báo cáo thực hành kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm

Tổng số khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí của từng nồng độ pha loãng ..... ảKhi đó mật độ tổng khuẩn lạc có hình dạng điển hình, đường kính 0,5 mm được tính theo công thức sau: 103đã vượt quá

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA H C SINH H C Ọ Ọ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA H C SINH H C Ọ Ọ

BÁO CÁO THỰC HÀNH

KI ỂM NGHI M VI SINH TH C PH M Ệ Ự Ẩ

Hướng dẫ n khoa h c ọ Sinh viên thực hi ện

TS TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG TRẦN THỊ CẨM NHUNG

TRẦN HÀ THẢO VY NGUY N NGỄ ỌC HIẾ U

LÊ DUY VŨ

TP.THỦ ĐỨC, 5/2023

i

Trang

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ii

DANH SÁCH CÁC HÌNH iii

DANH SÁCH CÁC BẢNG iv

Bài 1 ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS VÀ E COLI 1

1.1 Định lượng Coliforms và E Coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 1

1.1.1 Định lượng Coliforms bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 1

1.1.1.2 Bi n lu n 3 ệ ậ 1.1.2 Định lượng E Coli bằng phương pháp đếm khu n l c 4 ẩ ạ 1.1.2.1 K t qu 4 ế ả 1.2 Định lượng Coliforms và E Coli bằng phương pháp MPN 6

1.2.1 Định lượng Coliforms bằng phương pháp MPN 6

1.2.2 Định lượng E Coli bằng phương pháp MPN 8

BÀI 3 ĐỊNH TÍNH SALMONELLA 10

3.1 K t qu 10 ế ả 3.3 K t lu n 11 ế ậ BÀI 4 ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ VÀ TỔNG NẤM MEN NẤM MỐC 12

4.1 Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí 12

4.1.1 K t qu 12 ế ả 4.2 Định lượng tổng số nấm men, nấm mốc 13 4.2.1 K t qu 13 ế ả 4.3 Th o lu n 14 ả ậ 4.4 K t lu n 15ế ậ

ii

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

BGBL: Brilliant Green Bile Broth Lactose

BPW: Buffered Pepton Water

CFU( Colony forming unit): Đơn vị hình thành khuẩ ạn l c

DRBC: Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar

EMB: Eosin Methylene Blue Agar

EC: E coli medium

HE: Hektoen Entric Agar

MPN: Most Probable Number

PCA: Plate Agar

RV: Rappaport Vassiliadis Soya Pepton –

TBX: Thạch trypton m t glucuronid – ậ –

VRBL: Th ch lactoza mạ ật đỏ trung tính tím tinh th ể

iii

DANH S ÁCH CÁC HÌNH

Trang Hình 1.1 Môi trường VRBL 37 C sau 24 gi t i nủ o ờ ạ ồng độ pha loãng 10-1 1Hình 1.2 Môi trường VRBL 37 C sau 24 gi t i nủ o ờ ạ ồng độ pha loãng 10-2 2Hình 1.3 Môi trường VRBL 37 C sau 24 gi t i nủ o ờ ạ ồng độ pha loãng 10-3 3Hình 1.4 Môi trường TBX 44 C sau 24 gi 5 ủ o ờHình 1.5 Môi trường LSB 37 C sau 24 gi 7 ủ o ờHình 1.6 Môi trường BGBL37 Co sau 24 gi 7 ờHình 1.7 Môi trường EC44,5oC sau 48 gi 8 ờHình 1.8 Môi trường EMB 37 C sau 24 gi 9 ủ o ờHình 3.1 Mẫu trong môi trường BPW 10 Hình 3.2 M u sau khi c y RV 10 ẫ ấ

Hình 3.3 Môi trường HE sau khi 37 C sau 24 gi .11 ủ o ờ

Hình 4.1 Môi trường PCA t i nạ ồng độ pha loãng 10-1 12Hình 4.2 Môi trường PCA t i nạ ồng độ pha loãng 10-2 13Hình 4.3 Môi trường DRBC 25 C sau 3 ủ o – 5 ngày ạ ồng độ t i n pha loãng 10-1 13 Hình 4.4 Môi trường DRBC 25 C sau 3 ủ o – 5 ngày tạ ồng đội n pha loãng 10-2 14

iv

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Tổng số khuẩn lạc điển hình ủa từng n c ồng độ 4

