CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.3 Bố trí thí nghiệm
2.3.1 Các thí nghiệm kiểm tra khả năng ức chế các vi khuẩn Vibrio của SBES lồng ghép trong mô hình nuôi thủy sản quy mô 10 L
Trong các thí nghiệm dưới đây, chúng tôi chỉ kiểm tra nước cột SBES vô trùng (đó đi qua màng lọc 0,22àm) vỡ kết quả nghiờn cứu trước đõy của chỳng tụi cho thấy tác dụng ức chế Vibrio chủ yếu là do (một số) chất được sinh ra trong phần nước của hệ thống, không liên quan đến các yếu tố vật lý và tương tác trực tiếp giữa vi sinh vật [101].
Đối với mỗi thớ nghiệm, 100 àL huyền phự tế bào chứa khoảng 1 x 107 CFU/mL đối với Vp hoặc khoảng 1 x 109 CFU/mL đối với Vh và Vp CED (được chuẩn bị như mô tả ở trên) được bổ sung vào 4,5 mL dịch lọc cần quan tâm. Do đó, mật độ vi khuẩn thử nghiệm đã giảm xuống còn khoảng 2,2 x 105 CFU/mL đối với Vp và khoảng 2,2 x 107 CFU/mL đối với Vh, Vp CED. Đây là mật độ thực tế được
thử nghiệm. Mật độ tế bào này là liều lượng gây ra tử vong đối với tất cả giai đoạn sinh trưởng của ấu trùng tôm, tối thiểu là 105 CFU/mL đối với Vp và 107 CFU/mL đối với Vh [8].
2.3.1.1 Thí nghiệm kiểm tra khả năng ức chế Vibrio tổng số có sẵn trong bùn đáy của
cột SBES.
Để đánh giá mật độ Vibrio tổng số trong mẫu bùn đáy trước và sau khi được sử dụng trong hệ thống SBES, 1 g bùn trước và sau khi bổ sung vào các cột nước 5
31 tháng được lấy ra và hòa với 9 mL NaCl 0,9%. Dịch huyền phù thu được được pha
loóng bằng nước muối biển 15‰ tại cỏc nồng độ thớch hợp, và cấy trải (100àL) trờn đĩa thạch TCBS, rồi đếm khuẩn lạc sau khi ủ 30°C trong 48 tiếng.
2.3.1.2 Thí nghiệm kiểm tra khả năng ức chế các vi khuẩn Vibrio bằng dịch lọc cột nước SBES gần vị trí cathode hoặc anode.
100 àL huyền phự tế bào chứa khoảng 1 x 107 CFU/mL đối với Vp; 1 x 109 CFU/mL đối với Vh và Vp CED (chuẩn bị như mô tả ở mục 2.2.4) được bổ sung vào 4,5 mL dịch nước cột thí nghiệm và đối chứng, lấy ở vị trí gần cathode hoặc anode tùy theo mục đích thí nghiệm. Đối với trường hợp đối chứng: vị trí bên trên gần bề
mặt nước được coi tương đương với vị trí cathode, vị trí ở dưới đáy bùn của cột được coi tương đương vị trí anode. Các dịch thử nghiệm đã được lọc trước đó bằng màng lọc 0,22 àm (để loại bỏ vi sinh vật). Tỷ lệ sống sút của cỏc vi khuẩn Vibrio trong cỏc mẫu được xác định (như trình bày ở mục 2.2.4) sau 5 phút, 30 phút, 90 phút và 180 phút.
Từ các phần tiếp theo, dịch lọc của cột thí nghiệm (có SBES) và cột đối chứng
(khụng cú SBES) tại vị trớ gần cathode/anode được đi qua màng lọc 0,22àm được gọi tương ứng là dịch lọc cathode/anode của TN/ĐC.
2.3.1.3 Thí nghiệm kiểm tra khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio harveyi và Vibrio parahaemolyticus khi chúng có mặt cùng lúc bằng dịch lọc cột nước SBES gần vị trí anode
100 àL huyền phự tế bào chứa khoảng 1x107 CFU/mL với Vp và 100 àL 109 CFU/mL với Vh (chuẩn bị như mô tả ở trên) được bổ sung vào 4,5 mL dịch lọc anode
của TN và ĐC). Tỷ lệ sống sót của các vi khuẩn Vibrio trong các mẫu được xác định (như trình bày ở mục 2.2.4) sau 5 phút, 30 phút, 90 phút và 180 phút.
2.3.1.4 Thí nghiệm kiểm tra ảnh hưởng của các điều kiện vận hành tới khả năng ức chế các vi khuẩn Vibrio của hệ thống sinh điện hóa có điện cực ở đáy quy mô 10 L
Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: Cơ chất của vi khuẩn chủ yếu là các chất hữu
cơ mà nồng độ được thể hiện qua nhu cầu oxy hóa học (Chemical Oxygen Demand – COD). Vì vậy, lượng thức ăn bổ sung vào các cột nước được thay đổi, tương ứng
32 là 0,1; 0,2; 0,3 và 0,9 g/ngày, để đạt các nồng độ COD thử nghiệm lần lượt là 94,1;
188,2; 282,3 và 846,9 mg/L. Mỗi mức COD được thử nghiệm trong 7 ngày, sau đó dịch lọc anode của các cột nước được đánh giá khả năng ức chế Vibrio. Các điều kiện
vận hành khác là mặc định và giống nhau giữa sáu cột.
Ảnh hưởng của pH: Các pH được thử nghiệm lần lượt là 5, 7, 9 và 11. pH của
nước trong các cột TN_C1, TN_C2, TN_C3, ĐC_C1, ĐC_C2 và ĐC_C3 được điều
chỉnh bằng cách bổ sung thêm dung dịch NaOH 1M hoặc HCl 1M và duy trì như vậy trong 3 ngày, sau đó dịch lọc anode được đánh giá khả năng ức chế Vibrio. Các điều kiện vận hành khác là mặc định và giống nhau giữa sáu cột.
Ảnh hưởng của thế oxy hóa khử: Các mức thế oxy hóa khử tại anode được thử
nghiệm trong thí nghiệm lần lượt là -800, -400, -280, -180, -80, +20, +120, +220,
+400 mV (vs. Ag/AgCl (3M KCl)). Việc áp đặt các mức thế vào anode của hệ thống SBES được thực hiện bằng cách sử dụng máy điều chỉnh thế điện cực Potentiostat và điện cực chuẩn Ag/AgCl. Theo đó, dây điện cực tham khảo của máy Potentiostat được nối với điện cực chuẩn Ag/AgCl, dây điện cực làm việc của Potentiostat được nối với dây titan của điện cực anode. Điện cực chuẩn Ag/AgCl sau đó được tiếp xúc với dịch cột nước tại anode thông qua một vòi nước có van điều chỉnh tại anode của
cột (Hình 2.2A). Sau đó, dịch lọc anode được đánh giá khả năng ức chế Vibrio. Các điều kiện vận hành khác là mặc định và giống nhau giữa sáu cột.
Ảnh hưởng của điện trở ngoài: Dựa vào đường cong phân cực (Phụ lục 1), các
mức điện trở ngoài đặc biệt gồm: 10, 100, 560 và 1120 Ω được chọn để tiến hành thử nghiệm. SBES được vận hành với mỗi điện trở bên ngoài nêu trên trong 3 ngày, sau đó dịch lọc anode được đánh giá khả năng ức chế Vibrio. Các điều kiện vận hành
khác là mặc định (ngoại trừ điện trở ngoài) và giống nhau giữa sáu cột.
Ảnh hưởng của khoảng cách anode và cathode: Khoảng cách giữa anode và
cathode được thay đổi bằng cách giữ nguyên vị trí anode và thay đổi vị trí cathode (cathode luôn được giữ trên bề mặt nước), bao gồm (i) 130 cm (dc, khoảng cách mặc định của cột), (ii) 117 cm (dc - 10%dc), và (iii) 104 cm (dc - 20%dc). SBES được vận
33 hành với mỗi vị trí trong 3 ngày, sau đó dịch lọc anode được đánh giá khả năng ức chế Vibrio. Các điều kiện vận hành khác là mặc định và giống nhau giữa sáu cột.
Ảnh hưởng của vị trí cathode: Vị trí cathode được thay đổi bằng cách giữa
nguyên vị trí anode (ngập trong hạt than chì) và thay đổi vị trí cathode so với bề mặt nước, bao gồm (i) trên bề mặt nước (h mặc định), (ii) ngập dưới bề mặt nước 13 cm (h -10%h), và (iii) ngập dưới bề mặt nước 26 cm (h -20%h). SBES đã được vận hành
với mỗi vị trí trong 3 ngày, sau đó dịch lọc anode được đánh giá khả năng ức chế
Vibrio. Các điều kiện vận hành khác là mặc định và giống nhau giữa sáu cột.
Ảnh hưởng của vị trí anode: Vị trí anode được thay đổi bằng cách giữ nguyên
vị trí cathode (trên bề mặt nước) và thay đổi vị trí anode so với bề mặt hạt than chì, bao gồm: (i) anode ở dưới lớp hạt than chì (trường hợp mặc định), (ii) anode ở ngay trên bề mặt và tiếp xúc với lớp hạt than chì, và (iii) anode ở trên cách 4 cm với lớp
hạt than chì. SBES đã được vận hành với mỗi vị trí trong 3 ngày, sau đó dịch lọc anode được đánh giá khả năng ức chế Vibrio. Các điều kiện vận hành khác là mặc
định và giống nhau giữa sáu cột.
Trong tất cả thớ nghiệm trờn, 100 àL huyền phự tế bào chứa khoảng 1x107 CFU/mL đối với Vp; 109 CFU/mL đối với Vh và Vp CED (chuẩn bị như mô tả ở mục 2.2.4) được bổ sung vào 4,5 mL dịch lọc anode cần được đánh giá của TN hay ĐC.
Tỷ lệ sống sót của các vi khuẩn Vibrio trong các mẫu được xác định (như trình bày ở mục 2.2.4) sau 5 phút, 30 phút, 90 phút và 180 phút.