Biomix RR

Chế phẩm Fito-Biomix RR có hiệu quả cải tạo đất thông qua xử lý rơm rạ thành phân hữu cơ vi sinh Thời gian xử lý gốc rạ bằng chế phẩm Fito-Biomix RR từ 7-10 ngày xuống còn 3-4 ngày không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cây lúa Rơm, gốc rạ được xử lý bằng chế phẩm Fito-Biomix RR có mật độ vi sinh vật cao hơn hẳn Đối với rơm, mật độ từ 103 tăng lên 108, với gốc rạ là 103-104 tăng lên 105-106 [21, 22]

1.3 Tổng quan về phân hữu cơ

Phân hữu cơ được chia thành 2 nhóm [25]:

- Phân hữu cơ truyền thống

Phân hữu cơ truyền thống là loại phân có nguồn gốc từ chất thải của người, động vật hoặc từ các phế phụ phẩm trồng trọt, chăn nuôi, chế biến nông, lâm, thủy sản, phân xanh, rác thải hữu cơ, các loại than bùn được chế biến theo phương pháp ủ truyền thống Có thể chia phân hữu cơ truyền thống ra làm 4 nhóm: i) Phân chuồng; ii) Phân rác; iii) Than bùn và iv) Phân xanh

- Phân hữu cơ công nghiệp

Phân hữu cơ công nghiệp là một loại phân được chế biến từ các nguồn hữu cơ khác nhau để tạo thành phân bón tốt hơn so với bón nguyên liệu thô ban đầu Hiện nay có thể chia ra 5 loại phân hữu cơ công nghiệp, đó là: phân hữu cơ, phân hữu cơ khoáng, phân hữu cơ sinh học, phân vi sinh, phân hữu cơ vi sinh

Giá trị sử dụng của phân hữu cơ

Phân hữu cơ nói chung có ưu điểm là chứa đầy đủ các nguyên tố dinh dưỡng đa, trung và vi lượng mà không một loại phân khoáng nào có được Ngoài ra, phân hữu cơ cung cấp chất mùn làm kết cấu của đất tốt lên, tơi xốp hơn, bộ rễ phát triển mạnh, hạn chế mất nước trong quá trình bốc hơi từ mặt đất, chống được hạn, chống xói mòn

Bảng 1.1 Hàm lượng tiêu chuẩn các nguyên tố dinh dưỡng trong

nguyên liệu hữu cơ [26]

60 8-10 0,4-0,6 0,1-0,2 0,4-0,6 0,2-0,4

Phân của đại gia súc đã ủ (Composted cattle

manure)

Phân lợn (Pig manure) 80 5-10 0,7-1,0 0,2-0,3 0,5-0,7 1,2 Phân gia cầm

(Poultry manure) 55 15 1,4-1,6 0,5-0,8 0,7-0,8 2,3 Phân rác thải ủ ngấu

1.4 Nghiên cứu ứng dụng công nghệ vi sinh trong xử lý phụ phẩm nông nghiệp

Nhằm tìm ra được giải pháp hữu ích và tận dụng được các phế thải nông nghiệp để tái đầu tư trở lại cho cây trồng Hiện nay nhiều nước trên thế giới và Việt Nam đã xem việc ứng dụng công nghệ vi sinh là chìa khóa then chốt để giải quyết vấn đề này Hàng loạt thành tựu nghiên cứu, ứng dụng công nghệ vi sinh đã ra đời

Vào những năm đầu thế kỷ 20, nhiều nhà sinh học đã bắt đầu nghiên cứu tìm ra những yếu tố tác động vào quá trình xử lý phụ phẩm Từ năm 1926-1941 Waksman và các cộng sự nghiên cứu sự phân huỷ hiếu khí bã thực vật, động vật và đã kết luận nhiệt độ, các nhóm vi sinh vật có ảnh hưởng đến sự phân huỷ chất thải hữu cơ Ở Mỹ vào năm 1942, Rodale J.I đã kết hợp các nghiên cứu của Howard với những thực nghiệm của mình và đã đưa ra phương pháp hữu cơ trong trồng trọt, làm vườn và đã được hoan nghênh ủng hộ

Theo thời gian phương pháp và kỹ thuật ngày càng hoàn thiện, đáp ứng nhu cầu chế biến các phế thải nông nghiệp đồng thời kiểm soát ô nhiễm môi trường do chúng gây ra Một hình thức sản xuất phân hữu cơ rất phổ biến là ủ chất hữu cơ thực vật với chất thải động vật Sau một vài tháng đến hàng năm, sản phẩm tạo thành được dùng làm phân hữu cơ