Bảng 1.2 Tổng số khuẩn lạc c a từng nủ ồng độ 6

Bảng 1.3 Số ống nghiệm sinh hơi t i từng nạ ồng độ pha loãng 8

Bảng 4.1 Tổng số khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí của từng nồng độ pha loãng 14

Bảng 4.2 Tổng số nấm men, nấm mốc c a từng nủ ồng độ pha loãng 15

Bài 1 ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS VÀ E COLI

1.1 Định lượng Coliforms và E Coli ằng phương pháp đế b m khu n l c ẩ ạ

1.1.1 Định lượng Coliforms bằng phương pháp đếm khu n l ẩ ạc

1.1.1.1 K t qu ế ả

Coliforms sau khi được cấy đổ và ủ trong môi trường VRBL 37 C trong 24 gi ở o ờ

ta quan sát và đếm số khu n lạc ở các đĩa có nồng độ pha loãng 10ẩ -1, 10 , 10 -2 -3

Hình 1.1 Môi trường VRBL ủ 37 C sau 24 gi o ờ tại nồng độ pha loãng 10-1

(a) Mặt trước đĩa cấy 1; (b) Mặt sau đĩa cấy 1; (c) Mặt trước đĩa cấy 2; (d) M t ặ

sau đĩa cấy 2

Tại nồng độ 10 , b-1 ằng phương pháp đếm khu n l c ẩ ạ đơn (CFU/ml):

Đĩa 1 có tổng số khuẩn lạc>250 hiện diện nên không thể định lượng chính xác khuẩn l c trong ạ môi trường VRBL t i nạ ồng độ pha loãng 10-1(Hình 1.1 a và b) Tương

tự, đĩa 2 cũng không thể xác định được số lượng khuẩn lạc chính xác (Hình 1.1 c và d)

Do đó, nhóm không thể định lượng chính xác ổ t ng s khu n l c ố ẩ ạ điển hình ệ hi n di n t i ệ ạnồng độ pha loãng 10-1 trong môi trường

Hình 1.2 Môi trường VRBL ủ 37 C sau 24 gi o ờ tại nồng độ pha loãng 10-2

(a) M ặt trước đĩa cấy 1; (b) Mặt sau đĩa cấy 1; (c) Mặt trước đĩa cấy 2; (d) M t ặ

sau đĩa cấy 2

Tại nồng độ 10 , b-2 ằng phương pháp đếm khu n l c (CFU): ẩ ạ

Đĩa 1 có khoảng 120 khu n l c ẩ ạ điển hình với đường kính 0,5 mm hiện diện (Hình 1.2 a và b) Đĩa 2 có khoả ng 132 khu n l c ẩ ạ điển hình ới đường kính 0,5 mm hiệ v n di n ệ(Hình 1 c và d) Từ đó, tổ2 ng số khuẩn lạc mà nhóm thu được tại nồng độ pha loãng

10-2 kho ng 252 khu n lả ẩ ạc hiện di n tệ rong môi trường

a)

b)

Hình 1.3 Môi trườ ng VRBL ủ 37 C sau 24 gi o ờ tại nồng độ pha loãng

10 -3 (a) Mặt trước đĩa cấy 1; (b) Mặt sau đĩa cấy 1; (c) Mặt trước đĩa cấy

2; (d) Mặt sau đĩa cấy 2.

Tại nồng độ 10 , b-3 ằng phương pháp đếm khu n l c (CFU): ẩ ạ

Đĩa 1 có khoảng 88 khuẩn lạc điển hình ới đường kính 0,5 mm hiệv n diện (Hình 1.3 a và b) Đĩa 2 có khoả ng 76 khu n l c ẩ ạ điển hình với đường kính 0,5 mm hiện di n ệ(Hình 1 c và d) Từ đó, tổ3 ng số khuẩn lạc mà nhóm thu được tại nồng độ 10 kho-3 ảng

