Nghiên cứu khả năng Ứng dụng công nghệ sinh Điện hóa Để kiểm soát tại chỗ các vi khuẩn vibrio gây bệnh trong mô hình nuôi thủy sản nước lợ mô phỏng

Nghiên cứu khả năng Ứng dụng công nghệ sinh Điện hóa Để kiểm soát tại chỗ các vi khuẩn vibrio gây bệnh trong mô hình nuôi thủy sản nước lợ mô phỏng

TỔNG QUAN

Ngành nuôi trồng thủy sản và dịch bệnh gây ra bởi các vi khuẩn Vibrio

Theo báo cáo “Thực trạng Nghề cá và Nuôi trồng thủy sản thế giới năm 2022” của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (FAO), nuôi trồng thủy sản đã phát triển nhanh hơn đánh bắt trong hai năm qua và dự kiến sẽ mở rộng hơn nữa trong thập kỷ tới [35] Tại Việt Nam, theo Tổng cục thống kê, tính chung năm 2023, sản lượng thủy sản nuôi trồng ước tính đạt 5.455,8 nghìn tấn, tăng 4,2% so với năm trước, bao gồm: cá đạt 3.631,4 nghìn tấn, tăng 3,7%; tôm đạt 1.211,6 nghìn tấn, tăng 5,8%; thủy sản khác đạt 612,8 nghìn tấn, tăng 4,8% Trong đó, diện tích nuôi nước ngọt là 380 nghìn ha (cá tra 5,7 nghìn ha), diện tích nuôi mặn, lợ là 920 nghìn ha (tôm nước lợ chiếm 737 nghìn ha) [2] Có thể thấy, Việt Nam tập trung vào nuôi trồng thủy sản nước lợ

Hình 1.1 Sản lượng nuôi trồng thủy sản tại Việt Nam [2]

1.1.2 Dịch bệnh gây ra bởi các vi khuẩn Vibrio Để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng, các hệ thống nuôi trồng thủy sản thay đổi từ nuôi quảng canh sang siêu thâm canh, dẫn đến dịch bệnh bùng phát đột ngột (FAO, 2017), đặt ra những thách thức lớn cho việc mở rộng sản xuất và phát triển kinh tế của một số quốc gia [71] Theo Meyer (1991), vi khuẩn có thể gây ra nhiều vấn đề dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản hơn các tác nhân khác [66] Trong số nhiều bệnh

4 truyền nhiễm do vi khuẩn gây ra, các bệnh vibriosis, do các vi khuẩn Vibrio gây ra, được coi là nguyên nhân phổ biến gây thiệt hại nặng nề về năng suất và chất lượng thủy sản [71] Bệnh này dễ dàng phát triển thành dịch lớn, có thể gây tổn thất lên tới 100% sản lượng trong các hệ thống nuôi trồng thủy sản trên toàn thế giới [27] Ước tính thiệt hại do vibriosis trên toàn cầu là khoảng 3 tỷ USD mỗi năm [22]

Các vi khuẩn Vibrio có thể dễ dàng tồn tại trong môi trường nước mà không phụ thuộc vào vật chủ khiến bệnh do vi khuẩn trở này thành vấn đề lớn trong nuôi trồng thủy sản, đặc biệt ở vùng nước ấm hơn trên 17°C và độ mặn cao 30 - 35 ppt

Vibrio spp cần nhiệt độ cao để sinh tồn và lây lan nhanh chóng giữa các cá thể, khiến bệnh vibriosis trở thành một căn bệnh mùa hè [44] Cheng và cộng sự (2009) báo cáo rằng thủy hải sản được nuôi ở mật độ dày đặc và khi nhiệt độ nước cao > 15°C có thể khiến chúng bị căng thẳng dẫn đến tình trạng suy giảm miễn dịch, làm tăng khả năng nhiễm Vibrio [23] Vì vậy, vibriosis là mối đe dọa nghiêm trọng đối với ngành nuôi trồng thủy sản ở các nước nhiệt đới [44] Vibrio là loại vi khuẩn có khả năng phân hủy chitin (chitinoclastic), bám vào lớp vỏ bên ngoài và có thể xâm nhập qua các vết thương ở lớp vỏ ngoài, vốn là một rào cản vật lý hiệu quả giúp ngăn chặn sự xâm nhập của mầm bệnh Ngoài ra, chúng còn có thể xâm nhập vào tôm qua ruột hay tuyến tiêu hóa là nơi có khả năng tiếp nhận mầm bệnh cao từ nước, thức ăn và bùn đáy do không được bảo vệ bởi bất kỳ lớp vỏ nào [98]

Nhìn chung, các dấu hiệu bệnh do Vibrio gây ra trên thuỷ hải sản bao gồm trạng thái lờ đờ, hoại tử mô và phần phụ, tăng trưởng chậm, biến thái chậm, dị tật cơ thể, phát quang sinh học, mờ cơ và hắc tố [71] Các nghiên cứu về sinh vật phù du cho thấy sự phổ biến của các loài Vibrio đã gia tăng trong 44 năm qua và gây bệnh trên gần 106 sinh vật biển [13] Vibriosis được báo cáo là gây tử vong trên diện rộng cho nhiều ấu trùng nhuyễn thể hai mảnh vỏ và một số loài giáp xác ở Biển Ireland và các khu vực xung quanh Ở Malaysia và các nước lân cận có khí hậu nhiệt đới 28°C quanh năm, bệnh vibriosis thường xuyên được ghi nhận ở nhiều trang trại nuôi trồng thủy sản [44] Trong nhiều đợt bùng phát, V harveyi được phân lập thường xuyên nhất, tiếp theo là V parahaemolyticus, V alginolyticus và V anguillarum, chúng gây

5 bệnh cho cá chẽm châu Á (Lates calcarifer), các loài cá mú (Epinephelus spp.) và cá mú lai (E fuscoguttatus x E lanceolatus) [10] Các ca nhiễm Vibrio ở khu vực châu Á đã được báo cáo tại Vịnh Tương Sơn, Trung Quốc liên quan đến V alginolyticus,

V harveyi và V parahaemolyticus trên cá thủ (Pseudosciaeana crocea), một loài cá có vây thương mại ở Trung Quốc [58] Trong ngành nuôi trồng thủy sản, các loài

Vibrio là mầm bệnh cơ hội nghiêm trọng đối với vật chủ như cá có vây, động vật có vỏ và tôm [58] Chúng thường được tìm thấy trên mang, da, đường ruột và các cơ quan nội tạng khác của động vật bị nhiễm bệnh Tại Nhật Bản, các loài nuôi như lươn (Anguilla japonica), cá đuôi vàng (Seriola quinqueradiata) và cá thơm (Plecoglossus altivezis) đều bị nhiễm vi khuẩn Vibrio [44] Vibrio thường có thể được tìm thấy trong trai và gây ra các chuyển động tròn không đều và làm hư hỏng mô mềm của ấu trùng trai [71] Tóm lại, các bệnh vibriosis có thể gây tổn hại trên nhiều bộ phận, cũng như gây bệnh trên đa dạng các loài thủy hải sản Các vi khuẩn Vibrio gây bệnh phổ biến là Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae, …

Vi khuẩn Vibrio harveyi

Vibrio harveyi là vi khuẩn Gram âm hình que, kị khí tùy tiện, di chuyển bằng tiên mao và ưa mặn [72] Đa số các chủng V harveyi có đặc tính phát quang sinh học trong cả điều kiện in vivo và in vitro [19] Có thể tìm thấy V harveyi ở vùng biển nhiệt đới, ở trạng thái sống tự do hoặc sống trong cơ thể của các sinh vật nhân thực, sinh vật phù du hoặc trên bề mặt của các sinh vật biển, trong cơ quan phát sáng của một số loài cá hoặc ở ruột của động vật thủy sinh [72]… V harveyi cũng có thể bám trên các bề mặt phi sinh học như trầm tích dưới đáy hoặc các bề mặt có nguồn gốc công nghiệp Không những có thể tồn tại bằng cách định cư ở những môi trường sống khác thường này, V harveyi cũng hình thành màng sinh học trên các bề mặt sinh học khác nhau Các bề mặt sinh học này có thể đóng vai trò là nguồn dinh dưỡng và đồng thời là nơi trú ẩn [110]

V harveyi phát triển tốt trong điều kiện nồng độ NaCl từ 0,5 đến 6% Hơn nữa, V harveyi có thể sử dụng nguồn cacbon đa dạng khi có khả năng sử dụng từ 30 đến

45 các hợp chất hữu cơ khác nhau (tùy thuộc vào từng chủng) như là nguồn cacbon sơ cấp [81] Các đặc tính sinh hóa trên đã giúp cho V harveyi có khả năng thích nghi tốt trong môi trường biển [9] Trên môi trường thạch TCBS, do có khả năng lên men sucrose nên V harveyi có khuẩn lạc màu vàng [89]