Trong các nghiên cứu Gaus và các cộng sự đã cho thấy các vi sinh vật phân giải xenluloza đã làm tăng hàm lượng nitơ và photpho trong phân hữu cơ cùng với việc giảm giá thành công nghệ Năm 1979 Gaus đã sử dụng các chủng nấm ưu ấm vào các đống ủ (rơm, lá khô ) Sự có mặt của vi sinh vật phân giải xenluloza là một trong các yếu tố quan trọng để rút ngắn thời gian phân huỷ các hợp chất hữu cơ

Để đảm bảo chất lượng phân hữu cơ và rút ngắn thời gian phân huỷ cũng như hạn chế tối đa các ảnh hưởng không tích cực của quá trình chế biến phân ủ đến môi trường, kỹ thuật ủ nhanh (Rapid Composting) đã được nghiên cứu và phát triển tại ấn Độ, Mỹ, trong đó ngoài các yếu tố cân bằng tỷ lệ C/N, điều khiển nhiệt độ, độ thông khí của khối ủ người ta đặc biệt quan tâm đến vai trò của vi sinh vật khởi động (microbial activator) và vi sinh vật làm giàu dinh dưỡng phân ủ

Thời gian qua, các nhà khoa học trong nước đã nghiên cứu và sản xuất thành công một số chế phẩm vi sinh vật, phân bón hữu cơ, phân hữu cơ vi sinh vật, để sử dụng cho cây trồng Trong khuôn khổ Dự án sản xuất thử nghiệm cấp Nhà nước được thực hiện từ năm 2008, nhóm cán bộ nghiên cứu Viện Thổ nhưỡng Nông hóa, Viện Môi trường Nông nghiệp đã kết hợp với Trung tâm ứng dụng Khoa học và Công nghệ Đăk Lăk đã hoàn thiện công nghệ sử dụng chế phẩm vi sinh vật trong xử lý vỏ cà phê phế thải làm nguyên liệu hữu cơ sản xuất phân hữu cơ sinh học phục vụ sản xuất nông nghiệp trên địa bàn Đăk Lăk Kết quả nghiên cứu và thử nghiệm tại các vùng sản xuất trên địa bàn Đăk Lăk cho thấy các sản phẩm phân bón hữu cơ chế biến từ vỏ cà phê có tác dụng tích cực đến chất lượng nông sản, đồng thời có tác dụng bảo vệ hệ sinh thái môi trường đất

Một số nghiên cứu điển hình của nhóm tác giả Phạm Văn Ty và cộng sự đã phân lập được hàng trăm chủng vi sinh vật có khả năng phân giải hợp chất xenluloza, lignin, hemixenluloza Kết quả thử nghiệm xử lý phế thải hữu cơ bằng chế phẩm chứa chủng vi sinh vật này đã rút ngắn thời gian ủ xuống còn 45 - 60 ngày thay vì phải ủ từ 6 tháng đến 1 năm với phương pháp ủ tự nhiên

Xuất phát từ những mặt ưu việt của phương pháp xử lý phế thải hữu cơ bằng biện pháp sinh học (ứng dụng công nghệ vi sinh) nhiều tác giả trong nước đã dầy công đầu tư thời gian và trí lực vào nghiên cứu, từng bước hoàn thiện các quy trình xử lý phế thải hữu cơ một cách hoàn thiện và triệt để nhất

Việc nghiên cứu sử dụng vi sinh vật là tác nhân sinh học trong xử lý phế thải giàu hữu cơ tạo nguồn phân bón hữu cơ phục vụ sản xuất nông nghiệp đã được các nhà khoa học thực hiện trong những năm gần đây Năm 2015, PGS.TS Đào Châu Thu, TS Nguyễn Ích Tân cùng cộng sự thuộc Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Nông nghiệp bền vững thuộc trường Đại học Nông nghiêp I đã hợp tác với Đại học Udine – Italia nghiên cứu “Sản xuất phân hữu cơ từ rác thải hữu cơ sinh hoạt và phế thải nông nghiệp để dùng làm phân bón cho rau sạch vùng ngoại ô bị ô nhiễm thành phố”, thử nghiệm sử dụng phân bón hữu cơ sinh học tạo ra cho 3 loại rau: ăn lá, quả, củ

