3.3. Kết quả định danh và phân tích đặc điểm sinh học của các chủng được chọn
3.3.4. Kết quả phân tích đặc điểm sinh hóa
Kết quả phân tích đặc điểm sinh lý, sinh hóa là cơ sở để khẳng định kết quả định danh của vi khuẩn và xạ khuẩn, đồng thời cung cấp thêm thông tin về đặc điểm sinh học của các chủng được chọn.
Các kết quả đặc điểm hóa sinh của 8 chủng vi khuẩn (Bảng A7 - Phụ lục) cho thấy: Hai chủng S. maltophilia Y042, S. maltophilia Y050 có hoạt tính tương đồng, cú khả năng sinh enzyme ò-galactosidase, lysine decarboxylase, ornithine decarboxylase, arginine dihydrolase, có khả năng sử dụng trisodium citrate. Các kết quả này khá tương đồng với đặc điểm hóa sinh chủng S. maltophilia theo kit API20NE được công bố trong catalogue của Bảo tàng giống vi sinh vật Đức (DSMZ).
P. lalkuanensis PAM64 có khả năng sinh enzyme arginine dihydrolase, cytochrome-
60 oxidase, có khả năng sử dụng trisodium citrate. Đặc điểm hóa sinh này tương đồng với P. lalkuanensis PE08T được công bố bởi Thorat và cộng sự năm 2020 [91]. P.
anuradhapurensis PAM67 có khả năng sinh enzyme arginine dihydrolase, có khả năng sử dụng trisodium citrate, acetoin, lên men/oxi hoá glucose, cytochrome- oxidase. P. nitroreducens Y077 có khả năng sinh enzyme arginine dihydrolase, ornithine decarboxylase, urease, có khả năng sử dụng trisodium citrate, acetoin, lên
men/oxi hoá glucose, cytochrome-oxidase. Các kết quả này giống với đặc điểm hóa sinh được công bố trong catalogue của Bảo tàng giống vi sinh vật Đức (DSMZ).
Pseudomonas sp. T006 và Pseudomonas sp. T087 cũng có đặc điểm hóa sinh khá
tương đồng với các chủng thuộc chi Pseudomonas bên trên. Hai chủng này có khả năng sinh arginine dihydrolase, cytochrome-oxidase, T087 có khả năng sử dụng
trisodium citrate và acetoin. C. metallicidurans TN030 có khả năng sinh nhiều
enzyme như arginine dihydrolase, ornithine decarboxylase, urease và có khả năng sử dụng đa dạng các loại đường như glucose, mannitol - các đặc điểm tương đồng với
loài C. metallicidurans được công bố trong catalogue của Bảo tàng giống vi sinh vật Đức (DSMZ).
Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của hai chủng xạ khuẩn DDT21, DDT23 (Bảng 3.3 và Hình A3, A4 - Phụ lục) cho thấy: Cả hai chủng có khả năng sinh trưởng tốt trong điều kiện pH5 đến pH9 và phát triển tốt ở nồng độ muối 0 đến 3%; ở ngưỡng trên 3%, hai chủng sinh trưởng yếu hoặc không sinh trưởng. DDT21 có khả năng đồng hóa tốt đường sepharose, D- xylose, D- fructose, D- galactose, L- rhamnose trong khi DDT23 sử dụng tốt D- glucose, D- galactose, D- mannose. DDT21 và DDT23 đều có khả năng sinh enzyme protease và không có khả năng sinh enzyme amylase phân giải tinh bột. Ngoài ra, DDT21 cũng có khả năng sinh enzyme cellulase (Bảng 3.3).
Dựa vào phân tích gen 16S rRNA, DDT21 gần gũi nhất với S. marianii và S.
wuyuanensi. Khuẩn lạc DDT21 có màu xám vàng, chuỗi bào tử dạng xoắn, sinh trưởng tốt trong điều kiện pH từ 5 đến 9, nồng độ muối 0 đến 3%. DDT21 có khả năng sử dụng nhiều nguồn cac-bon như D- lactose, sepharose, D- xylose, D- fructose, D- galactose và L- rhamnose và không sử dụng được các nguồn từ D- sorbitol, L-
61 sorbose. Ngoài ra, DDT21 có khả năng sinh enzyme cellulase và protease, không có khả năng thủy phân tinh bột (Bảng 3.3). Các đặc điểm này khá tương đồng với chủng
S. marianii ICN19T trong nghiên cứu của Iniyan và cộng sự năm 2020 [48]. Vì vậy, DDT21 được xác định thuộc loài S. marianii.
Trình tự 16S rRNA của DDT23 có độ tương đồng cao nhất với S. vinaceus và
S. cirratus. Khuẩn lạc DDT23 có màu đỏ xám, chuỗi bào tử dạng thẳng, sinh trưởng tốt trong điều kiện pH từ 5 đến 9, nồng độ NaCl từ 0 đến 3%. DDT23 có khả năng sử dụng các nguồn cac-bon như D- glucose, D- xylose, D- fructose, D- galactose, D- mannose và không sử dụng được D- sorbitol, sepharose, L- sorbose, L- rhamnose.