V harveyi có thể gây một loạt các tổn thương, bao gồm tổn thương mắt hoặc mù mắt, viêm dạ dày - ruột, hoại tử cơ, loét da và thối đuôi ở cá Ở tôm, V harveyi được coi là tác nhân gây bệnh của bệnh phát sáng, hội chứng đốm đỏ Có một tình trạng khác ở tôm được gọi là Bolitas nigricans, theo đó đường tiêu hóa của tôm chứa đầy những khối mô bong tróc [114] Để V harveyi xâm nhập vào các sinh vật biển và gây bệnh thì chúng cần có những yếu tố gây bệnh cần thiết để có thể bám lên và lây nhiễm vào vật chủ, sau đó phát tán và nhân lên khắp cơ thể, cuối cùng là gây ra những tổn thương cho các mô và tế bào vật chủ Trong đó, tiên mao hỗ trợ sự di chuyển của vi khuẩn và bám vào bề mặt vật chủ từ đó cho phép vi khuẩn tích tụ trên bề mặt và hình thành các màng sinh học (biofilm) Các lông mao giúp cho việc bám dính trở nên chắc chắn hơn [65] Các nghiên cứu về khả năng gây bệnh của V harveyi cho thấy các enzyme ngoại bào của nó có hoạt tính phân giải protein, tan máu và thủy phân phospholipid Điều này cho thấy khả năng gây bệnh của V harveyi có thể là do sự có mặt của các yếu tố độc lực ngoại bào như proteases, haemolysins, chitinases và phospholipase [60] Liu và cộng sự (1999) đã phát hiện một protease cystein mới từ chủng V harveyi gây bệnh của Đài Loan, có độc tính gây chết đối với Panaeus monodon bằng cách can thiệp vào quá trình cầm máu, có lẽ là thông qua sự sụt giảm của coagulogen, một thành phần trong huyết tương tôm [59] Để duy trì chức năng sinh lý bên trong vật chủ, V harveyi đã phát triển một hệ thống thu nhận sắt hiệu quả cao cho phép lấy sắt từ môi trường vật chủ trong điều kiện hạn chế sắt bởi vì sắt là một thành phần quan trọng trong các quá trình tổng hợp trung gian, tổng hợp thứ cấp và khả năng bám vào tế bào vật chủ Việc thu nhận sắt

7 của V harveyi là do nó có thể tổng hợp hợp chất vận chuyển sắt siderophores - là các hợp chất nhỏ có ái lực cao có thể cô lập các ion sắt Fe 2+ từ môi trường tế bào và vận chuyển sắt vào bên trong vi khuẩn bằng cách liên kết với các thụ thể trên màng ngoài

Hơn nữa, các vi khuẩn Vibrio cũng có thể lấy sắt được liên kết bởi các siderophore ngoại sinh do các vi khuẩn khác tiết ra [26] Có những nghiên cứu đã chứng minh rằng khả năng thu nhận sắt là một đặc điểm quan trọng của các loài Vibrio gây bệnh trong quá trình chúng lây nhiễm đối với động vật có xương sống, nhưng không phải đối với động vật không xương sống [90]

Hệ tiết loại 3 (type 3 secretion system – T3SS) là hệ thống vi tiêm siêu nhỏ được nhiều vi khuẩn gram âm sử dụng để gây bệnh trong tế bào vật chủ T3SS hình thành các lỗ hình kim thông qua màng của vi khuẩn và vận chuyển trực tiếp các protein tác động từ tế bào chất của vi khuẩn vào tế bào chủ Các protein tác động có nhiều hoạt động khác nhau, bao gồm sửa đổi tín hiệu của vật chủ và ngăn chặn phản ứng miễn dịch, tạo điều kiện cho mầm bệnh lây nhiễm để nó có thể lấy chất dinh dưỡng từ vật chủ, dẫn đến tiến triển bệnh [99] V harveyi sử dụng T3SS để gây bệnh cho vật chủ Ở V harveyi, T3SS được điều hòa phụ thuộc vào mật độ tế bào bằng quá trình quorum sensing (QS) QS là một cơ chế giao tiếp hóa học liên quan đến việc sản xuất, bài tiết và phát hiện các phân tử tín hiệu được gọi là chất tự cảm ứng (autoinducers-AI) [103] Khi vi khuẩn ở mật độ tế bào thấp, nồng độ AI thấp, dẫn đến biểu hiện các hành vi quan trọng cho sự sống còn của vi khuẩn Khi quần thể vi khuẩn tăng lên, nồng độ AI cũng tăng theo tỷ lệ Ở mức độ tập trung AI lớn, quần thể sẽ chuyển đổi sang những hành vi có lợi cho sự sinh tồn QS điều chỉnh các hành vi như liên hợp, phát quang sinh học, hình thành màng sinh học và sản xuất yếu tố độc lực [104] V harveyi có thể đi vào trạng thái được gọi là “có thể sống được nhưng không thể nuôi cấy” (VBNC) và sự hồi sinh của các tế bào VBNC có thể là một lý do quan trọng cho sự bùng phát bệnh vibriosis trong nuôi trồng thủy sản [60]

1.2.2 Dịch bệnh thủy sản gây ra bởi Vibrio harveyi

Do V harveyi có thể gây bệnh trên các đối tượng đa dạng, từ cá đến các loài động vật không xương sống như tôm, hải sâm, cá ngựa hay bào ngư đến các động vật

8 bậc cao, nên rất nhiều nước trên thế giới đều gặp các dịch bệnh gây ra bởi loại vi khuẩn này Căn bệnh đầu tiên được cho là do V harveyi là bệnh viêm mạch của cá mập nuôi được Grimes phát hiện năm 1984 [40] Ngoài ra, V harveyi đã được phát hiện từ vết loét da mãn tính trên cá mập [17] và là nguyên nhân gây viêm dạ dày ruột ở cá mú nuôi (Epinephelus coioides) ở Đài Loan [109] V harveyi cũng đã được phân lập từ dạ dày - ruột ở cá tráp biển đen (Acanthopagrus schlegeli), cá tráp vây vàng (Acanthopagrus latus), cá chẽm Nhật Bản (Lateolabrax japonicus) và cá trống đỏ (Sciaenops ocellatus) đang mắc bệnh Viêm ruột hoại tử truyền nhiễm, có đặc điểm là đỏ thân, bụng căng phồng chứa đầy dịch đục, viêm ruột và hoại tử ruột sau, được mô tả ở cá bơn mùa hè (Paralichthys dentatus) và cũng được cho là do V harveyi

[109] Hơn nữa, vi khuẩn này đã nhiều lần được báo cáo liên quan đến các tổn thương ở mắt Ví dụ, bệnh về mắt ở cá măng biển (Chanos chanos) ở Philippines; cá chọi

(Centropomus undecimalis) phát hiện có giác mạc màu trắng đục, bị mù; các vết thương ở mắt ở loài cá mặt trăng (Mola mola) [14]

V harveyi là tác nhân gây bệnh Bolitas negricans (động vật bị bệnh có mô biểu bì dạng cuộn làm tắc nghẽn đường tiêu hóa) tại Ecuador Tại Madagascar, vi khuẩn này gây loét da ở hải sâm non Holothuria scabra Ban đầu, các đốm trắng phát triển nhanh chóng và hải sâm chết trong vòng 3 ngày, lớp biểu bì bên trong các đốm đã bị phá hủy hoàn toàn Chúng cũng là nguyên nhân gây ra bệnh bệnh vibriosis phát sáng ở ấu trùng phyllosoma của tôm hùm đá (Jasus verreauxi) Ấu trùng bị bệnh trở nên mờ đục, xuất hiện những đốm nhỏ màu đỏ khắp cơ thể và phát sáng mờ Kiểm tra mô bệnh học cho thấy đường tiêu hóa và các ống gan tụy chứa đầy vi khuẩn [14] Tỷ lệ gây chết lên tới 75% khi nhiệt độ nước là 20 - 23°C [30]

Tại Việt Nam, các trang trại nuôi thủy sản liên tục ghi nhận các trường hợp thủy hải sản mắc bệnh do V harveyi gây ra Vào năm 2013, các triệu chứng rụng vảy và hoại tử cơ liên tục được ghi nhận ở các trại nuôi cá chẽm (Lates calcarifer) Sau khi phân lập các vi khuẩn từ các mô ở cơ, thận, gan, não của cá chẽm và giải trình tự 16S rDNA, Dong và cộng sự đã xác định được 5 loài vi khuẩn khác nhau trong đó có

V harveyi Và sau giai đoạn gây nhiễm in vivo cho thấy chỉ có V harveyi khiến cá

9 gây chết với các triệu chứng lâm sàng và các biến đổi mô tương tự với cá nuôi bị bệnh ngoài ao Với mật độ lây nhiễm là 2.53 × 10 7 (CFU/cá thể) thì tỷ lệ chết lên đến 100% sau 15 ngày lây nhiễm [32] V harveyi còn được ghi nhận là tác nhân gây bệnh phát sáng trên cua xanh (Sculla serrata) – một bệnh nguy hiểm và phổ biến trong các trại sản xuất cua giống ở các tỉnh miền Bắc như Hải Phòng hay Nam Định, với tỷ lệ chết gây ra do bệnh này có thể lên tới 50 – 100% sau 2-3 ngày nhiễm bệnh nếu không có biện pháp chữa trị kịp thời [95] Hơn nữa, V harveyi cũng gây bệnh phát sáng trên tôm tại các trại sản xuất hoặc ươm tôm giống và khi nhiễm một lượng vi khuẩn đủ lớn sẽ gây chết hàng loạt Đặc biêt, tại Việt Nam, một số các nghiên cứu đã chứng minh rằng V harveyi có thể là một trong những tác nhân gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease – AHPND) trong các đợt dịch bệnh AHPND ở tôm thẻ chân trắng tại một số tỉnh miền Bắc [50] Đây là một phát hiện mới vì bệnh AHPND đã được cho là do V parahaemolyticus Điều này cũng chứng tỏ V harveyi là một tác nhân gây bệnh đáng quan tâm với khả năng gây ra các bệnh đa dạng trên nhiều loài thủy sản khác nhau.

Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

V parahaemolyticus là vi khuẩn Gram âm, hình que cong như dấu phẩy, ưa mặn, và phát triển trong môi trường ở nồng độ NaCl 1% - 7%, với nồng độ tối ưu là 2,5% - 3,5%, với khoảng pH tăng trưởng tối ưu là 8,0 - 8,5 [111] V parahaemolyticus tạo ra một số kháng nguyên soma (O) và kháng nguyên vỏ (K) khác nhau, được sử dụng làm cơ sở chính để phân loại chủng, có thể được phân thành 13 kiểu huyết thanh O và 71 kiểu huyết thanh K [50] Khả năng vận động của V parahemolyticus được tạo ra bởi lông roi ở một đầu và có thể bám vào các bề mặt trơ hoặc sinh vật sống như động vật phù du, cá, động vật có vỏ hoặc bất kỳ vật chất lơ lửng nào dưới nước [54]

Trên môi trường thạch TCBS, V parahaemolyticus có khuẩn lạc màu xanh do không có khả năng lên men sucrose [89]

V parahaemolyticus được tìm thấy ở vùng nước lợ và cửa sông, phát triển tốt hơn trên môi trường có hàm lượng muối cao [15] Vào mùa đông, V parahaemolyticus có thể không được phát hiện do nhiệt độ nước thấp Người ta cho rằng, chúng tồn tại trong bùn đáy và phát triển trở lại trong nước khi nhiệt độ tăng lên Ở những nơi nhiệt độ nước không xuống dưới 15°C, V parahaemolyticus có thể được phát hiện quanh năm Gần đây, do nhiệt độ đại dương ấm lên, V parahaemolyticusis đã được phát hiện ở các vùng nước ven biển xa về phía bắc như bờ biển phía nam Alaska

Vibrio parahaemolyticus gồm cả các chủng lành tính và các chủng có độc tố

V parahaemolyticus có một số yếu tố độc lực gồm: các yếu tố bám dính, độc tố gây dung huyết chịu nhiệt (thermostable direct hemolysin - TDH) và độc tố gây dung huyết liên quan đến TDH (TDH-related hemolysin - TRH) được mã hóa bởi gene tdh và gene trh, cũng như hai hệ tiết loại 3 (type 3 secretion system – T3SS) là T3SS1 và T3SS2 [54] T3SS1 có một số yếu tố độc lực gây phân giải tế bào vật chủ bị nhiễm bệnh và giải phóng các chất dinh dưỡng quan trọng Ngoài ra, một số chủng V parahaemolyticus có gen T3SS2 dẫn đến một số chủng có mức độ gây bệnh khác nhau Bên cạnh các gen T3SS và TDH, V parahaemolyticus còn có hai loại lông roi khác nhau với chức năng bơi cũng như khả năng tạo ra một viên nang Cả hai yếu tố này đều có khả năng giúp các chủng tồn tại trong môi trường và cả trong quá trình xâm chiếm vật chủ [18]

Trong quá trình lây nhiễm, các yếu tố bám dính có mặt trên bề mặt vi khuẩn để hình thành sự tiếp xúc với tế bào chủ, sau đó tiết ra các protein tác động và độc tố

Phân tử kết dính đa hóa trị MAM7 (Multivalent Adhesion Molecule 7) là một chất kết dính gồm một đoạn kỵ nước gồm 44 axit amin ở đầu N, cần thiết cho việc định vị chính xác và neo giữ màng ngoài của protein MAM7 cho phép mầm bệnh bám dính ngay lập tức với tế bào chủ Trong quá trình này, MAM7 sẽ liên kết với cả fibronectin và axit phosphatidic, và nếu một trong hai chất nền này bị chặn, nó có thể ngăn chặn sự bám dính của MAM7 với tế bào chủ [54]

11 Gần như tất cả các chủng V parahaemolyticus phân lập từ các mẫu lâm sàng đều có hoạt tính tan huyết β do TDH hoặc TRH Những chủng phân lập này có khả năng phân giải hồng cầu của con người khi được đặt trên môi trường có hàm lượng muối cao gọi là thạch Wagatsuma, quá trình này được gọi là hiện tượng Kanagawa (KP) TDH là một loại độc tố có thể phân giải tế bào hồng cầu Cấu trúc tinh thể học tia X của TDH cho thấy protein này tạo thành một homotetramer có lỗ trung tâm đường kính 23 Å Kích thước lỗ tương đối lớn này cho phép cả nước và ion chảy qua màng với trở kháng nhỏ Sự thay đổi dòng ion từ các tế bào bị nhiễm trong ruột có thể là cơ chế gây chết tế bào [18] Do đó, TDH đã được công nhận là yếu tố độc lực chính của V parahaemolyticus [92]

Ngoài ra, các cuộc điều tra dịch tễ học cho thấy các chủng âm tính KP không có TDH nhưng có một loại hemolysin liên quan đến TDH (TRH) đã được phân lập từ các bệnh nhân [92] Shirai và cộng sự (1990) đã kiểm tra 215 chủng V parahaemolyticus lâm sàng được phân lập từ bệnh nhân bị tiêu chảy để tìm sự hiện diện của gen mã hóa TDH (tdh) và TRH (trh) và phát hiện ra rằng 52 chủng (24,3%) chỉ mang gen trh [88] TRH được dự đoán sẽ hoạt động theo cách tương tự với việc phá vỡ tế bào dựa trên sự tương đồng trình tự cao (68%) giữa gen trh và tdh Trong một nghiên cứu gần đây, TRH và TDH đã được chứng minh là gây ra mức độ tan máu tương tự trong ống nghiệm và kết quả phân tích cấu trúc cho thấy TRH cũng tồn tại trong phức hợp tetramer Những kết quả này chỉ ra rằng TRH cũng là yếu tố độc lực của V parahaemolyticus Ngoài hai loại độc tố kể trên, một loại độc tố chịu nhiệt (thermolabile hemolysin - TLH) cũng được tìm thấy trong tất cả các chủng V parahaemolyticus, nhưng hiện nay có rất ít thông tin về chức năng của nó [18]

Tương tự như V harveyi, V parahaemolyticus cũng sử dụng hệ tiết loại 3

(T3SS) để tiêm trực tiếp các protein tác động của vi khuẩn vào tế bào chủ Quá trình lây nhiễm tế bào mô của V parahaemolyticus khởi đầu bằng tác động của T3SS1, dẫn đến một loạt các hiện tượng từ chảy máu màng, làm tròn tế bào và cuối cùng là phân giải tế bào [54] Bên cạnh T3SS1, T3SS2 được tìm thấy chủ yếu ở các chủng phân lập lâm sàng và có liên quan đến các chủng V parahaemolyticus gây đại dịch

12 và các đợt bùng phát bệnh lớn Các chủng V parahaemolyticus thiếu T3SS2, không thể tồn tại khi có sự hiện diện của các sinh vật nguyên sinh có roi, cũng như amip Sự có mặt của T3SS2 không chỉ thúc đẩy sự sống sót của vi khuẩn mà còn dẫn đến việc tiêu diệt các sinh vật nguyên sinh [18]

1.3.2 Dịch bệnh thủy sản gây ra bởi Vibrio parahaemolyticus

Vibrio parahaemolyticus là một trong những tác nhân gây bệnh đe dọa khả năng tồn tại của ngành nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là tôm V parahaemolyticus là nguyên nhân gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính hay còn gọi là hội chứng tôm chết sớm (Early Mortality Syndrome - EMS) gây thiệt hại lớn cho ngành nuôi tôm

AHPND được báo cáo lần đầu tiên ở Trung Quốc vào năm 2009, tiếp theo là Malaysia vào năm 2010, Việt Nam năm 2011, Thái Lan năm 2012 và Mexico năm 2013 Năm 2011, các trại nuôi tôm tại các tỉnh Hải Nam , Quảng Đông, Phúc Kiến và Quảng Tây của Trung Quốc đã bị thiệt hại tới gần 80% do dịch EMS Tỷ lệ tử vong do AHPND rất cao khoảng 40-100% [78] Tôm nhiễm AHPND biểu hiện một loạt các dấu hiệu lâm sàng bao gồm lờ đờ, mềm vỏ, cơ trắng, dạ dày và ruột giữa trống rỗng, tăng trưởng chậm và gan tụy teo nhợt nhạt, thường có vệt đen [52] Một nghiên cứu của Pui và cộng sự (2014) tại Sarawak, Malaysia đã phát hiện tỷ lệ nhiễm V parahaemolyticus là 41% ở tôm tại các trang trại nuôi trồng thủy sản và chúng có khả năng lây nhiễm sang người [79] Nghiên cứu khác của Anjay và cộng sự (2014) đã phát hiện gen tdh và trh lần lượt là 55,3% và 0,59% ở các chủng phân lập từ cá và động vật có vỏ ở Ấn Độ [78] Một khảo sát của Letchumanan và cộng sự (2015) cho thấy V parahaemolyticus được phân lập từ các loài động vật có vỏ khác nhau như cua biển (Scylla serrate), cua hoa (Portunus pelagius), nghêu hoa (Paphia textile) [54] V parahaemolyticus đã được chứng minh là gây nhiễm trùng nghiêm trọng ở các loài cá nhiệt đới như cá mú (Epinephelus sp.) ở Trung Quốc, cá chẽm châu Âu [71]

Tại Việt Nam, mức độ nhiễm V parahaemolyticus ở cá, tôm, mực, cua và động vật có vỏ thân mềm lần lượt là 62,5, 72,2, 28,6, 40,0 và 89,2%; tỷ lệ mang gene độc lực tdh và trh ở động vật có vỏ thân mềm lần lượt là 17,9 và 8,0% [70] Trương

13 Thị Mỹ Hạnh và cộng sự (2017) đã phân lập được 9 chủng V parahaemolyticus từ tôm bị bệnh AHPND tại Quỳnh Lưu, Nghệ An; Ngô Thị Huyền và cộng sự (2022) phân lập được 86 mẫu vi khuẩn bao gồm bốn loài Vibrio sp từ nước nuôi thủy sản tại năm khu vực thuộc các tỉnh miền Bắc Việt Nam, trong đó phổ biến là V parahaemolyticus [1] Từ đầu năm 2011, bệnh AHPND đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến nghề nuôi tôm ở Việt Nam với thiệt hại hơn 98000 ha và hơn 46000 ha diện tích nuôi tôm trong năm 2012 tập trung ở một số tỉnh Sóc Trăng, Trà Vinh, Cà Mau, Bạc Liêu và Kiên Giang Ngành nuôi trồng thủy sản của tỉnh Thừa Thiên Huế cũng phải chịu thiệt hại nặng do dịch bệnh gan tụy xảy ra Đầu năm 2010, toàn tỉnh có khoảng 100 ha tôm bị chết trắng, thiệt hại ước tính lên tới 100 tỷ đồng Số liệu năm 2010 và 2011 cho thấy, toàn tỉnh Thừa Thiên Huế có gần 1000 ha tôm bị bệnh trên tổng số 3600 ha nuôi tôm Năm 2012, ngành nuôi tôm mất khoảng 30000 tỉ đồng do bệnh AHPND [6].