Theo nghiên cứu của Trần Thị Ngọc Sơn và cộng sự cho thấy, chế phẩm Trichoderma có hiệu quả xử lý rơm rạ nhanh trên đồng ruộng, phù hợp với điều kiện canh tác ở Đồng bằng Sông Cửu Long, làm giảm tỷ lệ C/N trong rơm rạ còn 20,4 đến 21,4 và gia tăng hàm lượng NPK Xử lý rơm rạ bằng chế phẩm góp phần giảm khoảng 30% NPK phân hóa học và gia tăng năng suất lúa cũng như tăng hiệu quả kinh tế trồng lúa và cải thiện độ phì nhiêu đất Kết quả sử dụng phân rơm hữu

cơ phân hủy bởi nấm Trichoderma sp và phân sinh học kết hợp N hóa học ở mức

25 kg N/ha cho thấy năng suất lúa gia tăng, các vi sinh vật có lợi trong đất, chất hữu cơ, N, P và K hữu dụng đều tăng rõ rệt [15]

Hiện nay, các nhà nghiên cứu đã cho ra đời nhiều loại chế phẩm sinh học nhằm thúc đẩy quá trình phân hủy của phụ phẩm nông nghiệp Ví dụ như Chế phẩm Fito-Biomix RR được Trung tâm Ứng dụng tiến bộ KH&CN Lạng Sơn (2013-2014) ứng dụng, có hiệu quả cải tạo đất thông qua xử lý rơm rạ thành phân hữu cơ vi sinh Thời gian xử lý gốc rạ bằng chế phẩm Fito-Biomix RR từ 7-10 ngày xuống còn 3-4 ngày không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cây lúa Rơm, gốc rạ được xử lý bằng chế phẩm Fito-Biomix RR có mật độ vi sinh vật cao hơn hẳn Đối với rơm, mật độ từ 103 tăng lên 108, với gốc rạ là 103-104 tăng lên 105-106 [21, 22] Thời gian và hiệu quả xử lý của các chế phẩm sinh học này sẽ thay đổi tùy thuộc vào điều kiện canh tác và môi trường tại địa phương

Mặc dù đã có nhiều có nhiều nghiên cứu về xử lý phụ phẩm nông nghiệp được công bố, song việc xử lý rơm rạ hiện nay ở Hà Nội nói riêng và các tỉnh thành khác nói chung vẫn thực sự chưa đạt hiệu quả Bên cạnh lý do chủ quan của người nông dân phải kể đến công nghệ xử lý chưa dễ dàng, rẻ tiền đủ tính thuyết phục cho người dân áp dụng

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu đất và rơm rạ thu thập từ ruộng lúa của 6 xã ven đô thành phố Hà Nội Mẫu đất trồng lúa được thu thập sau khi thu hoạch lúa tại 6 xã: xã Thượng Cốc huyện Phúc Thọ, xã Hương Ngải huyện Thạch Thất, xã Mỹ Lương huyện Chương Mỹ, xã Hồng Thái huyện Phú Xuyên, xã Thượng Lâm và xã Đồng Tâm thuộc huyện Mỹ Đức

- Chủng vi sinh vật phân giải cellulose phân lập từ mẫu đất Bản chất của các phương pháp nghiên cứu hiện nay là ứng dụng các vi sinh vật có khả năng phân hủy lignoxenluloza để phân hủy rơm rạ Trong các loại vi sinh vật thì xạ khuẩn có những ưu điểm như: ít độc, có thể sản sinh ra chất ức chế hoặc tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh khác, dễ tiến hành theo kiểu lên men rắn theo kiểu đống ủ Vì vậy nên đề tài chọn phương pháp phân lập xạ khuẩn

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu đất

Mẫu đất được lấy theo TCVN 7538-6:2010: Hướng dẫn về thu thập, xử lý và bảo quản mẫu đất ở điều kiện hiếu khí để đánh giá các quá trình hoạt động, sinh khối và tính đa dạng của vi sinh vật trong phòng thí nghiệm [16] Mẫu đất được lấy ở tầng đất canh tác (độ sâu 0-10cm) theo đường chéo (5 mẫu/điểm lấy mẫu) Mẫu đất được lấy chủ yếu ở quanh các gốc rạ, khi các ruộng lúa vừa thu hoạch xong Mẫu được để trong túi có ghi tên địa điểm, thời gian lấy mẫu

