CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2. Phương pháp đánh giá khả năng phân giải DDT bởi vi sinh vật
Các thí nghiệm được tiến hành theo các bước sau:
Chuẩn bị giống: Các chủng nghiên cứu sẽ được hoạt hóa trên đĩa LB hoặc YS để thu khuẩn lạc mới. Khuẩn lạc vi khuẩn được nuôi lắc trong LB, lắc 150 vòng/phút,
30oC. Sau 24 giờ, thu sinh khối vi khuẩn bằng ly tâm 6000 vòng/phút trong 15 phút.
Sinh khối được rửa 2 lần bằng MSM, ly tâm bỏ dịch, cuối cùng được hòa lại bằng MSM. Bào tử xạ khuẩn được thu trực tiếp trên đĩa YS và hòa lại bằng MSM. Các loại dịch huyền phù có OD600 khoảng 1,0 sẽ được dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.2.1. Khảo sát khả năng sinh trưởng của vi sinh vật trong môi trường bổ sung DDT.
Lắc so sánh
Dịch huyền phù của chủng nghiên cứu chuẩn bị như trên được tiếp giống 10%
vào các ống nghiệm chứa lần lượt MSM, MSM bổ sung DDT 5ppm, 30ppm, nuôi lắc
33 7 ngày, 150 vũng/phỳt, 30oC. Sau 7 ngày, hỳt 200àL dịch nuụi lắc vào giếng 96, đo OD (600nm) bằng máy ELISA. So sánh OD vi khuẩn sinh trưởng giữa các ống MSM, MSM bổ sung DDT 30ppm. Nếu OD ở các ống có bổ sung DDT cao hơn ống đối chứng MSM thì kết luận chủng vi khuẩn đó có khả năng sinh trưởng tốt hơn trong MSM bổ sung DDT.
Ria so sánh
20 àL dịch huyền phự của chủng nghiờn cứu chuẩn bị như trờn được nhỏ vào các đĩa thạch chứa lần lượt MSM, MSM bổ sung DDT 30ppm; lấy vị trí nhỏ dịch là pha 1, tiếp tục ria 3 pha, ủ 30oC. Sau 7 ngày, quan sát các đĩa và so sánh hình thái, nếu chủng sinh trưởng trên đĩa bổ sung DDT mạnh hơn trên đĩa đối chứng chứa MSM không có DDT thì kết luận chủng vi khuẩn đó có khả năng sử dụng DDT để phát triển tốt hơn.
2.2.2.2. Khảo sát khả năng sinh các enzyme liên quan đến quá trình phân giải DDT
2.2.2.2.1. Phương pháp đánh giá khả năng sinh enzyme loại Cl-
Phương pháp này được xây dựng dựa trên phương pháp của Bergmann và cộng sự [18] và tiến hành theo các bước sau: Dịch huyền phù được mang tiếp giống 10%
vào các ống nghiệm chứa lần lượt MSM, MSM bổ sung DDT 30ppm, nuôi lắc 7 ngày, ở tốc độ150 vũng/phỳt, 30oC. Sau 7 ngày, hỳt 200àL dịch nuụi lắc sang một giếng trờn đĩa 96-giếng, bổ sung 20àL dung dịch 0,25M Ferric ammonium sulfate
[Fe(NH4)(SO4)2.12H2O] trong 9M Nitric acid và 20àL dung dịch bóo hũa Mercuric thiocyanate trong Ethanol. Trộn đều hỗn hợp và quan sát sự thay đổi màu sắc (vàng dần nếu có Cl- tự do). Sau 10 phút, đo độ hấp thụ ở bước sóng 460nm bằng máy đo quang phổ. Mẫu Blank và mẫu để dựng đường chuẩn chứa nồng độ NaCl khác nhau (0,2,5,10,30,50 mg/L) được xử lý tương tự. Lượng Cl- bị phân giải từ DDT ra môi trường được tính bằng hiệu giữa mẫu phân tích và mẫu đối chứng.
34
2.2.2.2.2. Phương pháp đánh giá khả năng sinh enzyme oxy hóa
Phương pháp này được xây dựng dựa trên phương pháp của Kamanavalli và cộng sự [51] và tiến hành theo các bước: Chủng nghiên cứu sẽ được hoạt hóa trên đĩa LB để thu khuẩn lạc mới. Khuẩn lạc vi khuẩn được nuôi lắc trong LB bổ sung 10ppm DDT, lắc 150 vòng/phút, 30oC, 48 giờ. Tương tự, xạ khuẩn được nuôi 5 ngày trong YS. 2 mL dịch nuôi cấy được hút vào ống chứa 6 mL đệm phosphate 0,5M, pH 7,0 để đạt tỷ lệ 1 dịch : 3 đệm. Các ống được tiến hành xử lý siêu âm trong 5 phút rồi ly tâm hỗn hợp ở 15.000g, 45 phút, 4oC. Sau khi ly tâm xong, thu 5 mL dịch nổi vào ống mới, thờm dung dịch Stock DDT để đạt nồng độ 1àmol DDT. Tiến hành đo DO theo các mốc thời gian để kiểm tra nồng độ oxy trong môi trường, qua đó xác định hoạt tính enzyme oxy hóa (nếu DO giảm chứng tỏ mẫu có enzyme oxy hóa).
2.2.2.3. Phương pháp khảo sát khả năng phân giải DDT bằng GC-FID
Khả năng phân giải DDT của các chủng được khảo sát bằng cách phân tích nồng độ DDT còn lại sau những khoảng thời gian cố định bằng phương pháp sắc ký khí. Các chủng được chuẩn bị như trong các thí nghiệm trên, sau đó khả năng phân giải được đánh giá trong các môi trường MSM bán rắn có chứa 30ppm DDT. Mẫu
nghiên cứu được chiết bằng Chloroform theo tỷ lệ thể tích là 1 mẫu : 1 Chloroform.
Mỗi mẫu được phân tích bằng máy GC (Agilent 7890B), với cột glass capillary HP- 5 (ID: 0,32mm, length: 30m; film thickness: 0,2μm). Khí mang: N2 ở tốc độ 1,2 mL/phút. Injector mode: split 1:10. Thể tích injection: 1μL. Chương trình nhiệt: nhiệt độ injector: 250oC; nhiệt độ lò bắt đầu từ 170oC (giữ ở 5 phút), sau đó tăng 35oC/phút, tới 275oC (giữ ở 5 phút); nhiệt độ detector (flame ionization detector): 275oC. Peak của DDT xuất hiện ở khoảng phút thứ 10.
35