164 khu n l c hi n di n trong ẩ ạ ệ ệ môi trường

Quan sát thấy 6 đĩa cấy của nhóm đều lên khuẩn lạc điển hình Tuy nhiên, môi trường thạch không đều, bị vón cục, b chảy thạch Điều này ảnh hưởị ng việc đế và m định lượng khuẩn lạc của nhóm

_ : không định lượng chính xác đượ ốc s khu n l c ẩ ạ

Từ B ng 1.1, ta ch n nhả ọ ững đĩa có số đếm trong kho ng 25 - ả 250 để tính kết qu ảKhi đó mật độ tổng khuẩn lạc có hình dạng điển hình, đường kính 0,5 mm được tính theo công thức sau:

103đã vượt quá tiêu chuẩn cho phép vì vậ, y mẫu cần có các biện phápđiều chỉnh để kiểm soát lượng Coliforms có trong m u hoẫ ặc tiêu hủy m u n u c n thi t ẫ ế ầ ế

1.1.2 Định lượng E Coli bằng phương pháp đếm khu n l c ẩ ạ

1.1.2.1 K t qu ế ả

E Coli sau khi được cấy và trong môi trườ ủ ng TBX ở 44 C, o ta quan sát và đếm được số khuẩn lạc ở các đĩa có nồng độ pha loãng 10-1, 10 , 10 -2 -3

Hình 1.4 Môi trường TBX ủ 44 C sau 24 gi o ờ (a) Mặt trước đĩa cấy 1; (b)

M ặt sau đĩa cấy 1; (c) Mặt trước đĩa cấy 2; (d) Mặt sau đĩa cấy 2

Tại nồng độ 10 , b-1 ằng phương pháp đếm khu n l c (CFU): ẩ ạ

Đĩa 1 có khoảng 43 khuẩn lạc hiện diện (Hình 1.4 a) Đĩa 2 có khoảng 39 khuẩn lạc hi n di n (Hệ ệ ình 1.4 b) T ng s khu n lổ ố ẩ ạc mà nhóm thu được t i nạ ồng độ 10 kho-1 ảng

82 khu n l c hi n di n trong ẩ ạ ệ ệ môi trường

Tại nồng độ 10 , b-2 ằng phương pháp đếm khu n l c (CFU): ẩ ạ

Đĩa 1 có khoảng 5 khuẩn lạc hiện diện (Hình 1.4 c) Đĩa 2 có khoảng 5 khuẩn lạc hiện diện (hình 1.4 d) Tổng s khu n lố ẩ ạc mà nhóm thu được tại nồng độ 10 kho ng 10 -2 ảkhuẩn l c hi n di n trong ạ ệ ệ môi trường

Tại nồng độ 10 , k-3 hông thấy s ự phát triển của khuẩn lạc trong môi trường Do đó, tại nồng độ pha loãng 10-3không có khuẩ ạn l c hi n di n trong ệ ệ môi trường

a)

d) b)

c)

Nhìn tổng thể, thông qua hình dạng khuẩn lạc đặc trưng cả 6 đĩa cấy của nhóm không có sự hiện diện của E Colimà là các vi khuẩn hiếu khí

1.1.2.2 Th o luả ận

Qua k t qu cế ả ủa 6 đĩa môi trường, nhóm có 4 đĩa cấ ởy hai nồng độ 10-1 và 10-2

thu được khu n l c ẩ ạ không phả là E.coli ừ ẫu nước mía mà nhóm kiểm địi t m nh Từng nồng độ cho tổng số khuẩn lạc như sau:

vượt ngư ng cho phép nên mẫu ỡ không được sử dụng trong thực phẩm

1.1.2.3 K t lu n ế ậ

Mẫu không có sự xuất hiện khuẩn lạc điển hình (màu xanh) của E Coli Vì vậy, không có E Coli trong mẫu nước mía nhóm kiểm định

1.2 Định lượng Coliforms và E Coli ằng phương pháp MPN b

1.2.1 Định lượng Coliforms bằng phương pháp MPN

1.2.1.1 K t qu ế ả

Sau khi mủ ẫu trong môi trường canh LSB 37 C trong 48 gi : ở o ờ

Từ k t qu ế ả trên, cả ống LSB trên đều dương tính (sinh hơi) 9

Tiến hành cấy vào ống canh BGBL ủ ở 37 C trong 48 gio ờ Quan sát cả 9 ống nghiệm sau 48 giờ:

Hình 1.6 Môi trường BGBL 37 C sau 48 gi o ờ (a) Nồng độ pha loãng 10-1 ; (b) Nồng độ pha loãng 10-2 ; (c) Nồng độ pha loãng 10-3

Quan sát h ện tượi ng xảy ra trong ng nghi m, ố ệ nhóm thấy cả 9 ống đều cho k t qu ế ảdương tính do có vi khuẩn sinh hơi trên bề mặt môi trường cấy

1.2.1.2 Bi n lu n ệ ậ

Các ống canh BGBL đều dương tính (sinh hơi) do mật độ vi khu n trong m u ẩ ẫ còn cao nên cần ph i ki m nghi m m u ả ể ệ ẫ ở các nồng độ pha loãng cao hơn để định lượng chính xác Coliforms trong mẫu

1.2.1.3 Th o lu n ả ậ

Qua k t qu c a 9 ế ả ủ ống nghi m ệ nhóm kiểm định đều cho ra k t qu ế ả dương tính (sinh hơi) tại mỗi nồng độ pha loãng khác nhau 10 , 10-1 -2,10-3 Từng nồng độ pha loãng cho thấy s ự sinh hơi của vi khu n ẩ như sau:

Bảng 1.3 Số ống nghiệm sinh hơi t i từng nạ ồng độ pha loãng

Lần lặp lại và ống sinh hơi

Từ b ng 1.3, ta tiả ến hành xác định ch s MPN bỉ ố ằng cách tra bảng MPN lo t 3 ạ ống nghiệm ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp

Do k t quế ả thí nghiệm cho ra c 9 ả ống dương tính từ ả b ng MPN cho ra ch s ỉ ốMPN>110 * 10 (MPN/ml) Điều này chứng t r ng mỏ ằ ật độ vi khu n trong mẩ ẫu còn rất nhiều nên không thể định lượng chính xác được

1.2.1.4 K t lu n ế ậ

Từ k t qu ế ả trên cho thấy có Colifroms hi n di n trong mệ ệ ẫu Tuy nhiên, do mật độ

vi khuẩn quá cao nên không ể đị th nh lượng chính xác được Coliforms trong m u ẫ

1.2.2 Định lượng E Coli bằng phương pháp MPN

1.2.2.1 K t qu ế ả

Cũng từ 9 ống LBS dương tính (Hình 1.5), ta cấy vào canh EC và ủ ở 44,5 C trong o

24 giờ để E Coli tăng sinh Sau 24 giờ ủ ta quan sát kết qu : ả

Hình 1.7 Môi trường EC 44,5 C sau 48 gi o ờ (a) Nồng độ pha loãng 10-1 ; (b) Nồng độ pha loãng 10-2 ; (c) Nồng độ pha loãng 10-3

Quan sát h ện tượi ng xảy ra trong ng nghi m, ố ệ nhóm thấy c 9 ả ống đều dương tính

do có vi khuẩn sinh hơi trên bề ặt môi trườ m ng cấy

Tiến hành chọn 3 ống nghiệm dương tính ở lần lượt ba nồng độ pha loãng khác nhau và đem đi cấy lên môi trường th ch EMB, ạ ủ ở 37 C trong 24 gi Sau 24 gi ta o ờ ờquan sát được:

Hình 3.1 Mẫu trong môi trường BPW (a) Trước khi ủ; (b) Sau khi ủ

Sau khi ta th y vi sinh v t bủ ấ ậ ắt tăng sinh trong BPW (Hình 3.1 b) Tiế ụp t c ti n ếhành cấy 0,1 ml dịch tăng sinh sang môi trường tăng sinh chọn lọc RV và ủ ở 42 C trong o

18 - 24 gi Sau 18 - 24 giờ ờ, quan sát kết qu : ả

Hình 3.2 Môi trường tăng sinh chọn lọc RV.

