3.3. Kết quả định danh và phân tích đặc điểm sinh học của các chủng được chọn
3.3.3. Kết quả phân tích gen đặc trưng (house-keeping genes)
Việc định danh vi khuẩn vốn chủ yếu dựa trên trình tự gen 16S rRNA, nhưng hiện nay do tính trùng lặp cao của trình tự này, việc phân loại thường bị giới hạn ở
cấp độ chi. Do đó, việc kết hợp phân tích gen đặc trưng có thể được sử dụng để xác định chính xác vi khuẩn ở cấp độ loài [89]. Kết quả phân tích gen đặc trưng của vi khuẩn được thể hiện ở Bảng 3.2, Hình 3.6. Trong đó, gen hisKA được sử dụng để
định danh loài với chủng TN030, gen rpoD với các chủng PAM64, PAM67, T006, T087 và gen gyrB với chủng Y042, Y050.
Bảng 3.2. Tỷ lệ tương đồng gen đặc trưng của bộ chủng được chọn với cơ sở dữ liệu NCBI.
Các chủng có trình tự tương ứng trong cơ sở dữ liệu NCBI
Độ tương đồng với trình tự gene đặc trưng (%)
rpoD gene - PAM64
Pseudomonas lalkuanensis PE08 100
Pseudomonas resinovorans LMG 2274T 90,17
Pseudomonas otitidis DSM 17224T 87,44
rpoD - PAM67 Pseudomonas anuradhapurensis RD8MR3 100
Pseudomonas asiatica RYU5 93,52
56
Pseudomonas monteilii DSM 14164T 92,13
rpoD - T006 Pseudomonas nitritireducens LMG 25966T 93,99
Pseudomonas nitroreducens ATCC 33634T 93,99
Pseudomonas delhiensis RLD-1T 83,79
rpoD - T087
Pseudomonas asiatica RYU5 95,74
Pseudomonas anuradhapurensis RD8MR3 94,93
Pseudomonas monteilii DSM 14164T 93,59
hisKA - TN030 Cupriavidus metallidurans FDAARGOS_675 100
Cupriavidus metallidurans CH34 100
Cupriavidus metallidurans Ni-2 99,56
Cupriavidus metallidurans ZM02 99,12
Cupriavidus metallidurans BS1 97,36
gyrB - Y042 Stenotrophomonas maltophilia NCTC10257 93,01
Stenotrophomonas maltophilia ICMP 17033 93,01
Stenotrophomonas maltophilia DSM 50170 92,82
Stenotrophomonas maltophilia CCUG 5866 92,82
Stenotrophomonas nitritireducens CCUG 46888 86,13
gyrB - Y050 Stenotrophomonas maltophilia NCTC10257 92,88
Stenotrophomonas maltophilia ICMP 17033 92,88
Stenotrophomonas maltophilia DSM 50170 92,66
Stenotrophomonas maltophilia CCUG 5866 92,56
Stenotrophomonas lactitubi strain M15 85,01
rpoD - Y077 Pseudomonas nitroreducens ATCC 33634T 100
Pseudomonas nitritireducens LMG 25966T 99,68
Pseudomonas jinjuensis LMG 21316T 85,40
57 Gen hisKA mã hóa cho enzyme histidine kinase là một gen đặc trưng của Cupriavidus metallicidurans. Theo Ryan và cộng sự (2011), gen hisKA chỉ được phát
hiện ở C. metallicidurans và thậm chí không được phát hiện trong số 148 chủng có liên quan chặt chẽ thuộc Cupriavidus campinensis, Cupriavidus eutrophus, Cupriavidus respiraculi, Ralstonia insidiosa, Ralstonia pickettii, Ralstonia solanacearum và một số chủng các chủng Gram dương và Gram âm không liên quan
khác [75]. Vì vậy, đây là công cụ giúp phân loại chính xác C. metallicidurans với các loài khác. Do đó TN030 được xác định chính xác là thuộc loài này (Hình 3.6a).
a
b
58
Hình 3.6. Cây phát sinh loài được tạo dựa trên phân tích trình tự tương đồng của gene đặc trưng: (a) gen hisKA ở TN030 và các loài thuộc chi Cupriavidus
(Apiotrichum porosum được sử dụng làm nhóm ngoài (out-group)); (b) gen rpoD ở PAM64, PAM67, T006, T087, Y077 và các loài thuộc chi Pseudomonas (E. coli được
sử dụng làm nhóm ngoài); (c) gen gyrB ở các loài Y042, Y050 và các loài thuộc chi
Stenotrophomonas (E. coli được sử dụng làm nhóm ngoài).
Các loài thuộc chi Pseudomonas được phân loại dựa trên trình tự gen rpoD
với giá trị ngưỡng giới hạn (cut-off value) tương đồng trình tự 98% để phân biệt các
chủng ở cấp độ loài [42]. So với phân tích trình tự 16S rRNA, việc sử dụng rpoD cho phép phân loại chính xác các chủng thuộc loài cụ thể của chi Pseudomonas. Hơn nữa, nó đã được chứng minh là có hiệu quả như một công cụ để phân loại các loài
Pseudomonas mới công bố [42]. Trình tự rpoD của các chủng PAM64, PAM67,
Y077 tương đồng 100% với lần lượt trình tự rpoD của các loài Pseudomonas lalkuanensis, Pseudomonas anuradhapurensis, Pseudomonas nitroreducens. Các kết
quả này cũng phù hợp với kết quả phân tích trình tự gen 16S rRNA cho thấy các
c
59 chủng PAM64, PAM67, Y077 được xác định chính xác là thuộc các loài P.
lalkuanensis, P. anuradhapurensis, P. nitroreducens. Trình tự rpoD của T006 có độ
tương đồng cao nhất với trình tự Pseudomonas nitritireducens là 93,99%. Ngoài ra, trình tự rpoD của T087 có độ tương đồng cao nhất với trình tự của Pseudomonas asiatica là 95,74%. Những giá trị đó không đạt đến ngưỡng giới hạn 98% và do đó,
hai chủng Pseudomonas sp. T006 và Pseudomonas sp. T087 được nghi ngờ là loài mới và sẽ cần nhiều nghiên cứu sâu hơn (Hình 3.6b).
Gen gyrB là một trong những gen đặc trưng thường được sử dụng để phân biệt các loài chi Stenotrophomonas với giá trị ngưỡng giới hạn khoảng 93% [89]. Trình tự gyrB của hai chủng Y042, Y050 tương đồng khoảng 93% so với Stenotrophomonas
maltophilia. Kết quả này cũng tương tự với kết quả trên gene 16S rRNA. Do đó, hai
chủng này được xác định chính xác là thuộc về S. maltophilia (Hình 3.6c).
Đối với xạ khuẩn, cơ sở dữ liệu về trình tự đặc trưng chưa được cập nhật nhiều trên NCBI. Vì vậy, trong nghiên cứu này, xạ khuẩn được định danh chủ yếu dựa vào phân tích trình tự gene 16S rRNA và phân tích các đặc điểm sinh hóa. Các kết quả phân tích này sẽ được trình bày trong thí nghiệm tiếp theo.