CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu và đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm GREENLAB - Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống và phòng thí nghiệm Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
Thiết bị, dụng cụ
Tủ cấy an toàn sinh học Esco (Indonesia), máy lắc ổn nhiệt ES-20/60 (Đức), nồi khử trùng SH-AC-128L (Hàn Quốc), máy ly tâm Eppendorf 5424R (Đức), quang phổ kế UV-Vis UV-2502 (Hoa Kỳ), quang phổ ELISA microplate reader Plus384 (Hoa Kỳ), hệ thống Agilent 7890B GC-FID/MS-PAL (Hoa Kỳ), máy PCR Eppendorf AG 5417R (Đức), máy điện di ngang Biorad (Hoa Kỳ), hệ thống lọc tiếp tuyến GE HealthCare (Hoa Kỳ), máy đông khô FDTA-5025 (Hàn Quốc), kính hiển vi quang học Olympus CX23 (Nhật Bản), máy đo OD Hach HQ3d (Hoa Kỳ), máy vortex IKA- 3 (Đức), pipette Eppendorf (Đức), chum kị khí, đĩa Petri thủy tinh/ nhựa, que cấy, đĩa 96 giếng, ống Eppendorf, bình tam giác, cốc đong, xi lanh, kim tiêm, …
Hóa chất: Các hóa chất đều đảm bảo chất lượng và được mua từ các hãng uy tín như
Sigma-Aldrich, Merk, Xilong… bao gồm:
- 4,4’-DDT 99,8% của Dr.Ehrenstorfer.
- Hóa chất phân lập và nuôi cấy: MgSO4.7H2O, FeSO4.7H2O, K2HPO4, CaSO4, (NH4)2SO4, NaCl, peptone, tinh bột tan, cao nấm men, nalidixic acid, cycloheximide.
- Hóa chất dùng pha vi lượng: ZnCl2, MnCl2.4H2O, CaCl2.6H2O, CuCl2.6H2O, NiCl2.6H2O, NaMO4.2H2O, CoCl2.6H2O, H3BO3.
- Hóa chất sử dụng cho xác định đặc tính sinh học của vi sinh vật: fructose, galactose, maltose, lactose, sucrose, phenol, amonium citrate, glycine, KNO3.
29 - Bộ kit tách DNA bao gồm: DNeasy® Blood & Tissue và DNeasy®
PowerSoil Pro Kits. (Qiagen, Hoa Kỳ).
- Hóa chất để tách chiết DDT: Chloroform, n-Hexane.
- Một số vật liệu khác: Rỉ đường, than bùn, xỉ than, cám gạo, tinh bột sắn, silica khói.
2.1.2. Môi trường nuôi cấy
- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Luria-Bertani [35] (g/L): 10g peptone, 5g cao nấm men, 10g NaCl, 16g agar, pH 7,0-7,2.
- Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn Yeast-Starch [47] (g/L): 10g tinh bột tan, 2g cao nấm men, 16g agar, pH 7,0-7,2.
- Môi trường Starch - Casein (SC) [41] (g/L): 10g tinh bột tan; 1g Casein; 0,5g K2HPO4; pH 7,0-7,2.
- Môi trường vi lượng bổ sung vào môi trường MSM (g/L): 1g FeSO4.7H2O;
0,07g ZnCl; 0,1g MnCl2.4H2O; 0,006g H3BO3; 0,13g CaCl2.6H2O; 0,002g CuCl2.6H2O; 0,024g NiCl2.6H2O; 0,036g NaMO4.2H2O; 0,238 g CoCl2.6H2O; pH 7,0-7,2.
- Môi trường muối khoáng Mineral Salts Medium (MSM) [68] (g/L): 0,4g
MgSO4.7H2O; 0,002g FeSO4.7H2O; 0,2g K2HPO4; 0,2g (NH4)2SO4; 0,08g CaSO4; 0,1% vi lượng; pH 7,0-7,2. Nguồn cac-bon thay thế (10g/L): glucose, maltose, succrose, tinh bột tan, rỉ đường. Nguồn nirogen thay thế (1g/L): KNO3, (NH4)2SO4, nước mắm, bột đậu tương, cao nấm men.
- Môi trường muối khoáng MSM bổ sung DDT:
Stock DDT 1000ppm: 100mL Acetone + 100mg DDT.
MSM bán rắn bổ sung 30ppm DDT: 970mL MSM + 30mL Stock + 2,5g agarose.
30
2.1.3. Đối tượng nghiên cứu
2.1.3.1. Mẫu đất phân lập
- Các chủng vi sinh vật được phân lập từ 13 mẫu đất lấy từ các địa điểm ô
nhiễm thuốc BVTV tại tỉnh Nghệ An, Việt Nam, theo Quyết định 1946/QĐ-TTg do Thủ tướng Chính Phủ ban hành, được thu thập trong các túi zip bạc vô trùng bằng phương pháp lấy mẫu thường quy. Các mẫu đất được làm khô, lưu trữ ở 4oC và được sử dụng ngay để phân lập.
Bảng 2.1. Thông tin mẫu đất thu thập tại Nghệ An.
Tên mẫu Tọa độ Địa điểm thu mẫu Ghi chú
M97 19o18’42”B
122o36’5”Đ Nông trường Vực
Rồng Đất trồng chè, cỏ không mọc
M98 19o18’42”B
122o36’5”Đ Nông trường Vực
Rồng Đất trồng chè, cỏ mọc
M99 19o18’42”B
122o36’5”Đ
Nông trường Vực Rồng Đất nên kho thuốc cũ, đất cũ
M100 19o18’42”B
122o36’5”Đ
Nông trường Vực Rồng
Đất nên kho thuốc cũ, đất phủ
mới
M101 19°10′47″B
105°19′11″Đ
Gần UBND xã Tân Phú
Đất nền kho thuốc cũ, rìa rừng
cao su
M102 19°10′47″B
105°19′11″Đ
Gần UBND xã Tân Phú
Đất nền kho thuốc cũ, đất trồng
chè
M103 19o12’31”B
105o21’3”Đ
Nông trường Con Cuông Đất mọc cỏ, rìa rừng cao su
M104 19o12’31”B
105o21’3”Đ
Nông trường Con
Cuông Đất trồng sắn
M105 19o12’31”B
105o21’3”Đ Nông trường Con
Cuông
Nền kho thuốc cũ, hiện là nhà dân, đất vườn trồng chuối
M106 18o59’43”B
105o0’39”Đ Hùng Sơn, Anh Sơn Đất nền kho thuốc cũ, giữa
luống ngô
M107 18o59’43”B
105o0’39”Đ Hùng Sơn, Anh Sơn Đất nền kho thuốc cũ, rìa ruộng
ngô
31 M108 18o59’43”B
105o0’39”Đ Hùng Sơn, Anh Sơn Đất chân đồi chè, ngoài luống
M109 18o59’43”B
105o0’39”Đ Hùng Sơn, Anh Sơn Đất chân đồi chè, giữa luống
2.1.3.2. Các chủng vi khuẩn bổ sung
- 10 chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy các hợp chất vòng thơm chứa gốc halogen như toluene, naphthalene, trichloroethylene nằm trong bộ sưu tập vi sinh vật của phòng thí nghiệm GREENLAB, bao gồm 09 chủng phân lập từ đất nông nghiệp (PAM64, PAM67, A003, T006, T036, Y007, Y017, Y042 và Y050) và 01 chủng phân lập từ mẫu đất gần làng tái chế kim loại ở tỉnh Hưng Yên (TN030).