Các phương pháp kiểm soát các vi khuẩn Vibrio

Với những nguy cơ gây bệnh cao của các vi khuẩn Vibrio và hậu quả nghiêm trọng kèm theo, có thể thấy việc kiểm soát các vi khuẩn này trong các ao nuôi thủy sản nước lợ là vô cùng cấp thiết Do vậy, cho đến nay đã có nhiều biện pháp được đề xuất để xử lý và kiểm soát các vi khuẩn Vibrio

1.4.1 Các biện pháp vật lý - hóa học

Một trong những giải pháp đầu tiên để kiểm soát vibriosis là thiết lập các hệ thống nuôi trồng thủy sản phù hợp để thực hành phòng chống dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản: địa điểm xây dựng không có nguồn nước thải, phải có mương thoát nước và dẫn nước riêng biệt Ngoài ra, các ao đầm cần cải tạo trước khi nuôi bằng các biện pháp như: nạo vét, phơi khô đáy ao, dùng hóa chất khử trùng để diệt sinh vật trung gian gây bệnh, diệt vi sinh vật gây bệnh và kí sinh trùng (vôi tẩy ao, axit tricloisoxyanuric, quả bồ hòn…) [3] Tuy nhiên, các loại thuốc thủy sản và hóa chất xử lý nước được sử dụng phổ biến nhất như: nofloxacin, calcium hypochlorite, vôi sống, povidone iodine và đồng sunfat có thể làm giảm khả năng miễn dịch bẩm sinh của tôm càng xanh Ngoài ra, một số hóa chất còn làm tăng tỷ lệ tự chết hồng cầu của

14 tôm [63] Việc sử dụng các chất khử trùng có thể có hiệu quả nhưng thường gây ra ô nhiễm thứ cấp và có thể ảnh hưởng đến sức khỏe của tôm cá nên thường chỉ có thể áp dụng trước hoặc sau vụ nuôi Để kiểm soát Vibrio trong nuôi trồng thủy sản, thuốc kháng sinh cũng được sử dụng rộng rãi Theo Dang và cộng sự (2015), 72% trang trại nuôi tôm và cá tại vùng đồng bằng sông Hồng và sông Mekong sử dụng ít nhất 1 loại kháng sinh để kiểm soát dịch bệnh [74] Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh lâu dài dẫn đến hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn Mức độ kháng kháng sinh của các vi khuẩn Vibrio có thể lên tới 97,8%, như được báo cáo bởi Chikwendu [24] Trong nghiên cứu đó, 157 chủng Vibrio phân lập từ nước nuôi thủy sản đều kháng với ít nhất một trong 6 loại kháng sinh được khảo sát Theo Costa và cộng sự (2015), Vibrio spp kháng với β- lactam và tetracycline đã được phát hiện trong ao nuôi thủy sản [11] Một trang trại nuôi tôm sú (P monodon) tại Ấn Độ đã ghi nhận lượng lớn tôm chết vì vi khuẩn V harveyi có khả năng kháng đa dạng các loại kháng sinh như cotrimoxazole, chloramphenicol, erythromycin và streptomycin [48] Tại Việt Nam, kết quả xác định khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn trong mẫu hải sản tươi sống bao gồm cá, hàu, mực và tôm được mua tại các chợ ở Hà Nội cho thấy 85,71% các chủng V parahaemolyticus phân lập được kháng ít nhất 1 loại kháng sinh kiểm tra, trong đó kháng tỷ lệ kháng ampicillin là cao nhất (81,43%), tiếp đến là kháng cefotaxime (11,43%) ceftazidime (11,43%), trimethoprim- sulfamethoxazole (8,57%) và tetracycline (2,86%) [102] Một nghiên cứu khác của Huệ và cộng sự (2022) đã đánh giá tỷ lệ đa kháng kháng sinh của 150 chủng Vibrio spp phân lập từ tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) nuôi thương phẩm được thu mẫu tại Chợ Đầu Mối Bình Điền, Hồ Chí Minh Kết quả kháng sinh đồ cho thấy tỷ lệ đa kháng từ hai đến năm loại kháng sinh là 88,7%, đặc biệt, không có bất kỳ chủng Vibrio spp nào nhạy cảm với tất cả kháng sinh thử nghiệm (ampicillin, ciprofloxacin, chloramphenicol, doxycycline, gentamicin, kanamycin, axit nalidixic, streptomycin, tetracycline và trimethoprim/sulfamethoxazole) [7] Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng V harveyi có thể sống sót trong các trại sản xuất tôm giống do khả năng hình

15 thành các màng sinh học tạo ra khả năng chống lại thuốc kháng sinh và chất khử trùng [114] Hơn nữa, việc sử dụng kháng sinh bừa bãi không những ảnh hưởng đến chính khu vực đó mà còn là nguyên nhân tiềm tàng phát triển các chủng kháng kháng sinh ra môi trường xung quanh Bằng chứng rõ ràng từ nghiên cứu của Buschmann và cộng sự (2012) cho thấy dư lượng kháng sinh, ví dụ như flumequine, được tìm thấy cách xa 8km so với cơ sở nuôi trồng [19] Thêm vào đó, dư lượng kháng sinh còn tồn dư trong thủy sản quá mức sẽ ảnh hưởng đến việc sản xuất và xuất khẩu, thậm chí dẫn đến dị ứng và gây độc ở người [20] Hiện trạng trên cho thấy việc sử dụng hóa chất khử trùng hay kháng sinh để kiểm soát các vi khuẩn Vibrio không phải là một giải pháp bền vững và cần có những giải pháp thay thế hợp lý

1.4.2 Các phương pháp sinh học

Hậu quả tiêu cực tiềm tàng của việc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản đã dẫn đến những gợi ý về việc sử dụng chế phẩm vi sinh Nghiên cứu của Villamil và cộng sự (2003) đã cho thấy sản phẩm ngoại bào từ các chủng vi khuẩn

Lactobacillus có thể ức chế sự phát triển của V alginolyticus [100] Ngoài ra, dịch chiết không chứa tế bào của Bacillus subtilis đã ức chế sự phát triển của V harveyi [96] Theo Dung và cộng sự (2017), Lactobacillus plantarum đã được chứng minh có khả năng kháng V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính [31] Tuy nhiên, thực tế cho thấy việc sử dụng các chế phẩm sinh học bừa bãi cùng với sự mất kiểm soát về chất lượng chế phẩm sinh học khiến cho biện pháp này có hiệu quả chưa cao [16] Hơn nữa, trong quá trình áp dụng chế phẩm sinh học, các hóa chất hoặc thuốc để điều trị các bệnh khác như nấm, bệnh đơn bào gây ra bởi các loài không phải vi khuẩn lại không được phép sử dụng Điều này dẫn đến sự bùng phát các bệnh này [83]

Một trong những chiến lược mới để kiểm soát dịch bệnh vibriosis trong nuôi trồng thủy sản là ức chế quá trình cảm nhận mật độ của vi khuẩn (còn gọi là quorum sensing – QS) [27] QS ảnh hưởng tới sự biểu hiện của nhiều quá trình tế bào, bao gồm các quá trình hoạt động của các gen gây bệnh như phát quang sinh học, sự hình thành bào tử, sự hình thành biofilm, sản xuất kháng sinh, sự tạo thành độc tố, …[67]

16 Hệ thống QS bao gồm các phân tử tín hiệu và một loạt các protein điều hòa đã được xác định trong dịch bệnh thủy sản Ba loại tín hiệu phân tử (AHLs, Al-2 và Cal-1) đã được xác định trong V harveyi, V anguillarum và V parahaemolyticus [39] Một số cách làm gián đoạn QS bao gồm: ức chế tổng hợp các phân tử tín hiệu: triclosan là một chất có thể được sử dụng để ngăn cản quá trình khử từ enoyl-ACP thành Acyl- ACP trong quá trình tổng hợp AHL [41]; sử dụng chất đối kháng QS: sử dụng hợp chất furanone chứa halogen ở tảo đỏ để gắn lên chất đáp ứng điều hòa khiến cho gen tạo AHL bị bất hoạt [33]; gây bất hoạt QS dựa vào enzyme: các enzym có khả năng phân hủy AHL điển hình là AHL-lactonase, paraoxonases (PONs) và AHL-acylase [41]; giải pháp sinh học phân tử can thiệp điều hòa QS: gây đột biến luxO ở V parahaemolyticus hoặc kìm hãm biểu hiện của các nhân tố điều hòa QS chính [94]

Nhìn chung, giải pháp can thiệp vào quá trình Quorum-sensing của các vi khuẩn

Vibrio gây bệnh được coi là có nhiều triển vọng nhưng chưa có kết quả nghiên cứu nào được ứng dụng vào thực tiễn [28]

Một phương pháp hứa hẹn khác có thể kiểm soát các vi khuẩn Vibrio đó là sử dụng thực khuẩn thể (bacteriophage) trong việc điều trị và phòng ngừa bệnh vibriosis Đã có rất nhiều các nghiên cứu tìm ra các bacteriophage trong tự nhiên có thể chống lại Vibrio Ví dụ như phage VhKM4 đã được chứng minh có khả năng chống lại V harveyi do nó có khả năng ly giải mạnh vi khuẩn [53] Hay phage VPT02 chống lại V parahaemolyticus được tìm thấy trong hàu bán ở chợ tại Seoul, Hàn Quốc có khả năng làm tăng tỷ lệ sống của tôm đã bị lây nhiễm V parahaemolyticus từ 16,7% lên đến 46,7% [112] Mặc dù phương pháp này đã được chứng minh là có hiệu quả, hiện chưa có đủ các nghiên cứu mang tính so sánh để chứng minh rằng việc áp dụng phương pháp này nên được thúc đẩy trong thực tế [108]