Xử lý mẫu đất: Mẫu đất được xử lý sau khi lấy mẫu Rây đất qua rây cỡ lỗ 2mm để loại bỏ đá sỏi nhỏ, động vật và các mẫu vụn thực vật ra khỏi đất mẫu đất trước khi tiến hành phân lập xạ khuẩn

2.2.2 Phương pháp phân lập xạ khuẩn

Bước 1 : Phân lập xạ khuẩn trên môi trường Gause: [6, 19]: Thành phần môi trường: K2HPO4 1g/l, MgSO4 1g/l , NaCl 1g/l; (NH4)2SO4

2g/l; CaCO3 2g/l; FeSO4 0,1g/l; MnCl2 0,1g/l; ZnSO4(H2O)7 0,1g/l;

Bước 2: Agar có bổ sung cơ chất CMC 0,1%; hấp khử trùng 121oC, 20 phút;

Bước 3: Để nguội môi trường đến 45-50oC rồi phân phối vào các đĩa peptri vô trùng;

Bước 4: Sau 48 giờ, kiểm tra độ sạch của môi trường (28-30oC); Sử dụng các đĩa peptri chứa môi trường nuôi cấy vi sinh vật không phát hiện thấy tạp nhiễm

Nguyên tắc: phân lập trực tiếp bằng phương pháp pha loãng trên môi trường Gause-CMC

+ 10g mẫu đất (đã được nghiền nhỏ) và cho vào bình chứa 90 ml dịch pha loãng (nước muối sinh lý đã khử trùng);

+ Lắc kỹ bằng thiết bị trộn cơ học từ 5 phút đến 10 phút sao cho vi sinh vật trong dung dịch phân bố đồng đều Để các phân tử lắng xuống trong thời gian không quá 15 phút, gạn được dung dịch huyền phù ban đầu

+ Dùng pipet đã vô trùng lấy 1ml dịch huyền phù ban đầu cho vào ống nghiệm chứu 9ml dịch pha loãng đã chuẩn bị sẵn Lắc kỹ để có dịch pha loãng mẫu có nồng độ pha loãng là 10-2 Qúa trình này được lặp lại liên tục để có dịch mẫu có nồng độ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5

+ Dùng pipet vô trùng riêng cho từng độ pha loãng, lấy ra 1ml mẫu từ các dịch mẫu có các nồng độ pha loãng ở trên, cấy vào 1 đĩa peptri chứa môi trường đã chuẩn bị sẵn (mỗi độ pha loãng được lặp lại 2 đĩa peptri) Sử dụng que gạt vô trùng dàn đều dịch mẫu trên bề mặt thạch, đợi bề mặt thạch khô, úp ngược đĩa peptri

+ Sau đó, đĩa peptri được ủ ở 37ºC trong 2 ngày cho các khuẩn lạc mọc tách biệt nhau Sau khi khuẩn lạc vi sinh vật đã phát triển trên đĩa peptri, để đĩa peptri vào tủ lạnh trong 12 giờ, sau đó cho vào tủ ấm 40oC trong 6 giờ Lấy ra, cho vào mỗi đĩa peptri 5ml thuốc thử lugol, dàn đều khắp mặt thạch; để trong 15 phút rồi gạn bỏ hết thuốc thử

+ Quan sát vòng phân giải (vòng trong suốt) được tạo thành quanh khuẩn lạc xạ khuẩn Lựa chọn khuẩn lạc mọc riêng rẽ và có vòng phân giải tiến hành làm sạch và bảo quản trong ống thạch nghiêng ở 4ºC

2.2.3 Phương pháp tuyển chọn chủng xạ khuẩn có hoạt tính cao

Các chủng xạ khuẩn sau khi phân lập sẽ tiến hành tuyển chọn chủng có hoạt tính cellulose cao theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch chứa 0,1% cơ chất CMC [7,29]

Bước 1: Nuôi chủng xạ khuẩn trong môi trường lỏng Gause-1 Thành phần (g/l): 20g tinh bột; 3g MgSO4-7H2O; 3g K2HPO4; 1g KNO3; 0,5 g NaCl; 0,01g FeSO4.-7H2O, nước cất 1 lít) ở 37ºC, tốc độ lắc 150 vòng/phút trong 3 ngày Dịch nuôi cấy ly tâm 5000 vòng/phút ở 4ºC trong 15 phút, thu dịch lỏng phía trên được enzym thô;