DDT23 có khả năng sinh enzyme protease, thủy phân tinh bột yếu và không có khả năng sinh enzyme cellulase. Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa này tương đồng với S.
cirratus 248-Sq2 được công bố bởi Shiroza năm 1982. Dựa trên cây phát sinh loài và
các đặc điểm lý hóa, DDT23 được xác định thuộc loài S. cirratus [81].
Bảng 3.3. Đặc tính sinh lý, sinh hóa của hai chủng xạ khuẩn được chọn và các loài gần gũi.
Đặc tính sinh lý, sinh
hóa
DDT21
S.
marianii
ICN19T
S. wuyuanensis
KCTC 29112T DDT23
S.
vinaceus
RCS260
S.
cirratus
248-Sq2
Đặc điểm hình thái
Sắc tố (mặt trên)
Xám vàng
Xám cam
Trắng vàng
Xám hồng Trắng Xám
đỏ
Sắc tố (mặt dưới)
Vàng nhạt
Vàng nhạt
Vàng
nhạt Xám Xám ND
Chuỗi bào tử Xoắn Xoắn Xoắn Thẳng Thẳng Thẳng
Khả năng sử dụng cac-bon
D- lactose + ND ND - ND ND
D- glucose w - + + - +
D- sorbitol - ND ND - ND ND
Sepharose + ND ND - ND ND
D- xylose + + + + - +
62
L- sorbose - ND ND - ND ND
D- fructose + - + + - +
D- galactose + w + + - ND
L- rhamnose + + + - ND -
D- mannose w + - + ND ND
Ngưỡng pH sinh trưởng
5 + + + + + +
7 + + + + + +
9 + + + + + +
Ngưỡng NaCl sinh trưởng
0 + + + + + +
3 + + + + + ND
5 - - - ND
7 - - - ND
Khả năng sinh enzyme
Amylase - ND ND w + w
Cellulase + + ND - ND ND
Protease + ND ND + + ND
Chú thích: (ND) Không xác định; (+) Sinh trưởng tốt; (w) Sinh trưởng yếu; (-)
Không sinh trưởng. Dữ liệu của S. marianii ICN19T, S. wuyuanensis KCTC 29112T,
S. vinaceus RCS260, S. cirratus 248-Sq2 được sử dụng từ nghiên cứu của Iniyan và
cộng sự, Shiroza và cộng sự, Sigh và cộng sự. [48, 81, 84].
Như đã đề cập ở trên, các nghiên cứu trước đây đã báo cáo các chủng vi khuẩn như C. metallicidurans, P. stutzeri [58], Stenotrophomonas sp. [68], S. marcescens [63], Streptomyces sp. D3 có khả năng phân hủy DDT hiệu quả cao [49]. Do đó, kết quả định danh các chủng tương ứng của nhóm nghiên cứu được khẳng định thuyết phục hơn và khả năng phân hủy DDT của chúng là đáng tin cậy.
Khi cân nhắc khả năng áp dụng DDT21, DDT23, PAM64, PAM67, T006, T087, TN030, Y042, Y050, Y077 trong thực tế, 10 chủng này cần đảm bảo tính an toàn sinh học để tạo chế phẩm sinh học xử lý DDT. P. nitroreducens, P. lalkuanensis,
63
P. anuradhapurensis và C. metallicidurans là các loài an toàn sinh học cấp 1 được
công bố trong catalogue của Bảo tàng giống vi sinh vật Đức (DSMZ). S. maltophilia thuộc nhóm an toàn sinh học cấp 1 được công bố trong danh mục của Bảo tàng chủng giống vi sinh vật Hoa Kỳ (ATCC). Xạ khuẩn Streptomyces thuộc nhóm an toàn sinh học, vì vậy S. marianii và S. cirratus đều an toàn để tạo chế phẩm sinh học. An toàn sinh học cấp 1 là mức thấp nhất trong bốn cấp độ an toàn sinh học, áp dụng cho các cơ sở
thí nghiệm trong đó nhân viên làm việc với các vi khuẩn có nguy cơ thấp, ít hoặc không có nguy cơ lây nhiễm ở người lớn khỏe mạnh. Vì vậy, 10 chủng được lựa chọn (DDT21, DDT23, PAM64, PAM67, T006, T087, TN030, Y042, Y050, Y077) đều đảm bảo an toàn sinh học. Đây là điều kiện tiên quyết để các chủng được xem xét sử dụng tạo chế phẩm sinh học xử lý sinh học ô nhiễm DDT trong thực tế. Do đó, nhóm nghiên cứu kết luận đã tạo được một bộ sưu tập bao gồm mười chủng được chọn lọc có tiềm năng ứng dụng thực tế cao nhằm xử lý DDT trong đất nông nghiệp. Tiếp theo, 10 chủng được chọn sẽ tiếp tục được đánh giá khả năng sinh chất hoạt động bề mặt nhằm hỗ trợ việc tiếp cận DDT của vi khuẩn trong điều kiện thực tế.