Do đó, các biện pháp mới giúp kiểm soát sự phát triển của các vi khuẩn Vibrio gây bệnh một cách hiệu quả vẫn đang rất cần thiết Một trong những giải pháp đó là việc sử dụng hệ thống sinh điện hóa có điện cực ở đáy – một công nghệ mới được phát triển gần đây với nhiều triển vọng ứng dụng thực tế

Hệ thống sinh điện hóa có điện cực đáy và tiềm năng kiểm soát tại chỗ vi

1.5.1 Giới thiệu về hệ thống sinh điện hoá có điện cực đáy

Do lo ngại ngày càng tăng về việc cạn kiệt năng lượng từ nhiên liệu hóa thạch, biến đổi khí hậu và ô nhiễm môi trường, các nhà khoa học trên khắp thế giới đã có những nỗ lực đáng kể nhằm khai thác các nguồn năng lượng mới bền vững và thân thiện với môi trường Các hệ thống sinh điện hóa (Bioelectrochemical Systems – BESs) có thể thu năng lượng từ chất thải hữu cơ thông qua quá trình trao đổi chất của vi sinh vật, đã thu hút sự chú ý trong những thập kỷ gần đây như một phương pháp tiềm năng để sản xuất năng lượng sạch cùng với nhiều lợi ích khác như: loại bỏ ni- tơ, xử lý ô nhiễm hữu cơ, cảm biến sinh học [56, 68]

Hệ thống sinh điện hóa có điện cực ở đáy hoặc hệ thống sinh điện hóa bùn đáy

(Sediment BESs - SBESs) là một dạng ứng dụng của BESs, được tạo ra bằng cách đặt cực âm (anode) vào phần đáy giàu hữu cơ và cực dương (cathode) phía trên bề mặt nước [86] Reimers và cộng sự (2001) đã vận hành thành công SBES đầu tiên bằng cách sử dụng các điện cực lưới bạch kim để tạo ra dòng điện từ bùn đáy ở cả đầm lầy và cửa sông [82]

Hình 1.2 Sơ đồ các phản ứng ở điện cực của MFC (A) và SBES (B) [107]

Ghi chú: Anode: cực âm; Cathode: cực dương; Water: nước; sediment: bùn đáy; Org.-C: carbon hữu cơ Khác với pin nhiên liệu vi sinh vật (microbial fuel cell - MFC) có một màng bán thấm hoặc tấm ngăn cách giữa anode và cathode (Hình 1.2A), SBES dựa vào một thế oxi hóa tự nhiên để ngăn cách anode và cathode (Hình 1.2B), do anode được đặt

18 vào bùn đáy nơi ít oxy hòa tan (dissolved oxygen - DO), trong khi cathode được lắp đặt ở bề mặt nước có DO cao hơn [107]

1.5.2 Nguyên lý hoạt động của hệ thống sinh điện hóa có điện cực đáy

Hệ thống sinh điện hóa là các hệ thống trong đó vi sinh vật xúc tác cho các phản ứng điện hóa thông qua tương tác của chúng với các điện cực [25] Trong hệ thống sinh điện hóa có điện cực ở đáy (SBES), các vi khuẩn điện hóa trên anode sẽ phân hủy các hợp chất hữu cơ có trong bùn đáy, tạo ra các electron và proton Các electron sẽ di chuyển từ anode đến cathode theo chênh lệch thế oxy hóa khử qua một mạch ngoài; trong khi đó, proton (thường là H + ) di chuyển tự do dần theo gradient nồng độ tới cathode Ở điện cực cathode, các proton và electron sẽ kết hợp với chất nhận điện tử cuối cùng (thường là oxy) rồi tạo thành nước, hoàn tất phản ứng và đảm bảo sự cân bằng vật chất [86] (Hình 1.3) Hệ thống sinh điện hóa như vậy cho phép các chất hữu cơ ở đáy bị phân giải, nhờ sự xúc tác của vi khuẩn điện hóa, do chênh lệch thế oxi hóa khử lớn với chất nhận điện tử cuối cùng là oxy, mà không cần phải đưa oxy xuống đáy [75]

Hình 1.3 Mô hình và nguyên lý hoạt động của SBES [82]

1.5.3 Sử dụng hệ thống sinh điện hóa xử lý ô nhiễm hữu cơ

Với khả năng chuyển hóa hóa năng trong các chất hữu cơ thành điện năng, hệ thống sinh điện hóa có tiềm năng ứng dụng rất lớn để xử lý ô nhiễm hữu cơ và đồng thời tái tạo năng lượng Vì vậy, đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng các hệ thống sinh điện hóa, trong đó có SBES, để xử lý ô nhiễm hữu cơ trong nhiều trường hợp khác nhau Ví dụ, Song và cộng sự (2010) đã lắp đặt một SBES bên trong một hồ nước ngọt phú dưỡng và nhận thấy rằng 28,3 ± 1,9% hàm lượng chất hữu cơ trong hồ được loại bỏ sau 2 tháng vận hành [91] Trong một nghiên cứu khác, Sajana và cộng sự (2013) đã xây dựng thành công hệ thống SBES tích hợp trong các ao nuôi trồng thủy sản nước ngọt để khảo sát hiệu suất loại bỏ chất thải của nó trong môi trường nước ngọt Kết quả thu được cho thấy hiệu quả xử lý tốt của hệ thống, với 80% COD và 90% ni-tơ tổng số được loại bỏ trong các mẫu nước ao cá ở Ấn Độ [84] Nghiên cứu của Henan và cộng sự (2017) cũng đã thử nghiệm hệ thống sinh điện hóa với điện cực ở đáy quy mô pilot 195L Sau 45 ngày vận hành, hệ thống đã loại bỏ 14,5% lượng cacbon tổng số so với đối chứng không lắp đặt điện cực là 11,6% Lượng ni-tơ tổng số cũng đã được ghi nhận giảm 18,5% tại mô hình lắp đặt hệ thống sau 45 ngày so với 1,9% tại đối chứng không lắp đặt điện cực Nghiên cứu cũng đã chỉ ra khả năng loại bỏ các hợp chất hydrocacbon thơm đa vòng Ví dụ khả năng loại bỏ benzo(a)pyrene và benzo(k)fluoranthene của hệ thống lên tới 50% sau 60 ngày vận hành [55]

Tại Việt Nam, Phạm Thế Hải và cộng sự (2019) đã thử nghiệm một SBES lồng ghép trong mô hình ao nuôi nước lợ mô phỏng ở quy mô phòng thí nghiệm Hệ thống đã loại bỏ lượng COD trong nước tốt hơn 20 - 30% so với đối chứng (phân giải tự nhiên) là mô hình không lồng ghép SBES Hơn nữa, sau 1 năm, lượng bùn đáy của hệ giảm 40%, kéo theo sự giảm khoảng 40% COD và khoảng 52% ni-tơ bùn đáy so với đối chứng Kết quả cho thấy hệ thống có khả năng tăng cường hiệu quả xử lý COD và ni-tơ trong ao nuôi thủy sản nước lợ và có tiềm năng ứng dụng thực tế cao [75]

1.5.4 Sử dụng hệ thống sinh điện hóa xử lý vi sinh vật gây bệnh

Bên cạnh khả năng xử lý ô nhiễm hữu cơ, BES còn có nhiều tiềm năng khác [80], một trong số đó là sự kháng khuẩn được phát hiện gần đây gợi ý những ứng dụng mới

Thật vậy, các nghiên cứu tiên phong cho thấy vi khuẩn có thể bị ức chế ở cathode của BES, do pH tăng hoặc H2O2 từ phản ứng cathode [12, 36-38] Tuy nhiên, sau đó Ieropoulos và cộng sự (2019) phát hiện ra rằng tác dụng diệt khuẩn của anode BES, đặc biệt là đối với vi sinh vật gây bệnh, thậm chí còn rõ ràng hơn Các tác động này được cho là do thế oxy hóa khử âm hơn ở anode [42, 43]

Ngoài ra, mật độ tế bào (CFU/ml) và tín hiệu phát quang (RLU) của vi khuẩn

Salmonella enterica được ghi nhận lần lượt giảm tới 4.43±0.04 log và 4.21±0.01 log khi đi qua hệ thống nhiều tầng MFCs (microbial fuel cell cascade system – một dạng của BES) [43]

Vasieva và cộng sự (2019) đã phân tích quần xã vi sinh (thông qua phân tích metagenomes) của hệ thống MFCs sau 67 ngày vận hành với các nguồn bùn vi sinh vật khác nhau tại anode Kết quả cho thấy tỷ lệ DNA của các vi sinh vật gây bệnh cơ hội đã giảm với việc sử dụng bùn thải từ trang trại lợn làm nguồn vi sinh vật cho anode Đặc biệt, tỷ lệ giảm cao nhất thuộc về họ Enterobacteriaceae như các vi khuẩn

Yersinia, Vibrio và Shigella là nhóm vi khuẩn gây bệnh phổ biến Đồng thời, một lượng lớn các gen gây bệnh chịu tránh nghiệm cho việc bám dính, hệ thống bài tiết, xâm chiếm, kháng kháng sinh liên quan đến các ngành Firmicutes và Actinobacteria của nhóm vi khuẩn Gram dương cũng giảm đáng kể [97]

Những nghiên cứu trên chính là cơ sở cho thấy cần tìm hiểu sâu hơn về khả năng kiểm soát các vi khuẩn của BESs nói chung và SBES nói riêng