Bước 2: Nhỏ phần dịch enzym thô vào các lỗ đã đục ở đĩa petri chứa cơ chất CMC 0,1%, đặt các đĩa thạch ở 370C Sau 48 giờ, để đĩa peptri vào tủ lạnh trong 12 giờ, sau đó cho vào tủ ấm 40oC trong 6 giờ Lấy ra, cho vào mỗi đĩa peptri 5ml thuốc thử lugol, dàn đều khắp mặt thạch; để trong 15 phút rồi gạn bỏ hết thuốc thử tráng dung dịch Lugol;

Bước 3: Quan sát vòng phân giải tạo thành Hoạt tính enzyme của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn được tính bằng đường kính vòng phân giải (ΔD): ΔD = D - d (mm) với D và d lần lượt là:

- D: đường kính vòng phân giải (mm); - d: đường kính lỗ thạch (mm)

Trên cơ sở xác định khả năng sinh enzym ngoại bào, lựa chọn các chủng có đường kính vòng phân giải lớn nhất Quy ước:

- ΔD ≥ 25mm : hoạt tính enzym mạnh - ΔD ≥ 20mm : hoạt tính enzym khá mạnh - ΔD ≥ 15mm : hoạt tính enzym trung bình - ΔD ≤ 10mm : hoạt tính enzym yếu

2.2.4 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái

Các chủng xạ khuẩn được nuôi trên môi trường thạch Gause-TB ở 37oC và hệ thống môi trường ISP Sau 72-96 giờ, tiến hành quan sát các khuẩn lạc từ các phía (từ trên xuống, từ bên cạnh), chú ý về kích thước, hình dạng khuẩn lạc, hình dạng mép, bề mặt, độ dày, màu sắc (khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ chất), khả

năng hình thành sắc tố tan và sự hình thành sắc tố melanin, quan sát sự thay đổi của môi trường, mật độ tế bào sau 72-96 giờ nuôi ở trạng thái tĩnh và khi lắc với tốc độ 150 vòng/phút Hình dạng cuống sinh bào tử và bào tử được quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi quang học Olympus, vật kính 10x, vật kính 100x sau thời gian nuôi là 7 ngày và 14 ngày

2.2.5 Phương pháp xác định đặc điểm sinh hóa

Xác định phản ứng sinh hóa của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu bằng kỹ thuật thử nghiệm khả năng lên men các loại đường, sử dụng môi trường: Phenol red carbohydrate broth

Tiến hành: cấy chủng xạ khuẩn vào môi trường lỏng nuôi ở 37ºC/24-48h, vi sinh vật sử dụng nguồn đường trong môi trường sẽ làm giảm pH, thay đổi màu chất chỉ thị phenol đỏ Kết quả: (+): môi trường chuyển vàng; (-): môi trường có màu đỏ

Thử nghiệm catalase: Chủng xạ khuẩn lấy từ môi trường nuôi cấy (lỏng, rắn), đặt lên lam kính sạch; nhỏ H2O2 30%, quan sát 1-2 giây Phản ứng (+) khi có bọt khí xuất hiện, phản ứng (-) không có bọt khí xuất hiện

2.2.6 Phương pháp định danh của chủng xạ khuẩn được chọn

Định danh các chủng vi sinh vật bằng phương pháp phân loại học phân tử dựa trên cơ sở giải trình tự đoạn gene 16s ARN riboxom của các chủng nghiên cứu, so sánh với các trình tự có sẵn trong ngân hàng gene quốc tế EMBL bằng phương pháp FASTA 33 để định loại đến loài các chủng vi sinh vật.Cặp mồi được thiết kế dựa trên trình tự đoạn gene mã hóa 16s ARN riboxom của chủng E.coli (J01695), tương ứng với các vị trí nucleotid 15-33 (cho mồi xuôi) và 1548-1532 (cho mồi ngược) Truy cập Ngân hàng Gene bằng chương trình Entrez/nucleotide/ tìm kiếm các trình tự gene 16s ARN riboxom của vi khuẩn So sánh đối chiếu và xử lý số liệu của tất cả các chuỗi bằng chương trình GENDOC2.5 Thành phần nucleotit được thu nhận bằng cách sử dụng bộ mã của vi sinh vật bậc thấp trong Ngân hàng Gene (bảng mã di truyền số 11) thông qua chương trình GENDOC 2.5 Tên vi sinh vật được xác định với xác suất tương đồng cao nhất

