CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học và định danh các chủng vi sinh vật nghiên cứu
2.2.3.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái
Hình thái khuẩn lạc được quan sát bằng ria 3 pha trên đĩa thạch LB (vi khuẩn) hoặc YS (xạ khuẩn). Hình thái tế bào vi khuẩn được quan sát bằng kỹ thuật nhuộm Gram. Hình thái chuỗi bào tử của xạ khuẩn được xác định bằng cách nuôi cấy xạ khuẩn trên một giọt thạch 15% trên lam kính trong 5 ngày và quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 100×.
2.2.3.2. Định danh vi khuẩn bằng phân tích gen 16S rRNA và gen đặc trưng (house-keeping genes)
Các mẫu DNA sử dụng cho PCR được tách bằng các bộ kit test DNA chuyên dụng, trong đó: DNA của xạ khuẩn được tách bằng kit DNeasy® PowerSoil Pro, DNA của vi khuẩn được tách bằng kit DNeasy® Blood & Tissue. Quy trình tách DNA được thực hiện như trong hướng dẫn đi kèm của mỗi loại kit tách DNA của nhà sản xuất.
Thành phần phản ứng PCR như sau:
Gen 16S rRNA: Taq PCR master mix - 12,5, cặp mồi P27F 5′-
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ - 1, P1492R 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT- 3′ - 1, DNA - 1,5, nước PCR - 9. Chu trình nhiệt: 96˚C - 3 phút, 35 chu kỳ (95˚C - 45 giây, 55˚C - 45 giây, 68˚C - 2 phút), 68˚C - 7 phút.
Gen rpoD định danh Pseudomonas theo công bố của Girard và cộng sự năm 2020 [42]: Taq PCR master mix - 12,5, cặp mồi PPSEG30F 5’- ATYGAAATCGCCAARCG-3’ - 1, PPSEG790R 5’-CGGTTGATKTCCTTGA-3’ - 1, DNA - 1,5, nước PCR - 9. Chu trình nhiệt: 95˚C - 3 phút, 35 chu kỳ (95˚C -15 giây, 50˚C -30 giây, 68˚C -1 phút 30 giây), 68˚C - 2 phút.
36 Gen gyrB định danh Stenotrophomonas theo công bố của Svensson-Stadler và cộng sự năm 2012 [89]: Taq PCR master mix - 12,5, cặp mồi PXGYRB1F 5’- ACGAGTACAACCCGGACAA-3’ - 1, PXGYRB1R 5’-CCCATCARGGTGCT
GAAGAT-3’ - 1, DNA - 1,5, nước PCR - 9. Chu trình nhiệt: 95˚C - 2 phút, 35 chu kỳ (95˚C -30 giây, 55˚C -1 phút, 72˚C -2 phút), 72˚C - 10 phút.
Gen hisKA định danh Cupriavidus theo công bố của Ryan và cộng sự năm 2011 [75]: Taq PCR master mix - 12,5, cặp mồi Cm-F1 5’-
AGTTTCCTGGCCATGATGAG -3’, Cm-R1 5’-TCCGTTTCCTGTACCACCTC - 3’, DNA – 1,5, nước PCR – 9. Chu trình nhiệt: 95˚C - 5 phút, 35 chu kỳ (95˚C - 30 giây, 59˚C - 1 phút, 72˚C - 1 phút), 72˚C - 9 phút.
Việc giải trình tự gen 16S rRNA và gen đặc trưng được thực hiện bởi Genlab, Việt Nam. Các phân tích được thực hiện bằng NCBI-BLAST. Cây phát sinh gen được phân tích bằng phần mềm MEGA-X.
2.2.3.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học
Các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn được phân tích bằng cách sử dụng kit
sinh hóa API20E, trong đó các xét nghiệm chủ yếu tập trung vào việc phát hiện hoạt động của enzyme
Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn được xác định theo các bước
sau: Xạ khuẩn cấy ria 3 pha trên YS. Sau 5 ngày, bào tử xạ khuẩn được thu bằng nước muối sinh lý 0,85%. Dịch bào tử được sử dụng cho các thí nghiệm cấy vạch tiếp theo.
Khả năng sử dụng nguồn Cacbon khác nhau qua khả năng đồng hóa các loại đường: Xạ khuẩn được cấy vạch lên đĩa thạch chứa môi trường bổ sung 1% đường
(D- lactose, D- glucose, D- sorbitol, sepharose, D- xylose, L- sorbose, D- fructose, D- galactose, L- rhamnose, D- mannose), ủ 30oC trong vòng 7 ngày và theo dõi hình thái sinh trưởng.
37
Ảnh hưởng của nồng độ muối tới mức độ sinh trưởng: Xạ khuẩn được cấy vạch
lên đĩa thạch chứa môi trường bổ sung NaCl (0%, 3%, 5%, 7%), ủ 30oC trong vòng 7 ngày và theo dõi hình thái sinh trưởng.
Xác định ảnh hưởng của pH tới mức độ sinh trưởng: Xạ khuẩn được cấy vạch
lên đĩa thạch chứa môi trường có pH 5, pH7, pH9, ủ 30oC trong vòng 7 ngày và theo dõi hình thái sinh trưởng.
Xác định khả năng sinh enzym ngoại bào: Xạ khuẩn được cấy vạch lên đĩa thạch chứa môi trường chứa lần lượt tinh bột, CMC, casein, ủ 30oC trong vòng 7 ngày và theo dõi hình thái sinh trưởng. Kết quả được theo dõi như sau:
Tinh bột: nhỏ thuốc nhuộm Lugol ngập đĩa petri trong 1 phút, sau đó phơi đĩa 10-20phút, quan sát vòng phân giải.
CMC: nhỏ thuốc nhuộm Red Congo 0,1% ngập đĩa petri trong 15 phút, quan sát vòng phân giải.
Casein: nhỏ thuốc nhuộm Amido Black 0,1% ngập đĩa petri trong 10 giây, quan sát vòng phân giải.
2.2.3.4. Nghiên cứu khả năng sinh chất hoạt động bề mặt (biosurfactant)
Phương pháp này được xây dựng dựa trên phương pháp của Nayarisseri và cộng sự [62] và thực hiện theo các bước: Chủng nghiên cứu sẽ được hoạt hóa trên đĩa LB hoặc YS để thu khuẩn lạc tươi mới. Khuẩn lạc vi khuẩn được nuôi lắc trong LB
150 vòng/phút, 30oC, 48 giờ; tương tự xạ khuẩn được nuôi 5 ngày trong YS. Sau đó, dịch huyền phù được mang ly tâm 6000 vòng/phút trong 15 phút. 10μL dịch sau ly tâm được nhỏ lên 100 μL dầu điều ở tâm đĩa petri Ф9 chứa 20mL nước cất. Nếu trong mảng dầu có xuất hiện vùng trong suốt thì trong dịch nuôi cấy vi khuẩn có chất hoạt động bề mặt. Tiến hành đo đường kính vòng hoạt tính và thời gian vòng hoạt tính xuất hiện theo các mốc thời gian trong khoảng 5 phút. Đối chứng dương là Tween 80 và đối chứng âm là môi trường nuôi cấy tương ứng.
38