1.5.5 Sử dụng hệ thống sinh điện hóa để kiểm soát vi khuẩn Vibrio

Khả năng diệt vi sinh vật gây bệnh của BES là cơ sở cho việc có thể ứng dụng công nghệ SBES để làm giảm các vi khuẩn Vibrio gây bệnh, đặc biệt là trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản Sự tích hợp như vậy trên thực tế là khả thi khi các nghiên

21 cứu gần đây đã cho thấy BES với điện cực ở đáy (hay SBES) hoạt động tốt trong môi trường ao nuôi nước lợ [75]

Nhóm nghiên cứu trước đây đã thực hiện đánh giá khả năng kiểm soát các vi khuẩn Vibrio của SBES với quy mô nhỏ [101] Kết quả nghiên cứu ban đầu cho thấy, khi bổ sung huyền phù dịch vi khuẩn Vibrio harveyi và Vibrio parahaemolyticus trực tiếp vào bể thí nghiệm (chứa SBES) và bể đối chứng (không chứa SBES), tỷ lệ sống sót của V harveyi giảm đáng kể xuống gần 0% ngay sau khi bổ sung vào bể chứa SBES, trong khi nó vẫn sống sót tốt trong bể đối chứng Hiện tượng này cho thấy tác dụng ức chế mạnh mẽ của môi trường SBES đối với V harveyi Sự ức chế dường như ít hơn đối với chủng V parahaemolyticus được thử nghiệm nhưng vẫn mạnh, chỉ có

~10% tế bào V parahaemolyticus sống sót sau 20 phút Các kết quả tiếp theo của nhóm cho thấy,việc tiếp xúc trực tiếp với vi sinh vật trong SBES có thể không phải là nguyên nhân chính gây ra sự ức chế mà thay vào đó là các yếu tố lý hóa SBES

Cuối cùng, nhóm nghiên cứu đã khám phá ra rằng tác dụng ức chế mạnh mẽ của SBES đối với Vibrio chỉ là do các chất được sinh ra trong nước dưới điều kiện sinh điện hóa chứ không phải do các yếu tố vật lý (ví dụ: điện trường hoặc từ trường, v.v.) hoặc do tiếp xúc trực tiếp với vi khuẩn [101].

Mục tiêu nghiên cứu

Có thể thấy, hệ thống sinh điện hóa với điện cực ở đáy không những có khả năng xử lý ô nhiễm hữu cơ mà còn kiểm soát được các vi khuẩn Vibrio gây bệnh

Vậy nên, SBES hứa hẹn sẽ là một phương pháp hiệu quả trong việc kiểm soát dịch bệnh tại các ao nuôi thủy sản Việt Nam Để có thể hướng tới việc ứng dụng SBES trong thực tế nuôi trồng thủy sản nước lợ tại Việt Nam, trong nghiên cứu này, hệ thống sinh điện hóa với điện cực ở đáy quy mô 10 L với độ cao 1,5 m mô phỏng cột nước trong ao nuôi thủy sản nước lợ đã được xây dựng và vận hành Sau đó, đánh giá khả năng ức chế của nước SBES vô trùng đối với hai chủng chuẩn V harveyi

NBRC15634 và V parahaemolyticus NBRC12711 cũng như một chủng V parahaemolyticus kiểu dại phân lập từ tôm bệnh ngoài thực tế, trong các điều kiện vận hành khác nhau phù hợp với điều kiện thực tế trong ao nuôi thủy sản nước lợ tại

22 Việt Nam Cuối cùng, mô hình SBES được lồng ghép vào bể nuôi thủy sản quy mô pilot nuôi tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và đánh giá khả năng ức chế

V parahaemolyticus của SBES khi bổ sung trực tiếp vi khuẩn này vào bể trong các điều kiện khác nhau Kết quả của nghiên cứu này có thể là tiền đề cho một cải tiến kỹ thuật để thực sự áp dụng mô hình lồng ghép SBES vào ao nuôi trong thực tế nhằm kiểm soát vi khuẩn Vibrio

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

2.1.1 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Nghiên cứu và phát triển các công nghệ sinh điện hóa học phục vụ Tăng trưởng xanh (GREENLAB), Trung tâm

Khoa học Sự sống và phòng thí nghiệm bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Vật liệu được sử dụng cho thiết kế và vận hành hệ thống gồm: cột mica, bể composite (Việt Nam), que than chì (Xilong, Trung Quốc), vải than chì (Osaka Gas Chemicals, Nhật Bản), dây dẫn titan (Anh), bột than chì (Kasp security, Anh), hạt than chì (Việt Nam), keo epoxy A&B (Selleys, Úc), điện trở các loại (Việt Nam) (Hình 2.1)

Hình 2.1 Vật liệu xây dựng các hệ thống SBES Ghi chú: (A) vải than chì; (B) thanh than chì; (C) vụn than chì; (D) bột than chì; (F) keo

Epoxy; (E) Các vật liệu khác: điện trở các loại, dây dẫn, kẹp cá sấu

Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu: máy đo điện vạn năng (Extech, Hoa Kỳ), máy đo hiệu điện thế tự động (KEITHLEY 2700, Keithley Instruments Inc.,

24 Hoa Kỳ), máy ly tâm (Eppendorf 5417R, Đức), máy ly tâm (Kubota 5900, Nhật Bản), máy đo quang phổ (BioMate 3, Thermo Scientific, Hoa Kỳ), máy đo quang phổ dải UV/VIS (UV-2450, Shimazu, Nhật Bản), cuvet thạch anh 10mm (Hellma, Đức), máy đo pH (Hanna, Italia), khúc xạ kế đo độ mặn (Grand-index, Trung Quốc), tủ cấy vô trùng cấp 2 (Esco, Indonesia), nồi hấp khử trùng (Autolaves, Nhật Bản), máy lắc ổn nhiệt (WiseCube, Hàn Quốc), máy vortex (Nickel, Anh), máy điều chỉnh thế điện cực Potentiostat (Bitstat 3200, BioLogic, Anh), điện cực chuẩn Ag/AgCl (Basi, Hoa Kỳ), tủ ấm (Lab-Line Imperial III, Hoa Kỳ),

Hóa chất sử dụng cho vận hành hệ thống gồm: muối biển nhân tạo Marinium Reef Sea Salt (Thái Lan), thức ăn cho tôm Gramma 6 (TOMBOY, Việt Nam)

Hóa chất được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật: NaCl, peptone, cao nấm men, thạch, thạch TCBS, nước cất vô trùng Hóa chất được mua từ các hãng Xilong (Trung

Nước lợ nhân tạo (độ mặn 15‰) được tạo ra bằng cách sử dụng muối biển nhân tạo Marinium Reef Sea Salt pha theo tỉ lệ 16,69 g muối/1 L nước cất vô trùng

Môi trường Lubria-Bertani (LB) chứa 3% NaCl (nồng độ này đã được kiểm chứng trước đây bởi nhóm nghiên cứu, cho thấy là tốt nhất cho sự sinh trưởng của các chủng Vibrio) được sử dụng để nuôi cấy và duy trì các chủng vi khuẩn Vibrio có thành phần như sau (Bảng 2.1):

Bảng 2.1 Thành phần môi trường LB 3% NaCl

Agar (nếu môi trường lỏng không bổ sung) 16 g

Nước cất 1000 ml pH=7,5, khử trùng ở 121 o C trong 15 phút

25 Môi trường chọn lọc thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose (TCBS, với thành phần cụ thể trình bày ở Bảng 2.2) dạng pha sẵn (Himedia, Ấn Độ) được sử dụng để nuôi cấy và đếm số lượng khuẩn lạc vi khuẩn Vibrio

Bảng 2.2 Thành phần môi trường TCBS Agar

Nguồn vi sinh vật cho làm giàu vi sinh vật điện hóa ở cột SBES từ bùn đáy của ao nuôi tôm nước lợ tại đầm tôm ở thành phố Quảng Ninh, và bùn của hệ thống SBES đang vận hành tốt trong phòng thí nghiệm

Nguồn vi sinh vật cho làm giàu vi sinh vật điện hóa ở bể pilot SBES từ bùn đáy của ao nuôi tôm nước lợ tại tỉnh Cà Mau và đầm tôm tại thành phố Nam Định, và bùn của hệ thống SBES đang vận hành tốt trong phòng thí nghiệm

Trong nghiên cứu này, các chủng Vibrio harveyi NBRC15634 (viết tắt là Vh),

Vibrio parahaemolyticus NBRC12711 (viết tắt là Vp) (mua từ Bảo tàng giống chuẩn

NBRC, Nhật Bản) và Vibrio parahaemolyticus CED (viết tắt là Vp CED) (kiểu dại,

26 phân lập từ ao nuôi thực tế, cung cấp bởi Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I) được sử dụng làm đại diện của các loài tương ứng trong các thí nghiệm.

Phương pháp

Để tiến hành nghiên cứu này, kế thừa kết quả từ những nghiên cứu trước,sáu mô hình nuôi thủy sản nước lợ quy mô phòng thí nghiệm và bốn bể nuôi thủy sản thực tế quy mô pilot được thiết lập, cụ thể như sau:

+ Sáu cột nhựa mica hình trụ tròn cao 150 cm và đường kính 10 cm (với tổng thể tích khoảng 10 L) được sử dụng làm mô hình ao nuôi thủy sản (Hình 2.2A và Phụ lục 4): ba cột thí nghiệm giống nhau có lồng ghép hệ thống sinh điện hóa có điện cực ở đáy SBES (TN_C1, TN_C2, TN_C3), ba cột đối chứng giống nhau không có SBES (ĐC_C1, ĐC_C2, ĐC_C3) Như vậy mỗi trường hợp thí nghiệm được lặp lại 3 lần

Các cột này được gọi tắt là cột SBES thí nghiệm và cột SBES đối chứng

+ Bốn bể composite cao 74 cm và đường kính mặt đáy là 132 cm, đường kính mặt trên là 144cm được sử dụng làm bể nuôi thủy sản thực tế ở quy mô pilot (Hình

2.2B và Phụ lục 5): hai bể thí nghiệm giống nhau có lồng ghép hệ thống sinh điện hóa có điện cực ở đáy SBES (TN_P1, TN_P2), hai bể đối chứng giống nhau không có SBES (ĐC_P1, ĐC_P2) Các bể này được gọi tắt là bể pilot SBES thí nghiệm và bể pilot đối chứng

Việc lắp đặt SBES trong mỗi bể thí nghiệm tương tự như trong các nghiên cứu trước đây của nhóm [101] Nhìn chung, SBES bao gồm một điện cực anode ở đáy và một điện cực cathode ở trên bề mặt nước Anode bao gồm một lớp hạt than chì (đường kính 2 - 5mm): dày 10 cm đối với cột SBES, dày 1 cm đối với bể pilot SBES phủ kín bề mặt đáy bể và một miếng vải than chì: đường kính 8cm đối với cột SBES, đường kính 45 cm đối với bể pilot SBES ở dưới lớp hạt than chì Một tấm vải than chì cùng loại, đường kính là 4 cm đối với cột SBES và là 30 cm đối với bể pilot SBES được sử dụng làm cathode nổi trên mặt nước (50% tiếp xúc với nước và 50% với không khí) Một thanh than chì (đường kính 5 mm) được dán vào vải than chì của điện cực bằng hỗn hợp keo epoxy A&B và bột than chì (theo tỷ lệ 1 : 1 : 1) để thu dòng điện

27 Các thanh than chì của anode và cathode được nối bằng dây titan (điện trở không đáng kể) với mạch ngoài chứa điện trở mặc định là 10 Ω (nếu không được thử nghiệm thay đổi trong các thí nghiệm) để tạo thành mạch kín Phần thanh than chì của anode và dây titan ngâm trong nước được bọc bằng ống acrylic trơ để tránh hiện tượng đoản mạch Mỗi cột thí nghiệm (lồng ghép SBES) có các van ở vị trí tương ứng với anode và cathode để lấy mẫu và lắp đăt điện cực tham khảo (Hình 2.2A) Mỗi cột mô hình và bể pilot được đổ đầy nước lợ nhân tạo (độ mặn 15‰) đến chiều cao mặc định

Hình 2.2 Mô hình bể thí nghiệm Ghi chú: (A) Mô hình cột nước SBES (B) Mô hình bể pilot SBES 2.2.2 Làm giàu vi sinh vật điện hóa trong các hệ thống sinh điện hóa có điện cực đáy

Trước tiên, để có nguồn vi sinh vật phục vụ cho việc làm giàu vi sinh vật điện hóa, mỗi mô hình cột nước (cả thí nghiệm và đối chứng) được bổ sung 500 g hỗn hợp bao gồm 400 g bùn đáy của ao nuôi tôm nước lợ tại đầm tôm ở thành phố Quảng Ninh, và 100 g bùn của hệ thống SBES đang vận hành tốt trong phòng thí nghiệm

Sau đó, do các mô hình cột nước không có tôm, lượng thức ăn cho vào hàng ngày

28 được tính sao cho mô phỏng lượng thức ăn thừa và lượng chất hữu cơ do thủy sản tạo ra trên thực tế Đây cũng chính là nguồn dinh dưỡng giúp làm giàu hệ vi sinh vật điện hóa dưới đáy Như vậy, lượng thức ăn bổ sung vào các cột là 50% lượng thức ăn của thủy sản, là 22 kg/ngày cho diện tích 1000 m 2 [4], tương đương với 22 g/ngày/m 2 Hệ thống cột SBES trong nghiên cứu này có thể tích là 10 L, nên lượng thức ăn bổ sung là 0,5 × 22 g/ngày/m 2 × 0,01; xấp xỉ 0,1 g/ngày Vì vậy, lượng thức ăn dược bổ sung là 0,1 g/ngày để mô phỏng điều kiện ao nuôi trong thực tế.

Tương tự, mô hình bể pilot có nuôi tôm (cả thí nghiệm và đối chứng) được bổ sung 1000 g hỗn hợp bao gồm 400 g bùn đáy của ao nuôi tôm nước lợ tại tỉnh Cà Mau và 500 g bùn đáy của đầm tôm tại thành phố Nam Định và 100 g bùn của hệ thống SBES đang vận hành tốt trong phòng thí nghiệm Sau đó, mô hình được bổ sung nước lợ đến độ cao mặc định và thả tôm với mật độ 150 con/bể (trọng lượng 200 g/150 con) Thức ăn cho tôm được bổ sung vào tháng đầu tiên là khoảng 30 g/bữa x 4 bữa/ngày; tháng thứ 2 là khoảng 60 g/bữa x 4 bữa/ngày; tháng thứ 3 là khoảng 40 g/bữa x 4 bữa/ngày Lượng chất hữu cơ từ thức ăn thừa và chất thải của tôm chính là nguồn dinh dưỡng để làm giàu hệ vi sinh vật điện hóa dưới đáy

2.2.3 Các kỹ thuật điện hóa

Sự biến động của hiệu điện thế được ghi lại bằng máy đo điện kĩ thuật số Dữ liệu được ghi lại theo chu kỳ 5 phút/lần Dữ liệu được xử lý và vẽ dưới dạng biểu đồ bằng Microsoft Excel Dòng điện được tạo bởi SBES được tính bằng công thức (Định luật Ohm):

Trong đó: I: Cường độ dòng điện (Ampe - A)

U: Hiệu điện thế (Volt - V) R: Điện trở ngoài (Ohm - Ω) Dữ liệu về cường độ dòng điện được phân tích dựa trên việc tính các giá trị trung bình và sai số bằng các thuật toán cơ bản trong phần mềm Excel, và được thể hiện ở dạng đồ thị để theo dõi và đánh giá sự thay đổi trong các thí nghiệm

29 Thế điện cực được điều chỉnh bằng máy Potentiostat Thế oxy hóa khử của điện cực quan tâm được đo hoặc/và điều chỉnh so với một điện cực tham khảo (reference electrode) là Ag/AgCl (có thế là -195 mV so với SHE – điện cực hydro tiêu chuẩn)

2.2.4 Chuẩn bị các dịch huyền phù để thử nghiệm và phương pháp xác định mật độ vi khuẩn

Các chủng vi khuẩn Vibrio đều được nuôi và giữ trên môi trường LB (chứa 3% NaCl)

Các chủng Vibrio sẽ được chuẩn bị như sau: (i) cấy ria 3 pha trên đĩa LB (chứa 3% NaCl) và nuôi cấy ở 30°C (với Vh) hoặc 37°C (với Vp, Vp CED) trong 16 giờ;

(ii) nhặt 4 - 5 khuẩn lạc để nuôi lắc trong môi trường LB lỏng (chứa 3% NaCl) ở 200rpm, 30°C (với Vh) hoặc 37°C (với Vp, Vp CED), trong 4 giờ; (iii) thu cặn tế bào từ môi trường nuôi cấy lỏng bằng cách ly tâm (6000 vòng/phút, 4°C, trong 5 phút); và cuối cùng thêm thể tích nước lợ nhân tạo thích hợp (có độ mặn 15‰) sao cho mật độ tế bào trong dịch huyền phù cuối cùng là khoảng 1 x 10 8 CFU/mL đối với Vp; 1 x 10 10 CFU/mL đối với Vh và Vp CED

Trong quá trình tiến hành mỗi thí nghiệm với các cột nước, các mẫu (dịch) cần quan tâm được thu, pha loãng với mức độ phù hợp và cấy trải trên đĩa TCBS và ủ ở 30°C hoặc 37°C, tương ứng với Vh hoặc Vp, Vp CED, trong 16 giờ Sau đó, số lượng khuẩn lạc vi khuẩn Vibrio tương ứng được đếm để tính giá trị CFU/ml trong từng mẫu đó

Bố trí thí nghiệm

2.3.1 Các thí nghiệm kiểm tra khả năng ức chế các vi khuẩn Vibrio của SBES lồng ghép trong mô hình nuôi thủy sản quy mô 10 L

Trong các thí nghiệm dưới đây, chúng tôi chỉ kiểm tra nước cột SBES vô trùng (đó đi qua màng lọc 0,22àm) vỡ kết quả nghiờn cứu trước đõy của chỳng tụi cho thấy tác dụng ức chế Vibrio chủ yếu là do (một số) chất được sinh ra trong phần nước của hệ thống, không liên quan đến các yếu tố vật lý và tương tác trực tiếp giữa vi sinh vật [101] Đối với mỗi thớ nghiệm, 100 àL huyền phự tế bào chứa khoảng 1 x 10 7 CFU/mL đối với Vp hoặc khoảng 1 x 10 9 CFU/mL đối với Vh và Vp CED (được chuẩn bị như mô tả ở trên) được bổ sung vào 4,5 mL dịch lọc cần quan tâm Do đó, mật độ vi khuẩn thử nghiệm đã giảm xuống còn khoảng 2,2 x 10 5 CFU/mL đối với Vp và khoảng 2,2 x 10 7 CFU/mL đối với Vh, Vp CED Đây là mật độ thực tế được thử nghiệm Mật độ tế bào này là liều lượng gây ra tử vong đối với tất cả giai đoạn sinh trưởng của ấu trùng tôm, tối thiểu là 10 5 CFU/mL đối với Vp và 10 7 CFU/mL đối với Vh [8]

2.3.1.1 Thí nghiệm kiểm tra khả năng ức chế Vibrio tổng số có sẵn trong bùn đáy của cột SBES Để đánh giá mật độ Vibrio tổng số trong mẫu bùn đáy trước và sau khi được sử dụng trong hệ thống SBES, 1 g bùn trước và sau khi bổ sung vào các cột nước 5

31 tháng được lấy ra và hòa với 9 mL NaCl 0,9% Dịch huyền phù thu được được pha loóng bằng nước muối biển 15‰ tại cỏc nồng độ thớch hợp, và cấy trải (100àL) trờn đĩa thạch TCBS, rồi đếm khuẩn lạc sau khi ủ 30°C trong 48 tiếng