- Phương pháp PCR thông thường: tổng hợp mạch DNA mới từ mạch khuôn với mồi chuyên biệt nhờ enzyme Taq polymerase với sự có mặt của các dNTP và ion Mg2+

- Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 1%: tại pH trung tính, DNA tích điện âm do có nhóm Phosphate nên dưới tác động của dòng điện 1 chiều, phân tử DNA sẽ di chuyển về điện cực dương

- Phương pháp làm sạch sản phẩm PCR: Để xác định trình tự gen bằng cách đọc trực tiếp từ sản phẩm PCR, cần tiến hành làm sạch sản phẩm Các bước làm sạch theo hướng dẫn của nhà sản xuất

- Phương pháp tách Plasmid ADN: Các khuẩn lạc mang gen tái tổ hợp được làm giàu trên môi trường LB lỏng với Kanamycin để tăng sinh khối, thu vi khuẩn ở pha sinh trưởng, tách ADN plasmid bằng Kit

- Phương pháp giải trình tự gen: Plasmid tái tổ hợp từ khuẩn lạc 1 được chọn để tinh sạch và xác định trình tự gen Nồng độ của plasmid được đo bằng quang phổ kế Sau khi đã tính toán được nồng độ, quá trình giải trình tự được thực hiện bằng máy tự động ABI-377 của Hãng Perkin-Elmer (Mỹ) Truy cập dữ liệu ngân hàng gen EMBL (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) để so sánh bằng chương trình GENDOC 2.5 (Nicholas, 1999)

2.2.7 Phương pháp xác định độ an toàn của chủng xạ khuẩn được lựa chọn

Các chủng vi sinh vật sau khi được định danh sẽ đối chiếu với danh mục các loài vi sinh vật an toàn của Cộng đồng châu Âu

Theo hướng dẫn số 90/679/EWG của cộng đồng Châu Âu về an toàn sinh học, nhóm tác nhân sinh học được phân làm 4 cấp độ an toàn, trong đó chỉ các vi sinh vật ở cấp độ 1 và 2 được ứng dụng trong sản xuất ở điều kiện bình thường Mức an toàn sinh học 1-4 là các mức an toàn sinh học chung, chủ yếu cho các tác nhân sinh học như: vi khuẩn, virut, nấm, ký sinh trùng (kể cả có và không có biến đổi gen)

- Mức an toàn sinh học 1: là mức thích hợp cho các công việc có liên quan tới các tác nhân sinh học đã được mô tả kỹ về đặc điểm, không gây bệnh hoặc có tiềm

năng gây hại ở mức tối thiểu đối với con người và môi trường, không có khả năng lan truyền cà có thể phòng, chống và loại trừ dễ dàng trong điều kiện bình thường

- Mức an toàn sinh học 2: Tương tự mức 1 và thích hợp cho các tác nhân sinh học có tiềm năng gây hại ở mức độ trung bình đối với con người và môi trường

- Mức an toàn sinh học 3: áp dụng cho tác nhân bản xứ hoặc ngoại lai có thể gây bệnh và gây hại nặng cho người do phơi nhiễm qua đường không khí, có thể phòng chống và loại trừ được

- Mức an toàn sinh học 4: Yêu cầu đối với công việc có liên quan đến các tác nhân nguy hiểm, ngoại lai có khả năng lây nhiễm qua đường không khí và gây bệnh, gây hại làm đe doạ đến tính mạng, không thể phòng, chống hoặc loại trừ

2.2.8 Phương pháp xác định khả năng tồn tại và sống sót của các chủng trong điều kiện hỗn hợp

Xác định khả năng tồn tại và sống sót của các chủng trong điều kiện hỗn hợp theo phương pháp xác định mật độ tế bào của vi sinh vật Chủng vi sinh vật lựa chọn được cấy theo tỷ lệ 1% vào các túi chứa chất mang là tinh bột biến tính Nuôi cấy ở 37oC, tiến hành kiểm tra mật độ tế bào các chủng sau 15, 30 và 45 ngày Pha loãng mẫu rồi cấy trang trên đĩa petri có chứa môi trường tương ứng (môi trường King cho vi khuẩn Bacillus; môi trường Gause cho xạ khuẩn) Ủ mẫu ở nhiệt độ 30-37oC, trong 48-72 giờ Đếm số lượng khuẩn lạc tạo thành trên đĩa thạch và tính toán số lượng vi sinh vật có trong 1ml (1g) mẫu theo công thức: