Nghiên cứu Ứng dụng vi khuẩn tía quang hợp trong tạo vật liệu phủ vi sinh bảo vệ beton cho hệ thống cống thu gom nước thải

Nghiên cứu Ứng dụng vi khuẩn tía quang hợp trong tạo vật liệu phủ vi sinh bảo vệ beton cho hệ thống cống thu gom nước thải

1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Ánh Huyền

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP TRONG TẠO VẬT LIỆU PHỦ VI SINH BẢO VỆ BETON CHO HỆ

THỐNG CỐNG THU GOM NƯỚC THẢI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2023

2 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Ánh Huyền

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP TRONG TẠO VẬT LIỆU PHỦ VI SINH BẢO VỆ BETON CHO HỆ

THỐNG CỐNG THU GOM NƯỚC THẢI

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số:8420201.22

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS Đinh Thuý Hằng PGS.TS Phạm Thế Hải

Hà Nội - 2023

3

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Đinh Thuý Hằng, PGS.TS Phạm Thế Hải và TS Nguyễn Thị Hải là những người đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện đề tài, giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này

Tôi cũng mong muốn được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Ban lãnh đạo và các cán bộ Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết bị và cơ sở vật chất cho tôi hoàn thành các nội dung nghiên cứu

Tôi xin cảm ơn đề tài NĐT/KR/21/19: “Nghiên cứu phát triển vật liệu phủ vi sinh (Biomimetic) bảo vệ beton cho hệ thống cống thu gom nước thải” đã tạo điều kiện cho tôi được tham gia thực hiện các nội dung nghiên cứu

Tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô giáo, cán bộ khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ và trang bị những kiến thức hữu ích cho tôi trong thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, các anh chị đồng nghiệp đã luôn cổ vũ, động viên tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày……tháng… năm 2023

Học viên

Nguyễn Ánh Huyền

4

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 11

Chương 1 TỔNG QUAN 13

1.1 Ăn mòn cống beton dẫn nước thải và các biện pháp xử lý hiện tại 13

1.1.1 Ăn mòn trong hệ thống cống beton dẫn nước thải 13

1.1.2 Nguyên nhân gây ăn mòn cống beton 14

1.1.3 Các biện pháp xử lý hiện tại 15

1.2 Vi khuẩn tía không lưu huỳnh và ứng dụng trong tạo vật liệu phủ beton 17

1.2.1 Tính đa dạng và phân bố trong tự nhiên 17

1.2.2 Các đặc điểm sinh lý của PNSB liên quan đến ứng dụng tạo vật liệu phủ 19

2.2 Sơ đồ các bước nghiên cứu 27

2.3 Phương pháp nghiên cứu 28

2.3.1 Làm giàu và phân lập PNSB 28

2.3.2 Phân loại PNSB 29

2.3.2.1 Tách DNA tổng số của các chủng vi khuẩn thuần khiết 29

5

2.3.2.2 Giải trình tự các gen 16S rRNA và gen pufM và dựng cây phân loại 29

2.3.2.3 Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn 31

2.3.3 Đánh giá các hoạt tính sinh học 31

2.3.3.1 Đánh giá khả năng sử dụng sulfide 31

2.3.3.2 Đánh giá khả năng sinh EPS 32

2.3.3.3 Đánh giá khả năng tạo Biofilm 33

2.3.3.4 Đánh giá khả năng sinh trưởng trong điều kiện kiềm 34

2.3.4 Cố định vi khuẩn trong vật liệu rỗng dưới áp suất âm 35

2.3.5 Đánh giá khả năng sống sót của các chủng PNSB trong môi trường vật liệu phủ 36

2.3.6 Đánh giá hiệu quả bảo vệ beton của lớp phủ vi sinh trong mô hình PTN 37

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 Làm giàu và phân lập PNSB 41

3.2 Xác định vị trí phân loại của các chủng PNSB 42

3.3 Nghiên cứu các đặc tính sinh học của hai chủng PN6 và PN7 liên quan đến tiềm năng ứng dụng trong chế tạo vật liệu phủ vi sinh 44

3.3.1 Khả năng sử dụng sulfide 44

3.3.2 Khả năng sinh EPS và tạo biofilm 46

3.3.3 Khả năng sinh trưởng trong môi trường kiềm 48

3.4 Cố định vi khuẩn PNSB vào vật liệu rỗng 50

3.5 Đánh giá khả năng sống sót của các chủng PNSB trong môi trường vật liệu phủ 52

3.6 Hiệu quả bảo vệ beton của vật liệu phủ chứa PNSB 53

3.6.1 Đánh giá hiệu quả bảo vệ beton trong pha khí 53

3.6.2 Đánh giá hiệu quả bảo vệ beton trong thí nghiệm tiếp xúc pha nước 56

6

KẾT LUẬN 58TÀI LIỆU THAM KHẢO 59PHỤ LỤC 66

7

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Các loài vi khuẩn tía quang hợp không lưu huỳnh 18

Bảng 2 Đặc điểm sinh học của PNSB 19

Bảng 3 Các loại vermiculite thô với các kích thước hạt và khối lượng riêng khác nhau 24

Bảng 4 Thông số kỹ thuật của Vermiculite Việt Nam 26

Bảng 5 Môi trường khoáng PSM dành cho PNSB 28

Bảng 6 Thành phần và chu trình phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA 30

Bảng 7 Thành phần và chu trình phản ứng PCR khuếch đại gen pufM 30

Bảng 8 Công thức tạo vật liệu phủ (vữa phủ) 37

Bảng 9 Công thức tạo beton 38

Bảng 10 Thành phần nước thải nhân tạo 38

Bảng 11 Các chủng PNSB phân lập từ mẫu làm giàu 41

Bảng 12 Kết quả so sánh trình tự gen 16S rRNA và pufM của hai chủng PN6, PN7 43

Bảng 13 Tốc độ oxy hóa sulfide của hai chủng PN6 và PN7 45

Bảng 14 Số lượng tế bào các chủng vi khuẩn PN6, PN7 bám trên vật liệu vermiculite sau quá trình cố định bằng phương pháp áp lực âm 51

Bảng 15 Số lượng tế bào các chủng PNSB sống sót trong môi trường vật liệu phủ 52

Bảng 16 Đánh giá mức độ ăn mòn trên khối beton C1 (đối chứng không chứa vi khuẩn trong lớp vữa phủ) sau 28 ngày tiếp xúc với hơi acid 54

Bảng 17 Số lượng tế bào trong các mẫu beton trước và sau khi ủ 28 ngày 55

Bảng 18 Thành phần các chất chính trong các mẫu beton sau 6 tháng ngâm trong nước thải nhân tạo 57

8

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Sơ đồ mô phỏng hoạt động của lớp vữa phủ sinh học 17

Hình 2 Sơ đồ các bước hình thành biofilm ở vi sinh vật 23

Hình 3 Cấu trúc cơ bản của tinh thể vermiculite 24

Hình 4 Bình cố định vi khuẩn PNSB vào vật liệu vermiculite dưới áp lực âm 36

Hình 5 Thí nghiệm đánh giá hiệu quả bảo vệ ăn mòn beton của lớp phủ vi sinh trong mô hình VSE mô phỏng điều kiện cống thải ở Việt Nam, A – Thí nghiệm beton tiếp xúc pha khí; B – Thí nghiệm beton tiếp xúc pha nước 40

Hình 6 Bình làm giàu (A) và ống phân lập vi khuẩn PNSB trong điều kiện quang dưỡng kỵ khí 41

Hình 7 Hình thái tế bào của hai chủng PN6 và PN7 được phân lập thuần khiết từ các mẫu làm giàu 42

Hình 8 Sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rRNA (A) và gen pufM (B) của hai chủng PN6, PN7 42

Hình 9 Cây phát sinh chủng loại neighbor − joining của chủng PN6 và PN7 dựa trên so sánh trình tự gen 16S rRNA và trình tự gen pufM 43

Hình 10 Hoạt tính oxy hóa sulfide của hai chủng PN6 và PN7 trong điều kiện quang dưỡng (kỵ khí) và hóa dưỡng (hiếu khí) 44

Hình 11 Sinh trưởng của hai chủng PN6 và PN7 trong điều kiện hóa dưỡng với nguồn sulfur là sulfide hoặc sulfate Sinh trưởng được đánh giá qua giá trị OD600 của dịch nuôi sau 72 giờ 45

Hình 12 Hình ảnh hiển vi của hai chủng PN6 (A) và PN7 (B) sau khi được nhuộm congo đỏ chỉ ra lớp EPS không bắt màu bao quanh tế bào PNSB 46

Hình 13 Hàm lượng EPS do hai chủng PN6 và PN7 sản sinh trong điều kiện sinh trưởng và các nguồn carbon khác nhau sau 3 ngày nuôi cấy 47

9

Hình 14 Khả năng tạo biofilm của hai chủng PN6 và PN7 ở các điều kiện sinh trưởng

và nguồn carbon khác nhau 48

Hình 15 Sinh trưởng của hai chủng PN6 và PN7 ở các điều kiện pH khác nhau 49Hình 16 Hình ảnh SEM chụp vật liệu vermiculite sau bước cố định tế bào chủng

PN6 (A) và PN7 (B) bằng phương pháp áp lực âm (độ phóng đại 5000×) 51

Hình 17 Sinh trưởng của các chủng PN6 và PN7 sau khi được cố định trên vật liệu

rỗng vermiculite A- Các bình nuôi; B- mức sinh trưởng ở các thời điểm đánh giá 52

Hình 18 Kết quả thí nghiệm đánh giá hiệu quả bảo vệ beton sau 28 ngày tiếp xúc với

pha khí của nước thải 54

Hình 19 Ảnh nhuộm tế bào thể hiện rõ các vùng EPS bao quanh tế bào PNSB được

hoạt hoá lại từ mẫu beton sau 28 ngày thí nghiệm 56

10

BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BLAST Basic local alignment search tool Công cụ tìm kiếm các trình tự

tương đồng

CI Chloroform - isoamyl alcohol

dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate

EPS Extracellular Polymeric Substances Hợp chất cao phân tử ngoại bào

PNSB Purple non-sulfur phototrophic

PSB Purple sulfur phototrophic bacteria Vi khuẩn tía lưu huỳnh PSM Phototrophic selective medium

rDNA Ribosomal Deoxyribonucleic acid Ribosome deoxyribonucleic

axit rRNA Ribosomall Ribonucleic acid Ribosome ribonucleic axit

Taq Thermus aquaticus polymerase

11

MỞ ĐẦU

Việt Nam đang phải đối mặt với tình trạng ô nhiễm môi trường ngày càng gia tăng, đặc biệt là ở các thành phố lớn tình trạng ô nhiễm môi trường ngày càng gia tăng, đặc biệt là ở các thành phố lớn Theo báo cáo thống kê của Ngân hàng Thế giới năm 2015 về quản lý nước thải ở Việt Nam, lượng nước thải sinh hoạt ở các đô thị khoảng 9,5 triệu m3 /ngày, trong khi chỉ có 45 nhà máy xử lý nước đô thị đang vận hành, mới đáp ứng được 12-13% yêu cầu Bên cạnh đó, tình trạng đấu nối xả nước thải không qua xử lý vào hệ thống thoát nước công cộng còn phổ biến ở nhiều khu dân cư cũ trong đô thị Do vậy trong thực tế nước thải trong các hệ thống cống thoát nước công cộng ở các đô thị lớn như Hà Nội và Tp Hồ Chí Minh có hàm lượng chất ô nhiễm carbon và nitơ cao hơn rất nhiều lần so với quy định Cũng trong báo cáo này, khoản đầu tư 8,3 tỷ USD được dự toán để cung cấp dịch vụ thoát nước cho khoảng 36 triệu dân đô thị ở Việt Nam vào năm 2025 Hệ thống cống thoát nước công cộng với chức năng thu gom và chuyển nước thải từ các nguồn sinh hoạt và công nghiệp đến các cơ sở xử lý tập trung là một phần không thể thiếu của hạ tầng đô thị, đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ môi trường và sức khoẻ cộng đồng Tại Việt Nam cũng như ở nhiều quốc gia khác trên thế giới, hệ thống này được xây dựng chủ yếu bằng beton cốt thép, và trong quá trình vận hành việc bảo dưỡng và sửa chữa do ăn mòn là một trong những thách thức lớn nhất Sự ăn mòn cống beton diễn ra hàng ngày trong thời gian dài gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng công trình, thậm chí có thể khiến công trình bị phá huỷ toàn toàn, trong khi công tác sửa chữa lại tốn kém và gặp nhiều khó khăn khi triển khai

Nguyên nhân gây ăn mòn beton của hệ thống cống thoát nước đô thị được xác định là do sự tác động trực tiếp của các chất ăn mòn hóa học như H2S và H2SO4 có mặt trong nước thải, sinh ra từ quá trình phân hủy sinh học và chuyển hóa các hợp chất lưu huỳnh Một giải pháp công nghệ mới giúp bảo vệ beton ống cống trước sự tấn công của các yếu tố ăn mòn này là chế tạo lớp phủ beton chứa các vi sinh vật có khả năng hấp thu các chất ăn mòn, đồng thời sinh EPS để ngăn các yếu tố gây ăn mòn

12

xâm nhập vào beton và “hàn gắn” các vết ăn mòn Là mắt xích quan trọng trong chu trình chuyển hóa sulfur và có đặc tính trao đổi chất rất linh hoạt, vi khuẩn tía quang hợp được xem là ứng viên tiềm năng cho ứng dụng để chế tạo lớp vật liệu phủ beton sinh học nói trên Giải pháp công nghệ này sẽ giúp tăng tuổi thọ công trình, đồng thời giảm tần xuất và chi phí cho việc bảo dưỡng và sửa chữa, có ý nghĩa thực tế cao

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn và tiềm năng của công nghệ, đề tài: “Nghiên

cứu ứng dụng vi khuẩn tía quang hợp trong tạo vật liệu phủ vi sinh bảo vệ beton cho hệ thống cống thu gom nước thải” được thực hiện nhằm tìm kiếm các chủng vi

khuẩn tía quang hợp bản địa của Việt Nam để chế tạo vật liệu phủ beton phù hợp với điều kiện cống thải đô thị ở Việt Nam

Mục tiêu của đề tài

- Phân lập và lựa chọn được các chủng vi khuẩn tía quang hợp có hoạt tính sinh học phù hợp để tạo vật liệu phủ vi sinh bảo vệ beton

- Chế tạo được vật liệu phủ chứa vi khuẩn tía quang hợp và bước đầu đánh giá hiệu quả bảo vệ beton của vật liệu phủ trong môi trường nước thải nhân tạo ở mô hình phòng thí nghiệm

Phạm vi nghiên cứu của đề tài: Tìm kiếm các chủng vi khuẩn tía quang hợp

bản địa của Việt Nam để chế tạo vật liệu phủ cống beton thu gom nước thải đô thị ở Việt Nam

13

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Ăn mòn cống beton dẫn nước thải và các biện pháp xử lý hiện tại 1.1.1 Ăn mòn trong hệ thống cống beton dẫn nước thải

Hệ thống cống thải trong các đô thị được làm chủ yếu bằng beton do khả năng chịu lực và độ bền cao của vật liệu này (Parande và cộng sự, 2006) Tuy nhiên, trong quá trình vận hành cống beton dẫn nước thải chịu tác động ăn mòn thường xuyên từ môi trường ẩm và hơi acid từ nước thải, dẫn đến những vấn đề lớn về tính toàn vẹn cấu trúc và an toàn của các công trình hạ tầng này cũng như gây thiệt hại không nhỏ về kinh tế (Jiang và cộng sự., 2015, 2016; Zhang và cộng sự, 2008) Trước tiên ăn mòn làm giảm khả năng chịu lực của cống beton, dẫn đến suy giảm hiệu suất và độ bền của cống, tăng nguy cơ vỡ ống và sụt lún, ảnh hưởng tới an toàn đô thị (Kuliczkowska, 2016) Ở mức độ nhẹ hơn, nhưng cũng thường gặp hơn, các vết nứt do ăn mòn trên bề mặt của cống beton làm tăng nguy cơ rò rỉ (ASTM, 2009) Ăn mòn không chỉ giới hạn ở từng vị trí cống mà có thể lan rộng nhanh chóng, và tạo ra những điểm yếu trong hệ thống, tăng nguy cơ sự cố và yêu cầu chi phí lớn để sửa chữa

Ở mỗi quốc gia, chi phí cho hoạt động bảo trì và phục hồi hệ thống cống dẫn nước thải ở mức độ khác nhau, tuy nhiên đều được xem là một gánh nặng tài chính Theo Hiệp hội kỹ sư xây dựng Hoa Kỳ (ASCE, 2019), chi phí cho việc phục hồi hệ thống cống trên cả nước Mỹ vượt mức 3 tỷ USD với khoảng 7560 km đường ống được thay thế Ở Đức, 40% đường ống ngầm trong hệ thống cống được đánh giá bị hư hỏng do ăn mòn sinh học, yêu cầu một khoản chi phí ước tính là 40 tỷ USD cho việc sửa chữa và bảo trì cần thiết (Noeiaghaei và cộng sự, 2017) Tình hình tương tự cũng được báo cáo ở Australia và New Zealand với chi phí sửa chữa cơ sở hạ tầng đường ống cống hàng năm lên tới 80 tỷ AUD và 16 tỷ NZD (Anwar và cộng sự, 2022) Tại Nhật Bản, tỷ lệ cống đang hoạt động bị vượt quá tuổi thọ ngày càng tăng, đòi hỏi các cơ quan chức năng phải có kế hoạch chi phí lớn cho công tác bảo dưỡng và cải tạo (Vo Huy Thanh và cộng sự, 2023)

Ở Việt Nam, hiện tượng cống hay các bể beton cốt thép bị xâm thực và ăn mòn do nước thải rất phổ biến Tuổi thọ của các công trình này phụ thuộc rất nhiều vào

14

việc xử lý ăn mòn kết cấu beton cốt thép khi thiết kế và khai thác công trình Một số kết cấu beton cốt thép đã bị hư hỏng dù mới đưa vào khai thác 2 – 4 năm Hiện nay, hệ thống cống ở các khu đô thị lớn bao gồm phần đã được xây dựng và phần đang được xây dựng mới với tổng chiều dài rất lớn, do đó việc duy tu, bảo trì hàng năm là một vấn đề phức tạp Ví dụ như thành phố Hà Nội có tổng chiều dài cống rãnh khoảng 5735 km, Tp Hồ Chí Minh có khoảng 4445 km cống, trong đó nhiều đoạn được lắp đặt từ thời Pháp, nhiều cống có tuổi thọ trên 50 năm không đáp ứng được quy mô phát triển đô thị và dân số hiện có, đã hư hỏng xuống cấp cần sớm được sửa chữa, bảo dưỡng (Bộ Xây dựng, 2020; Nguyễn Bảo Thanh và Phan Mộng Hoài, 2023)

1.1.2 Nguyên nhân gây ăn mòn cống beton

Sulfide là tác nhân ăn mòn phổ biến gây xuống cấp cống beton (Pikaar và cộng sự, 2014) Sulfide được sinh ra từ các quá trình (i) phân huỷ các hợp chất lưu huỳnh hữu cơ (như cystein, cystin, methionine, taurin) (pư 1) và khử sulfate trong điều kiện yếm khí (pư 2) (Sun và cộng sự, 2015) Nồng độ sulfide trong nước thải phụ thuộc vào các đặc điểm khí hậu, tính chất vật lý của hệ thống thoát nước và tính chất hoá học của nước thải, trong đó các yếu tố ảnh hưởng chính gồm nồng độ sulfate, Eh (thế oxy hoá khử), pH, nhiệt độ và BOD5 (Huijbregts và cộng sự, 2000) Sulfide là chất dễ bay hơi, khi có mặt trong nước thải sẽ dần dần khuếch tán vào pha khí và bám vào bề mặt cống Sulfide khi tiếp xúc với cốt thép trong beton gây ăn mòn, hình thành mackinawite và các hợp chất sulfide kim loại khác như pyrite, smythite, greigte, pyrhotite, troilite (Sun và Nesic, 2007)

Cystein Acid pyruvic

Trên bề mặt cống beton, sulfide được oxy hóa bởi vi khuẩn oxi hóa lưu huỳnh (SOB) tạo ra acid sulfuric (H2SO4) (pư 3), sau đó acid này phản ứng với calci hydroxide (Ca(OH)2) trong beton, tạo thành CaSO4 (pư 4) dễ tan trong nước, tạo ra các cấu trúc rỗng trong beton và làm suy giảm tính chất cơ học của nó Ngoài ra, CaSO4·2H2O còn phản ứng với aluminate (3CaO·Al2O3) có trong xi măng tạo ra

15

ettringite (Ca6Al2(SO4)3(OH)12·26H2O) (pư 5) có thể tích riêng cao hơn đáng kể so với các chất tham gia phản ứng và gây ra hiện tượng giãn nở, dẫn đến làm vỡ kết cấu beton

3CaO·Al2O3 + 3(CaSO4·2H2O) + 26H2O → Ca6Al2(SO4)3(OH)12·26H2O (5)

Như vậy trong quá trình vận hành, cống dẫn nước thải tiếp xúc thường xuyên trong thời gian dài với các tác nhân ăn mòn sulfide và acid sulfuric, hậu quả là beton bị ăn mòn ở nhiều cấp độ khác nhau, cần được kiểm tra và sửa chữa định kỳ để đảm bảo hoạt động ổn định và an toàn

1.1.3 Các biện pháp xử lý hiện tại

Để hạn chế ăn mòn cống beton, việc kiểm soát sulfide được quan tâm đặc biệt Các phương pháp hóa học và sinh học đã được phát triển nhằm hướng tới ngăn chặn sự hình thành sulfide và giảm lượng sulfide bay hơi từ nước thải vào pha khí trong cống

Bổ sung chất ức chế hoặc chất diệt khuẩn như xút, acid nitrous tự do (FNA) vào nước thải để vô hiệu hóa vi khuẩn khử sulfate là biện pháp giảm thiểu sự hình thành sulfide được áp dụng khá phổ biến (Gutierrez và cộng sự, 2014; Jiang và cộng sự, 2011) Việc hạn chế sự khuếch tán của sulfide vào pha khí có thể đạt được bằng một số phương pháp, gồm (i) đưa các chất oxy hóa (như oxy hay nitrate) để oxy hóa sulfide (USEPA, 1991; Gutierrez và cộng sự, 2008; Jiang và cộng sự, 2013), (ii) bổ sung muối kim loại (như muối sắt) để kết tủa sulfide (Gutierrez và cộng sự, 2010; Haaning Nielsen và cộng sự, 2005; Zhang và cộng sự, 2016), hoặc (iii) bổ sung kiềm (như natri hydroxide và magie hydroxide) để tăng pH và giữ sulfide trong pha nước (Gutierrez và cộng sự, 2009, 2014) Bên cạnh đó, biện pháp vật lý thông gió cống để giảm lượng H2S và độ ẩm trong không khí của cống cũng được áp dụng (Jiang và cộng sự, 2015) Cơ chế và mức độ tạo sulfide không thống nhất trong các hệ thống cống khác nhau Do vậy các phương án kiểm soát sulfide cần được lựa chọn cẩn thận

Hiện nay, beton sinh học (beton tự liền vết nứt)là một giải pháp đã được nghiên cứu và đưa vào sử dụng trong thực tế Các chủng vi khuẩn có khả năng sản xuất

enzyme urease như Bacillus cohnii, Bacillus Pasteurii, được đưa vào bên trong beton và sẽ được kích hoạt khi không khí và nước xâm nhập vào beton thông qua các vết nứt Sau đó, vi khuẩn bắt đầu tạo ra các hợp chất khoáng do quá trình kết tủa calcit từ đó giúp bịt kín vết nứt một cách tự nhiên (Khaliq và Ehsan, 2016; Van Tittelboom và cộng sự, 2010) Tuy nhiên, vai trò hàn gắn của vi sinh vật chỉ được thể hiện sau khi các vết nứt đã được hình thành và khả năng sửa chữa đối với các mảng nứt lớn là rất hạn chế

17

Gần đây, nhóm nghiên cứu của Yang và cs tại Đại học Kyonggi (Hàn Quốc) đã đề xuất một giải pháp công nghệ mới sử dụng lớp vật liệu phủ vi sinh để bảo vệ cống beton trước sự tấn công của các yếu tố ăn mòn và bảo vệ cấu trúc beton ngay từ ban đầu (Yang và cộng sự, 2018, 2021) Lớp phủ này chứa vi khuẩn quang dưỡng

Rhodobacter capsulatus có khả năng sinh EPS (glycocalyx), tạo lớp màng ngăn chặn

các yếu tố gây ăn mòn như H2SO4 xâm nhập vào beton (Hình 1) Bên cạnh hoạt động sản sinh EPS, vi khuẩn cần có khả năng thích ứng đặc biệt với các điều kiện khắc nghiệt như nhiệt độ cao, độ kiềm và cấu trúc dày đặc trong môi trường beton (Yang và cộng sự, 2018)

Hình 1 Sơ đồ mô phỏng hoạt động của lớp vữa phủ sinh học 1.2 Vi khuẩn tía không lưu huỳnh và ứng dụng trong tạo vật liệu phủ beton 1.2.1 Tính đa dạng và phân bố trong tự nhiên

Vi khuẩn tía không lưu huỳnh (PNSB) phân bố rộng trong tự nhiên, có mặt ở nhiều môi trường sinh thái và đóng vai trò quan trọng trong chu trình chuyển hóa carbon, nitơ và lưu huỳnh (Kondo và cộng sự, 2010) Chúng được tìm thấy ở các thủy vực khác nhau từ môi trường nước ngọt đến môi trường có nồng độ muối cao, suối nước nóng, ao hồ, nước thải, khu vực gần hồ, khu vực trầm tích, trong đất ẩm đủ ánh sáng ở những nơi nhiều chất hữu cơ, nước thải và đặc biệt ở các suối nước nóng nơi Hydro Sulfua hình thành, hay thậm chí ở các môi trường khắc nghiệt nóng, lạnh, acid, kiềm và cực trị (Madigan và Jung, 2009)

PNSB là các vi khuẩn gram âm với nhiều hình thái tế bào khác nhau (Bảng 1) Hiện nay có khoảng 21 chi của vi khuẩn tía không lưu huỳnh đã được phát hiện, nằm

18

trong hai lớp Alpha (α-) và Beta (β-) thuộc ngành Proteobacteria (Bảng 1)

Bảng 1 Các loài vi khuẩn tía quang hợp không lưu huỳnh

Các chi thuộc phân lớp α-proteobacteria (18 chi)

Rhodobaca Rca Hình cầu đến que ngắn

Rhodobacter Rba Hình que

Rhodovulum Rdv Hình que – cầu

Rhodopseudomonas Rps Hình que nảy chồi

Rhpdpblastus Rbl Hình que nảy chồi

Blastochloris Blc Hình que nảy chồi

Rhodomicrobium Rmi Hình que nảy chồi

Rhodoplanes Rpl Hình que

Rhodocista Rcs Hình xoắn

Rhodospirillum Rsp Hình xoắn

Phaeospirillum Phs Hình xoắn

Rhodopila Rpi Hình cầu

Rhodospira Rsa Hình xoắn

Rhodoferax Rfx Hình que, phẩy

Rubrivivax Rvi Hình que, hình que cong Ngày nay, với sự đa dạng của nhóm vi khuẩn tía quang hợp (VKTQH), bên

cạnh việc phân tích thông tin di truyền gen 16S rRNA, người ta còn sử dụng gen pufM

(có tính bảo thủ cao) để phân loại và đánh giá sự có mặt của VKTQH (Imhofff và

19

cộng sự, 2018)

Gen pufM thuộc operon puf (photosynthetic unit forming) được tìm thấy ở nhóm VKTQH không thải oxy thuộc phân lớp Alpha-, Beta- và

Gammaproteobacteria và họ Cloroflexaceae Hiện nay, 5 loại operon puf khác nhau

đã được phát hiện Trong tất cả VKTQH đều chứa pufLM mã hóa cho tiểu phần L và M của protein trong tâm phản ứng quang hợp Gen pufL và pufM có mặt trong tất cả các loại operon puf, chúng có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng quang dưỡng Hiện nay, hai gen pufL và pufM đang được quan tâm khi nghiên cứu nhóm VKTQH ở cấp độ phân tử Đặc biệt, gen pufM mã hóa cho tiểu phần M của protein

liên kết với sắc tố bacteriochlorophyll trong trung tâm phản ứng quang hợp đã được

nhiều nhóm tác giả sử dụng khi nghiên cứu VKTQH Gen pufM có tính bảo thủ cao, sản phẩm PCR gen pufM có kích thước khoảng 200 bp, dễ dàng phân tích trình tự và so sánh Ngoài việc dùng gen pufM để phân loại nhóm VKTQH, người ta còn sử dụng

gen này như một chỉ thị phân tử để phát hiện sự có mặt của nhóm vi khuẩn này trong các môi trường sinh thái khác nhau (Achenbach và cộng sự, 2001; Imhofff và cộng

sự, 2018)

1.2.2 Các đặc điểm sinh lý của PNSB liên quan đến ứng dụng tạo vật liệu phủ

PNSB chứa các sắc tố quang hợp – bacteriochlorophylls (a và b) và carotenoids, điều này đã tạo nên sự đa dạng về màu sắc của chúng (tía, đỏ tía, đỏ nâu, cam ) PNSB có khả năng phát triển khi chỉ có CO2 là nguồn carbon duy nhất Vì quá trình tổng hợp sắc tố diễn ra khi không có mặt của oxy nên PNSB có khả năng quang hợp kỵ khí và không sinh ra oxy như một sản phẩm phụ của quang hợp Bên cạnh đó, PNSB có khả năng trao đổi chất rất linh hoạt (Bảng 2), có thể phát triển trong môi trường tối, có khả năng hô hấp kỵ khí, lên men hoặc hiếu khí (Keppen và cộng sự, 2013)

Bảng 2 Đặc điểm sinh học của PNSB Đặc điểm Vi khuẩn tía không lưu huỳnh (PNSB)

Tính mẫn cảm với oxy Chịu được sự có mặt của oxy ở nồng độ thấp Tính mẫn cảm với sulfide Sinh trưởng tối ưu ở môi trường có hàm lượng sulfide ≤

20

2 mM Sinh trưởng quang tự

dưỡng

Sử dụng H2, sulfide ở nồng độ thấp làm chất cho điện tử cho phản ứng trong pha tối, không sinh oxy trong quá trình quang hợp Một số loài có thể dùng S2O32− hoặc Fe2+ là chất cho điện tử

Sinh trưởng quang dị dưỡng

Nguồn carbon được cung cấp từ các hợp chất: acid hữu cơ, amino acid, acid béo, rượu, cacbohydrat, các hợp chất C1

Sinh trưởng hóa tự dưỡng Sử dụng H2 hoặc S2O32- là chất cho điện tử Sinh trưởng hóa dị dưỡng Sinh trưởng trong điều kiện tối bằng hô hấp hiếu khí

hoặc lên men Khả năng cố định nitơ Một số loài có enzyme nitrogenase, cố định nitơ:

N2 + 8H → 2NH3 + H2)

Khả năng sử dụng sulfide: PNSB có khả năng sinh trưởng tự dưỡng sử dụng sulfide

làm chất cho điện tử trong quá trình tổng hợp ATP ở pha tối, sản phẩm chuyển hóa sulfide (S²⁻) là sulfur (So) Trong nước thải đô thị, sulfide thường ở mức 10 – 47 mg/L (Tomar và Abdullah, 1994), có thể tích tụ trong hệ thống cống thải tới nồng độ cao hơn, từ 230 – 280 mg/L (Sherief và Hassan, 2022) Các giải pháp kỹ thuật để kiểm soát hàm lượng sulfide trong nước thải thường rất tốn kém và có thể ảnh hưởng đến các quá trình sinh học khác (Tomar và Abdullah, 1994)

Sử dụng vi sinh vật để loại bỏ sulfide đã được chứng minh là có hiệu quả, trong đó các vi sinh vật thường được sử dụng là vi khuẩn tía quang hợp lưu huỳnh (PSB) và không lưu huỳnh (PNSB) PSB thường sinh trưởng ở môi trường có nồng độ sulfide cao hơn (tầng đáy các thủy vực) và cũng có tốc độ oxy hóa sulfide cao hơn (Madigan và Jung, 2009) Egger và cs (2020) đã báo cáo vi khuẩn PSB

Chromatiaceae và các vi khuẩn tía khác có thể đạt mức oxy hóa sulfide 42,96

mg/L/ngày hoặc cao hơn (Egger và cộng sự , 2020) Ngược lại, PNSB thường sinh trưởng ở môi trường có nồng độ sulfide thấp hơn (< 2 mM như tầng mặt các thủy vực) và sở hữu tốc độ oxy hóa sulfide thấp hơn nhiều (Imhoff, 2006, 2021) Tarabas

21

và cs (2017) báo cáo vi khuẩn Rhodopseudomonas yavorovii có tốc độ oxy hóa

sulfide chỉ ở mức 3,66 mg/L/ngày (Tarabas và cộng sự , 2017) Tuy nhiên khác với PSB là các loài kỵ khí hoàn toàn, PNSB có khả năng trao đổi chất linh hoạt, có thể thực hiện quang dưỡng kỵ khí/vi hiếu khí và hóa dưỡng hiếu khí nên có lợi thế trong môi trường có biến động lớn như môi trường cống thải (Madigan và Jung, 2009) Khi sinh trưởng dị dưỡng hiếu khí trong điều kiện không có ánh sáng PNSB chủ yếu sử dụng sulfate làm nguồn sulfur Một số loài sử dụng các hợp chất lưu huỳnh khác như sulfide, thiosulfate, cysteine làm nguồn sulfur nếu chúng không có khả năng đồng hóa sulfate (Imhoff, 2006) Khả năng sử dụng sulfide và sulfate của PNSB đã mở ra những tiềm năng quan trọng trong ứng dụng để loại bỏ các hợp chất này trong môi trường cống thải

Khả năng sinh EPS: EPS (Extracellular Polymeric Substances) là các hợp chất cao

phân tử ngoại bào được sinh tổng hợp bởi một số loài vi sinh vật Thuật ngữ EPS ngày nay được sử dụng phổ biến và thay thế cho thuật ngữ glycocalyx (Flemming, 2016) Thành phần hóa học của EPS từ vi sinh vật phụ thuộc vào môi trường sinh trưởng, tuy nhiên thường gồm các thành phần chủ yếu là polysaccharide, protein và DNA Polysaccharide ngoại bào là thành phần chiếm tỉ lệ cao nhất trong EPS, gồm 2 loại (i) homopolysaccharide (chỉ gồm một loại monosaccharide) và (ii) heteropolysaccharid (gồm các monosaccharide không đồng nhất) (Monsan và cộng sự, 2001)

EPS có vai trò như một lớp bảo vệ tế bào trước sự tấn công của các yếu tố ngoại sinh (hóa học và sinh học) Cũng như đối với nhiều loài vi sinh vật khác, khả năng sinh EPS của PNSB không chỉ được quyết định bởi yếu tố di truyền mà còn phụ thuộc rất lớn vào môi trường sinh trưởng, cụ thể là nguồn carbon và dinh dưỡng N, P (Flemming, 2016; Yang và cộng sự, 2018) Yang và cs (2018) đã báo cáo chủng

PNSB Rhodobacter capsulatus KS1 sản xuất EPS cao nhất trong môi trường có

nguồn carbon malic acid (0,54 g/L), cao gấp 2,57 lần so với trong môi trường có nguồn carbon fructose (0,21 g/L) và cao hơn trong môi trường có các nguồn carbon khác như glucose, lactic acid và succinate (Yang và cộng sự, 2018) Một chủng PNSB

khác là Rhodobacter blasticus KS2 sản sinh EPS cao hơn chủng Rhodobacter

22

capsulatus KS1, tốt nhất với nguồn carbon là malic acid, đạt 1,47 g/L (hàm lượng

glycocalyx được tính trên 1 lít dịch nuôi tế bào) (Yang và cộng sự, 2018)

Khả năng tạo biofilm: Biofilm (màng sinh học) là tập hợp các quần thể vi sinh vật

gắn kết với nhau trên một bề mặt rắn nhờ chất nền EPS Thành phần chính của biofilm gồm polysaccharide, DNA, protein, lipid và chất hoạt động bề mặt và nước Trong biofilm, tế bào chỉ chiếm dưới 10% trọng lượng khô trong khi EPS chiếm trên 90% Vì vậy hàm lượng EPS, sự gắn kết, điện tích, khả năng hấp phụ, tính đặc hiệu và tính chất từng thành phần trong EPS cũng như cấu trúc 3 chiều của chất nền quyết định đặc tính của biofilm Cấu trúc của biofilm cũng chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác như điều kiện thủy động, hoạt động sinh trưởng bên trong quần thể vi sinh vật (Flemming và Wingender, 2010) Biofilm là hình thức tồn tại phổ biến của vi sinh vật trong tự nhiên, tạo ra các vi môi trường thuận lợi cho quá trình sinh trưởng của vi sinh vật, giúp tránh khỏi các điều kiện bất lợi bên ngoài, tạo lợi thế cạnh tranh (Flemming và Wingender, 2010)

Sự hình thành biofilm là một quá trình phức tạp ở vi sinh vật, trong quá trình đó vi sinh vật chuyển từ dạng sống phù du sang dạng quần thể, gồm 3 giai đoạn chính: (i) kết dính (attachment), (ii) trưởng thành (maturation), và (iii) phân tách (detachment) (Hình 2) Trong cùng điều kiện môi trường, khả năng hình thành biofilm ở các loài vi khuẩn cũng rất khác nhau Khả năng chuyển động bằng roi đóng vai trò tối quan trọng đối với quá trình bám dính ban đầu cũng như sự hình thành khuẩn lạc (Sutherland, 2001) Trong khi đó, polysaccharide ngoại bào là yếu tố chính trong việc tạo khung cấu trúc của biofilm Ngoài ra, các phân tử tín hiệu (quorum sensing, QS) như N-acyl-homoserin lacton (AHLs), protein ngoại bào, khả năng di động theo nhóm cũng là các yếu tố có liên quan đến sự hình thành biofilm (Jefferson, 2004)

23

Hình 2 Sơ đồ các bước hình thành biofilm ở vi sinh vật

PNSB đã được chứng minh là có khả năng hình thành biofilm trên nhiều bề mặt khác nhau, chẳng hạn như thủy tinh, nhựa, cát và than hoạt tính dạng hạt Khả năng hình thành biofilm của PNSB phụ thuộc vào một số yếu tố như chủng vi khuẩn, loại và nồng độ chất nền, cường độ và bước sóng ánh sáng, mức oxy, độ pH, nhiệt độ và sự hiện diện của các vi sinh vật khác Biofilm PNSB có thể được ứng dụng trong loại bỏ chất hữu cơ, nito, phosphor và kim loại nặng khỏi nước thải (Cerruti và cộng sự , 2020) hay phân hủy hydrocarbon thơm naphthalene và pyrene (Nguyễn Thị Minh Nguyệt và cộng sự, 2020)

1.3 Vật liệu rỗng vermiculite

Vermiculite là tên của một nhóm khoáng chất phyllosilicat 2.1 (silicat tấm magie-nhôm-sắt ngậm nước) Khi được làm nóng nhanh đến giữa 870 và 1100°C, nước ở lớp xen giữa chuyển thành hơi nước và áp suất tạo ra trong cấu trúc phá vỡ lớp silicat bằng quá trình “exfoliation” (Obut và Girgin, 2002; Marcos và Rodriguez, 2010) Nhờ quá trình này, thể tích của vermiculite được tăng lên nhiều lần và trở thành vermiculite mở rộng Vermiculite mở rộng có trọng lượng nhẹ với đặc tính cách nhiệt Nó cũng rất xốp, không hòa tan trong nước và dung môi hữu cơ, không độc hại và có đặc tính hấp thụ tốt (Mysore và cộng sự, 2005) Nhờ các đặc tính vật lý này, vermiculite được ứng dụng rộng rãi (Muiambo và cộng sự, 2010)

24

1.3.1 Tính chất vật lý

Vermiculite thô được chia thành năm loại khác nhau (micrômet, siêu mịn, mịn, loại trung bình và loại lớn) theo kích thước hạt (Bảng 3) Có thể thấy vermiculite mở rộng có khối lượng riêng thấp hơn nhiều lần so với vermiculite thô Đây là đặc tính quan trọng của vermiculite mở rộng vì hầu hết các ứng dụng của chúng đều dựa trên đặc tính này

Bảng 3 Các loại vermiculite thô với các kích thước hạt và khối lượng riêng khác

nhau

Loại

Vermiculite thô Vermiculite mở rộng

Kích thước hạt (mm) riêng (kg/mKhối lượng 3) riêng (kg/mKhối lượng 3)

Diện tích bề mặt (m2/g)

25

Vermiculite có pH trung tính 7 – 7,5, độ dẫn điện thấp Thành phần hóa học của vermiculite gồm: SiO2 (20 – 25%), Al2O3 (5 – 10%), MgO (35 – 40%) và Fe2O3 (32 – 35%)

1.3.3 Ứng dụng của vermiculite

Vermiculite được dùng làm chất cải tạo đất, làm chất mang trong sản xuất phân bón, thuốc trừ sâu, diệt cỏ, chế tạo nguyên liệu có tính năng hấp phụ, phục vụ các ngành công nghiệp và bảo vệ môi trường Các ứng dụng trong xây dựng và cốt liệu nhẹ của vermiculite bao gồm làm bê tông nhẹ, vữa láng nền, ván xây dựng, tấm thạch cao chống cháy, và tấm chịu lửa Hỗn hợp xi măng gồm chất kết dính và vermiculite mở rộng chẳng hạn như thạch cao và vữa trát cũng được ứng dụng như các thành phần kết cấu thép trong xây dựng Bên cạnh đó, vermiculite được sử dụng như một vật liệu để cách nhiệt, chống cháy Các ứng dụng khác của vermiculite mở

rộng như hấp phụ kim loại nặng trong nước (Trần Lý Tưởng, 2016)

Các nước có sản lượng khai thác vermiculite hàng đầu thế giới là Ai Cập, Ấn Độ, Australia, Brazil, Mỹ, Liên Bang Nga, Nam Phi, Trung Quốc, Zimbabwe Theo thống kê của Cục Điều tra Địa chất Mỹ (2007), sản lượng khai thác vermiculit của các nước năm 2004 khoảng 510 nghìn tấn, năm 2005 khoảng 516 nghìn tấn và năm 2006 khoảng 513 nghìn tấn (Kogel và cộng sự, 2006) Trên lãnh thổ Việt Nam bước đầu đã phát hiện được một số khu vực có vermiculite như: Phố Ràng-Bảo Hà, và Sơn Thủy-Tân Thượng (Lào Cai); Hòa Cuông Minh Quán và Đèo Mậu A (Yên Bái); Vinh Tiền-Đông Cửu (Phú Thọ); Mang Gôi-Nước Oai-Xã Canh (Bình Định); Đèo Viholak-Bờ Leng và Mang Lùng-Nước Như (Quảng Ngãi) (Trần Lý Tưởng, 2016) Kết quả nghiên cứu bước đầu đã chứng minh vermiculite Việt Nam có tính khả tuyển và có chất lượng đáp ứng yêu cầu làm nguyên liệu phục vụ sản xuất trong các lĩnh vực nông nghiệp, công nghiệp và xử lý bảo vệ môi trường

26

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nguyên vật liệu

2.1.1 Mẫu nước và vật liệu rỗng

- Các mẫu nước được dùng để làm giàu và phân lập PNSB được thu tại 2 địa điểm: nước hồ Mỗ Lao (Hà Nội), nước thuỷ canh thu tại Sóc Sơn (Hà Nội)

- Vật liệu rỗng: Vermiculite được sản xuất ở Việt Nam với các thông số kỹ thuật chi tiết tại bảng 4

Bảng 4 Thông số kỹ thuật của Vermiculite Việt Nam Thông số kỹ thuật Đơn vị Giá trị

- Các hoá chất và một số kit dùng cho sinh học phân tử được cung cấp bởi các hãng Bioneer (Hàn Quốc), Fermentas (Đức), Qiagen (Mỹ), ABI (Mỹ)

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ

Nghiên cứu được thực hiện tại phòng Sinh thái Vi sinh vật Ứng dụng, Viện vi sinh vật và Công nghệ Sinh học – Đại học quốc gia Hà Nội, sử dụng các thiết bị chuyên môn dùng trong vi sinh vật học, sinh học phân tử và hoá phân tích đạt tiêu chuẩn quốc tế

- Bể ổn nhiệt (Jeio Tech, Hàn Quốc)

- Máy đo pH (Hanna, Mỹ)

- Máy ly tâm lạnh (Eppendorf, Đức)

27

- Máy PCR (Eppendorf, Đức)

- Thiết bị điện di ngang (Nyx Technik, Mỹ)

- Máy GelDoc (BioRad, Mỹ)

- Kính hiển vi phản pha và huỳnh quang (Zeiss, Đức)

- Nồi khử trùng Hyrayama HV 110 (Nhật Bản)

- Tủ an toàn sinh học cấp II (Esco Labculture kiểu A2, Anh)

- Tủ ấm lắc MaxQ 4000 (Thermo Scientific, Mỹ)

- Tủ hood (ESCO, Anh)

- Bơm hút chân không cầm tay (Thermo, Mỹ)

- Máy quang phổ Biospectrometer Basic (Eppendorf, Đức)

- Các thiết bị nhỏ, dụng cụ cần thiết khác được sử dụng trong nghiên cứu gồm bình khí N2, CO2, ống nghiệm nút xoáy, bình serum, nút cao su, bình duran, pipet tự động…

2.2 Sơ đồ các bước nghiên cứu

Mẫu làm giàu ở lần cấy truyền thứ ba được dùng để phân lập PNSB Việc phân lập PNSB được tiến hành theo phương pháp pha loãng trên dãy ống môi trường PSM thạch bán rắn (1%), các ống được sục khí N2 và nuôi ở tư thế úp ngược tại 28C dưới điều kiện chiếu sáng liên tục 1000 lux Sau 4 – 5 ngày, các khuẩn lạc đơn phát triển trong các ống phân lập được tách bằng pipet Pasteur và chuyển sang môi trường PSM dịch thể kỵ khí

Bảng 5 Môi trường khoáng PSM dành cho PNSB

29

2.3.2 Phân loại PNSB

2.3.2.1 Tách DNA tổng số của các chủng vi khuẩn thuần khiết

DNA tổng số của các chủng thuần khiết được tách chiết theo phương pháp của Zhou và cộng sự, 1996 có cải tiến, gồm các bước như sau:

- Hút 1,5 mL dịch nuôi cấy vào ống eppendorf, ly tâm 10000 vòng/phút ở 20C trong 5 phút, thu sinh khối tế bào

- Bổ sung thêm 0,54 mL đệm tách DNA (Lysis buffer) - Bổ sung 4 µl proteinase K (10 mg/mL), lắc ngang với tốc độ 225 vòng/phút ở

37C trong 30 phút - Bổ sung 60 µl SDS 20%, ủ ở 65C trong 2 giờ, 25 phút đảo nhẹ 1 lần - Bổ sung 550 µl Chloroform: isoamyl alcohol (24:1) và trộn đều - Ly tâm 5000 vòng/phút ở 20C trong 10 phút, thu dịch ở pha trên sang ống

eppendorf mới - Bổ sung 0,6 lần thể tích isopropanol, ủ ở nhiệt độ phòng 1h, để tĩnh - Ly tâm 14000 vòng/phút trong 15 phút, loại bỏ phần dịch ở trên - Rửa tủa bằng ethanol 80% (lạnh), ly tâm 14000 vòng/phút trong 15 phút Đổ

ethanol và để khô ở nhiệt độ phòng - Bổ sung 30 µl nước MQ đã khử trùng để hòa tan DNA và giữ ở -20C

Sản phẩm DNA được kiểm tra gel agarose 1,5% được bổ sung thuốc nhuộm redsafe (tỉ lệ 5µl/100 mL) trong đệm TAE tại 100 V trong thời gian 15 phút Sau khi điện di, gel agarose được quan sát và chụp ảnh dưới ánh sáng UV bằng máy GelDoc BioRad

2.3.2.2 Giải trình tự các gen 16S rRNA và gen pufM và dựng cây phân loại

Gen 16S rRNA (~1500 bp) của các chủng PNSB được khuếch đại trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) và 1492R (5’-GGTTACCTTGGTTACGACT-3’) (Weisburg và cộng sự, 1991) Thành phần và chu trình phản ứng được trình bày tại bảng 6

30

Bảng 6 Thành phần và chu trình phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Nhiệt độ (C) Thời gian Số chu kỳ

H2O PCR Buffer 10× BSA (3mg/mL) dNTP (2,5mM) 27F (10 pmol/µl) 1492R (10 pmol/µl) Taq polymerase (5u/µl) DNA khuôn

10,88 2,5 2,5 2,5 2 2 0,12

3

94 55 72

30 giây 45 giây 1 phút 30 giây

35 chu kỳ

Tổng thể tích phản ứng 25

Gen pufM (229 bp) của các chủng PNSB được khuếch đại trong phản ứng PCR

sử dụng cặp mồi: pufM 557F (5’–CGCACCTGGACTGGAC–3‘) và pufM 750R (5’–CCCATGGTCCAGCGCCAGAA–3’) (Achenbach và cộng sự, 2001) Thành phần và chu trình phản ứng được trình bày tại bảng7

Bảng 7 Thành phần và chu trình phản ứng PCR khuếch đại gen pufM

Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Nhiệt độ (C) Thời gian Số chu kỳ

H2O PCR Buffer 10X BSA (3mg/mL) dNTP (2,5mM) pufM 557F (10 pmol/µl) pufM 750R (10 pmol/µl) Taq polymerase (5u/µl) DNA khuôn

10,88 2,5 2,5 2,5 2 2 0,12

3

94 55 72

1 phút 1 phút 1 phút

30 chu kỳ

72 10 phút

Tổng thể tích phản ứng 25

Sản phẩm PCR của gen 16S rRNA và gen pufM sau đó được kiểm tra bằng điện

di trên gel agarose 1,5% (w/v) Trước khi giải trình tự, các sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR (Qiagen) và việc giải trình tự được thực

31

hiện trên hệ thống ABI 3110 Avant Application Biosystems (Hoa Kỳ)

Các trình tự gen 16S rRNA và pufM sau đó được so sánh với các trình tự liên

quan đã được công bố trên cơ sở dữ liệu GenBank sử dụng công cụ BLAST So sánh các trình tự được thực hiện bằng công cụ CLUSTAL_X, phiên bản 1.8, và cây phát sinh chủng loại được xây dựng theo phương pháp neighbor – joining sử dụng công cụ NJ Plot (Saitou và Nei, 1987) Định dạng của cây phân loại được đánh giá bằng phân tích bootstrap với 1000 lần lặp lại (Felsenstein, 1985)

2.3.2.3 Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn

- Lấy 1 mL dịch nuôi cấy tế bào, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút - Hòa sinh khối với 0,1 mL nước muối sinh lý (hoặc môi trường khoáng) - Nhỏ 20 – 35 l dịch tế bào lên lam kính phủ thạch (1%), đậy lamen (18  18

mm), đợi 1 – 2 phút Tế bào cần được giữ ổn định trong thạch, không chuyển động, tuy nhiên không bị ép do lamen kính áp sát với lớp thạch

- Chụp ảnh tế bào dưới kính hiển vi phản pha với độ phóng đại 1000×

2.3.3 Đánh giá các hoạt tính sinh học

2.3.3.1 Đánh giá khả năng sử dụng sulfide

- Khả năng oxy hóa sulfide trong sinh trưởng quang dưỡng: PNSB được nuôi cấy trong bình serum chứa 50 mL môi trường PSM kỵ khí có bổ sung 2 mM sulfide thay thế cho succinate (2 bình thí nghiệm/chủng), nuôi tĩnh ở 28-30oC, chiếu sáng 1000 lux trong 3 ngày

- Khả năng sử dụng sulfide làm nguồn sulfur trong sinh trưởng hóa dưỡng: PNSB được nuôi cấy trong bình tam giác chứa 50 mL môi trường PSM (không đuổi oxy), có bổ sung 2 mM sulfide thay thế cho sulfate (2 bình thí nghiệm/chủng), nuôi tĩnh ở điều kiện tối 28-30oC, lắc 120 vòng/phút trong 3 ngày

- Trong các thí nghiệm đối chứng (ĐC) âm là bình môi trường không bổ sung vi sinh vật và đối chứng dương là môi trường và điều kiện nuôi cấy chuẩn, cụ thể: quang dưỡng là môi trường PSM kỵ khí với succinate là nguồn điện tử; hóa dưỡng là môi trường PSM không đuổi oxy với sulfate là nguồn sulfur

Nồng độ sulfide trong môi trường được xác định ở thời điểm bắt đầu và kết thúc

Tốc độ sử dụng sulfide của vi khuẩn được tính toán theo công thức:

Trong đó: V: Tốc độ sử dụng sulfide (mg/L/ngày)

Cvào: Hàm lượng sulfide đầu vào (mg/L) Cra: Hàm lượng sulfide đầu ra (mg/L) n: Số ngày nuôi cấy

2.3.3.2 Đánh giá khả năng sinh EPS

Hoạt tính sinh EPS của PNSB được đánh giá ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau Môi trường nuôi cấy là PSM với các nguồn cacbon khác nhau gồm có: succinate, fructose, glucose, acetate, lactate, malic acid (với tỉ lệ C/N = 2:1) Đối chứng âm là các ống môi trường không có vi khuẩn Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần

Ba điều kiện nuôi cấy được áp dụng, gồm: - Kỵ khí quang dưỡng: cấy vi khuẩn trong các ống nghiệm nút xoáy và đuổi oxy

trong các ống nuôi bằng sục khí hỗn hợp N2:CO2 (90:10) trong 30 giây, nuôi tĩnh ở nhiệt độ 28 - 30oC, chiếu sáng (1000 lux) trong 7 ngày

- Vi hiếu khí quang dưỡng: cấy vi khuẩn trong các ống nghiệm nút xoáy nhưng không thực hiện bước đuổi oxy, nuôi tĩnh ở nhiệt độ 28 - 30oC, chiếu sáng (1000

lux) trong 7 ngày

- Hiếu khí hóa dưỡng: cấy vi khuẩn trong các bình tam giác, nuôi lắc 150 vòng/phút, trong tối, nhiệt độ 28 - 30oC, trong 7 ngày

Khả năng sinh EPS của PNSB được đánh giá ở mức định tính và định lượng - Đánh giá định tính thông qua nhộm Congo đỏ và quan sát dưới kính hiển vi, các

33

bước thực hiện như sau: + Nuôi chủng vi khuẩn trong môi trường PSM dịch thể trong 7 ngày + Nhỏ 1 giọt dung dịch Congo đỏ 0,5% lên lam kính (cách pha dung dịch:

0,5 g Congo đỏ hòa tan trong 50 mL nước cất vô trùng, thêm 50 mL ethanol 100%, lọc qua giấy lọc), sau đó nhỏ 1 giọt dịch huyền phù tế bào chủng vi khuẩn

+ Sử dụng lamen kéo hỗn hợp dịch vi khuẩn-thuốc nhuộm Congo đỏ thành vệt mỏng trên lam kính, để khô tự nhiên trong 5-7 phút

+ Nhỏ thuốc nhuộm tím kết tinh 1% lên vết mẫu trên lam kính, ủ trong 1 phút rồi rửa bằng nước cất và để khô tự nhiên

+ Quan sát tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi phản pha, độ phóng đại 1000× - Đánh giá định lượng thông qua tách chiết và xác định hàm lượng EPS trong dịch

nuôi vi khuẩn, các bước tiến hành như sau (APHA, 1999): + Hút 10 mL dịch nuôi vi khuẩn vào các ống Falcon 15 mL, ly tâm 4000

vòng/phút trong 20 phút để loại tế bào và thu dịch nổi + Bổ sung ethanol lạnh (đã để qua đêm ở -20oC) theo tỷ lệ etanol:dịch nuôi

= 2,2:1 (v/v), đảo nhẹ nhàng và giữ ở -20oC trong 1 h + Ly tâm 4000 vòng/phút trong 20 phút, ở 4oC sử dụng ống Falcon 50 mL và

thu cặn + Sấy mẫu tại 60oC đến khi khối lượng không đổi và cân trọng lượng ống

sau khi sấy + Lượng EPS sinh ra trong 1 lít môi trường được tính theo công thức:

Trong đó: m: lượng EPS có trong 1 L dịch nuôi (g/L)

W1: khối lượng của ống Falcon tủa EPS sau sấy (g) W0: khối lượng ống Falcon trước khi sử dụng (g) V: thể tích dịch nuôi sử dụng (L)

2.3.3.3 Đánh giá khả năng tạo Biofilm

Các chủng PNSB được nuôi trong môi trường PSM dịch thể trong 3-5 ngày, ly

34

tâm dịch nuôi ở 4000 vòng/phút, 4oC trong 10 phút, thu tế bào sau đó rửa lại với môi trường PSM không có cơ chất 3 lần Hoà sinh khối trong 400 µl môi trường PSM không cơ chất, đưa về OD600 = 0,3

- Thí nghiệm đánh giá khả năng tạo biofilm ở điều kiện quang dưỡng (kỵ khí): Bổ sung 144 µl dịch tế bào có OD600 = 0,3 vào các ống eppendorf 1,5 mL chứa 1,3 mL môi trường PSM có nguồn carbon phù hợp để sinh EPS tốt (5 ống/chủng) Đối chứng âm là ống eppendorf chỉ chứa môi trường, không bổ sung vi khuẩn Đặt các ống ở điều kiện chiếu sáng, 28-30oC trong 7 ngày

- Thí nghiệm đánh giá khả năng tạo biofilm ở điều kiện hóa dưỡng (hiếu khí): Bổ sung 20 µl dịch tế bào có OD600 = 0,3 vào các giếng ở đĩa 96 giếng chứa 180 µl môi trường PNSB có nguồn carbon phù hợp để sinh EPS tốt (10 giếng/chủng) Đối chứng âm là giếng chỉ chứa môi trường nuôi cấy không bổ sung vi sinh vật Đặt đĩa nuôi vi khuẩn ở điều kiện tối, 28-30oC trong thời gian 7 ngày

Khả năng tạo biofilm trên thành ống Eppendorf/giếng được đánh giá bằng phương pháp nhuộm tím kết tinh (Merritt và cộng sự, 2011) ở các thời điểm nuôi cấy 3 và 7 ngày, các bước tiến hành như sau:

- Loại dịch nuôi trong các ống Eppendorf và các giếng nuôi vi khuẩn - Rửa ống Eppendorf/giếng cẩn thận bằng nước MQ để loại các tế bào không bám

dính - Nhỏ dung dịch tím kết tinh 0,1% đầy ống Eppendorf/giếng, ủ 15 phút - Đổ dung dịch nhuộm và rửa lại ống Eppendorf /giếng với nước cất nhiều lần để

loại tím kết tinh bám không đặc hiệu - Thôi mẫu bằng 200 l (đối với đĩa 96 giếng) hoặc 1,5 ml (đối với ống eppendorf)

dung dịch acetic acid 30%, pha loãng tới hạn và đo OD595 để xác định chỉ số biofilm

2.3.3.4 Đánh giá khả năng sinh trưởng trong điều kiện kiềm

- Điều kiện quang dưỡng: PNSB được cấy vào các ống môi trường PSM kỵ khí có độ pH từ 7 – 11 (chỉnh bằng NaOH 1 M), tỷ lệ giống 10% Các ống được nuôi ở nhiệt độ 28oC trong 7 ngày dưới điều kiện chiếu sáng 1000 lux

35

- Điều kiện hoá dưỡng: PNSB được cấy vào các ống môi trường PSM không được loại oxy, có độ pH từ 7 – 11 (chỉnh bằng NaOH 1M), tỷ lệ giống 10% Các ống được nuôi ở điều kiện tối, nhiệt độ 28oC, lắc 120 vòng/phút trong 7 ngày

- Sinh trưởng của vi khuẩn ở các độ pH khác nhau được đánh giá bằng cách xác định độ đục của dịch nuôi ở bước sóng 600 nm (OD600) sau mỗi 24 giờ

2.3.4 Cố định vi khuẩn trong vật liệu rỗng dưới áp suất âm

Các tế bào vi khuẩn được cố định trên vermiculite bằng phương pháp tạo áp suất âm theo mô tả của Yang và cs (2021) với một số sửa đổi:

- Rửa vermiculite bằng nước cất ba lần và sấy khô ở 105oC đến khối lượng không đổi Cân lượng vermiculite cần cho thí nghiệm và khử trùng ướt ở 121oC trong 20 phút

- PNSB được nuôi cấy trước trong môi trường PSM dịch thể ở điều kiện quang dưỡng Dịch nuôi tế bào sau đó được điều chỉnh bằng PSM vô trùng tới mật độ tế bào là 5×109 MPN/mL

- Trộn dịch nuôi vi khuẩn với vermiculite đã khử trùng theo tỷ lệ 6:1 (mL/g) trong bình Duran Đậy kín bình bằng nút cao su có gắn van thoát khí (Hình 4)

- Hút không khí trong bình bằng bơm chân không cầm tay (Thermo Fisher, Mỹ) tới áp suất − 0,03 MPa Bình được để yên trong 3 giờ để cố định tế bào

- Sau khi kết thúc, chắt bỏ dịch nuôi và rửa lại vật liệu vermiculite bằng môi trường PSM vô trùng (không chứa nguồn carbon) ba lần để loại bỏ các tế bào tự do - Mật độ vi khuẩn đã cố định trong vật liệu rỗng được xác định bằng phương pháp

MPN, các bước tiến hành như sau: + Lấy 1 g vật liệu đã cố định vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 9 mL dung dịch

NaCl 0,9% kỵ khí vô trùng + Xử lý mẫu bằng siêu âm với cường độ dòng điện 0,44 A và tần số 22 kHz:

xử lý 2 lần, mỗi lần 17 giây; sau đó sử dụng máy vortex trộn đều trong 10 phút để giải phóng các tế bào vi khuẩn bám trên vật liệu (Nogina và cộng