2.3.1.2 Thí nghiệm kiểm tra khả năng ức chế các vi khuẩn Vibrio bằng dịch lọc cột nước SBES gần vị trí cathode hoặc anode

100 àL huyền phự tế bào chứa khoảng 1 x 10 7 CFU/mL đối với Vp; 1 x 10 9 CFU/mL đối với Vh và Vp CED (chuẩn bị như mô tả ở mục 2.2.4) được bổ sung vào 4,5 mL dịch nước cột thí nghiệm và đối chứng, lấy ở vị trí gần cathode hoặc anode tùy theo mục đích thí nghiệm Đối với trường hợp đối chứng: vị trí bên trên gần bề mặt nước được coi tương đương với vị trí cathode, vị trí ở dưới đáy bùn của cột được coi tương đương vị trí anode Các dịch thử nghiệm đã được lọc trước đó bằng màng lọc 0,22 àm (để loại bỏ vi sinh vật) Tỷ lệ sống sút của cỏc vi khuẩn Vibrio trong cỏc mẫu được xác định (như trình bày ở mục 2.2.4) sau 5 phút, 30 phút, 90 phút và 180 phút

Từ các phần tiếp theo, dịch lọc của cột thí nghiệm (có SBES) và cột đối chứng

(khụng cú SBES) tại vị trớ gần cathode/anode được đi qua màng lọc 0,22àm được gọi tương ứng là dịch lọc cathode/anode của TN/ĐC

2.3.1.3 Thí nghiệm kiểm tra khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio harveyi và Vibrio parahaemolyticus khi chúng có mặt cùng lúc bằng dịch lọc cột nước SBES gần vị trí anode

100 àL huyền phự tế bào chứa khoảng 1x10 7 CFU/mL với Vp và 100 àL 10 9 CFU/mL với Vh (chuẩn bị như mô tả ở trên) được bổ sung vào 4,5 mL dịch lọc anode của TN và ĐC) Tỷ lệ sống sót của các vi khuẩn Vibrio trong các mẫu được xác định (như trình bày ở mục 2.2.4) sau 5 phút, 30 phút, 90 phút và 180 phút

2.3.1.4 Thí nghiệm kiểm tra ảnh hưởng của các điều kiện vận hành tới khả năng ức chế các vi khuẩn Vibrio của hệ thống sinh điện hóa có điện cực ở đáy quy mô 10 L Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: Cơ chất của vi khuẩn chủ yếu là các chất hữu cơ mà nồng độ được thể hiện qua nhu cầu oxy hóa học (Chemical Oxygen Demand – COD) Vì vậy, lượng thức ăn bổ sung vào các cột nước được thay đổi, tương ứng

32 là 0,1; 0,2; 0,3 và 0,9 g/ngày, để đạt các nồng độ COD thử nghiệm lần lượt là 94,1;

188,2; 282,3 và 846,9 mg/L Mỗi mức COD được thử nghiệm trong 7 ngày, sau đó dịch lọc anode của các cột nước được đánh giá khả năng ức chế Vibrio Các điều kiện vận hành khác là mặc định và giống nhau giữa sáu cột Ảnh hưởng của pH: Các pH được thử nghiệm lần lượt là 5, 7, 9 và 11 pH của nước trong các cột TN_C1, TN_C2, TN_C3, ĐC_C1, ĐC_C2 và ĐC_C3 được điều chỉnh bằng cách bổ sung thêm dung dịch NaOH 1M hoặc HCl 1M và duy trì như vậy trong 3 ngày, sau đó dịch lọc anode được đánh giá khả năng ức chế Vibrio Các điều kiện vận hành khác là mặc định và giống nhau giữa sáu cột Ảnh hưởng của thế oxy hóa khử: Các mức thế oxy hóa khử tại anode được thử nghiệm trong thí nghiệm lần lượt là -800, -400, -280, -180, -80, +20, +120, +220,

+400 mV (vs Ag/AgCl (3M KCl)) Việc áp đặt các mức thế vào anode của hệ thống SBES được thực hiện bằng cách sử dụng máy điều chỉnh thế điện cực Potentiostat và điện cực chuẩn Ag/AgCl Theo đó, dây điện cực tham khảo của máy Potentiostat được nối với điện cực chuẩn Ag/AgCl, dây điện cực làm việc của Potentiostat được nối với dây titan của điện cực anode Điện cực chuẩn Ag/AgCl sau đó được tiếp xúc với dịch cột nước tại anode thông qua một vòi nước có van điều chỉnh tại anode của cột (Hình 2.2A) Sau đó, dịch lọc anode được đánh giá khả năng ức chế Vibrio Các điều kiện vận hành khác là mặc định và giống nhau giữa sáu cột Ảnh hưởng của điện trở ngoài: Dựa vào đường cong phân cực (Phụ lục 1), các mức điện trở ngoài đặc biệt gồm: 10, 100, 560 và 1120 Ω được chọn để tiến hành thử nghiệm SBES được vận hành với mỗi điện trở bên ngoài nêu trên trong 3 ngày, sau đó dịch lọc anode được đánh giá khả năng ức chế Vibrio Các điều kiện vận hành khác là mặc định (ngoại trừ điện trở ngoài) và giống nhau giữa sáu cột Ảnh hưởng của khoảng cách anode và cathode: Khoảng cách giữa anode và cathode được thay đổi bằng cách giữ nguyên vị trí anode và thay đổi vị trí cathode (cathode luôn được giữ trên bề mặt nước), bao gồm (i) 130 cm (dc, khoảng cách mặc định của cột), (ii) 117 cm (dc - 10%dc), và (iii) 104 cm (dc - 20%dc) SBES được vận

33 hành với mỗi vị trí trong 3 ngày, sau đó dịch lọc anode được đánh giá khả năng ức chế Vibrio Các điều kiện vận hành khác là mặc định và giống nhau giữa sáu cột Ảnh hưởng của vị trí cathode: Vị trí cathode được thay đổi bằng cách giữa nguyên vị trí anode (ngập trong hạt than chì) và thay đổi vị trí cathode so với bề mặt nước, bao gồm (i) trên bề mặt nước (h mặc định), (ii) ngập dưới bề mặt nước 13 cm (h -10%h), và (iii) ngập dưới bề mặt nước 26 cm (h -20%h) SBES đã được vận hành với mỗi vị trí trong 3 ngày, sau đó dịch lọc anode được đánh giá khả năng ức chế

Vibrio Các điều kiện vận hành khác là mặc định và giống nhau giữa sáu cột Ảnh hưởng của vị trí anode: Vị trí anode được thay đổi bằng cách giữ nguyên vị trí cathode (trên bề mặt nước) và thay đổi vị trí anode so với bề mặt hạt than chì, bao gồm: (i) anode ở dưới lớp hạt than chì (trường hợp mặc định), (ii) anode ở ngay trên bề mặt và tiếp xúc với lớp hạt than chì, và (iii) anode ở trên cách 4 cm với lớp hạt than chì SBES đã được vận hành với mỗi vị trí trong 3 ngày, sau đó dịch lọc anode được đánh giá khả năng ức chế Vibrio Các điều kiện vận hành khác là mặc định và giống nhau giữa sáu cột

Trong tất cả thớ nghiệm trờn, 100 àL huyền phự tế bào chứa khoảng 1x10 7 CFU/mL đối với Vp; 10 9 CFU/mL đối với Vh và Vp CED (chuẩn bị như mô tả ở mục 2.2.4) được bổ sung vào 4,5 mL dịch lọc anode cần được đánh giá của TN hay ĐC

Tỷ lệ sống sót của các vi khuẩn Vibrio trong các mẫu được xác định (như trình bày ở mục 2.2.4) sau 5 phút, 30 phút, 90 phút và 180 phút

2.3.2 Các thí nghiệm kiểm tra khả năng ức chế Vibrio parahaemolyticus của

SBES ở quy mô pilot Đối với các thí nghiệm kiểm tra khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, 1 L huyền phù tế bào Vp chứa khoảng 1 x 10 8 CFU/mL (chuẩn bị như mô tả ở mục 2.2.4) được bổ sung vào nước bể pilot, để đạt mật độ tế bào khoảng 1 x 10 5 CFU/mL Đây là mật độ thực tế được thử nghiệm Mật độ tế bào này là liều lượng tối thiểu gây ra tử vong đối với tất cả giai đoạn sinh trưởng của ấu trùng tôm [8]

2.3.2.1 Thí nghiệm kiểm tra tính an toàn của hệ thống SBES đối với tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei)

150 con tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei), trọng lượng 200 g/150 con, được bổ sung vào mỗi bể pilot từ ngày đầu tiên xây dựng hệ thống Sau 22 ngày vận hành, mỗi bể được kéo lưới 4 lần để đếm số lượng tôm còn sống và đo trọng lượng của tôm; từ đó, đánh giá tính an toàn của hệ thống SBES đối với sức khỏe của tôm thẻ chân trắng

2.3.2.2 Thí nghiệm kiểm tra khả năng ức chế Vibrio tổng số có sẵn trong bùn đáy và nước bể Để đánh giá mật độ Vibrio tổng số trong bùn đáy và trong nước bể khi vận hành SBES, 1 g mẫu bùn đáy hoặc 1 mL mẫu nước tương ứng trong bể pilot từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 22 vận hành hệ thống được lấy ra và hòa với 9 mL nước muối biển nhân tạo 15‰ Các dịch thu được được pha loãng bằng nước muối biển 15‰ tại các nồng độ thích hợp, và kiểm tra mật độ (CFU/mL) bằng cấy trải và đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch TCBS sau khi ủ 30°C trong 48 tiếng

2.3.2.3 Thí nghiệm kiểm tra khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus được bổ sung từ bên ngoài của bể pilot SBES trong bùn đáy và nước bể nuôi