Sau khi ủ quan sát đượ trên Hình 3.2, ống nghiệm nuôi cấc y mẫu có màu nhạt hơn ống nghiệm đối chứng Tiến hành lấy ống mẫu cấy phân lập trong mỗi trường

HE và ủ ở 37 C trong 24 gio ờ

Hình 3.3 Môi trường HE sau khi ủ 37 C sau 24 gi o ờ.

Qua hình 3.3, nhóm thấy không thấy được khuẩn lạc điển hình có màu xanh lục,

có tâm đen nhưng có sự hiện diện của khu n lạẩ c vi khu n hiẩ ếu khí

3.3 K t lu n ế ậ

Từ k t quế ả trên, cho thấy không có sự hi n di n c a ệ ệ ủ Salmonella nghi ng trong ờmẫu tôm khô

Đĩa cấy 1 có khoảng 134 khu n l c vi khu n hiẩ ạ ẩ ếu khí trên đĩa (Hình 4.1 a) Đĩa cấy

2 có khoảng 219 khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí trên đĩa (Hình 4.1 b) Tổng số khuẩn lạc

mà nhóm thu được từ mẫu thí nghiệm tại nồng độ pha loãng 10-1 khoảng 353 khu n l c ẩ ạ

từ vi khu n hi u kẩ ế hí

số khu n lẩ ạc mà nhóm thu đượ ừ ẫu thí nghiệc t m m t i nạ ồng độ pha loãng 10-2 kho ng ả

38 khu n lẩ ạc từ vi khu n hiẩ ếu khí

Tại nồng độ pha loãng 10-3, không thấy s hi n di n c a khu n l c vi khu n hi u ự ệ ệ ủ ẩ ạ ẩ ếkhí trên môi trường cấy PCA

4.2 Định lượng t ng s n m men, n m m c ổ ố ấ ấ ố

4.2.1 K t qu ế ả

Sau khi mẫu được pha loãng, cấy trên môi trường DRBC và đượ ủ ởc 25 C t 3 -o ừ

5 ngày ta quan sát được kết quả:

Hình 4.3 Môi trườ ng DRBC ủ 25 o C sau 3 - 5 ngày (a) Đĩa cấy 1; (b) Đĩa cấy 2

Tại nồng độ pha loãng 10-1:

Đĩa cấy 1 có khoảng 129 khuẩn lạc nấm mốc, nấm men trên môi trường DRBC (Hình 4.3 a) Đĩa cấy 2 có khoảng 125 khuẩn lạc nấm mốc, nấm men trên môi trường DRBC (Hình 4.3 b) Tổng s khu n lố ẩ ạc thu đượ ừ ẫu thí nghiệc t m m t i nạ ồng độ pha loãng 10 kho-1 ảng 254 khu n l c từ nấm mốc, nấm men ẩ ạ

Hình 4.4 Môi trườ ng DRBC ủ 25 o C sau 3 - 5 ngày tạ ồng độ pha loãng 10i n -2

(a) Đĩa cấ y 1; (b) Đĩa cấy 2

Tại nồng độ pha loãng 10-2:

Đĩa cấy 1 có khoảng 13 khuẩn lạc nấm mốc, nấm men trên môi trường DRBC (Hình 4.3 a) Đĩa cấy 2 có khoảng 12 khuẩn lạc nấm mốc, nấm men trên môi trường DRBC (Hình 4.3 b) Tổng số khuẩn lạc thu được từ mẫu thí nghiệm tại nồng độ pha loãng 10-2 khoảng 25 khuẩn l c từ nấm mốc, n m men ạ ấ

Tại nồng độ 10 , -3 không thấy được sự xu t hi n c a khu n l c n m m c, n m men ấ ệ ủ ẩ ạ ấ ố ấ

4.3 Th o lu n ả ậ

Qua kết qu c a 6 ả ủ đĩa môi trường c a ủ nhóm đều thu được khu n l c tẩ ạ ừ 4 đĩa cấy

tại nồng độ pha loãng 10-1 và 10 t-2 ừ mẫu bún tươi mà nhóm ểm địki nh Từng nồng độcho tổng s khu n lố ẩ ạc như sau:

Bảng 4.1 Tổng số khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí của từng nồng độ pha loãng

A=

(2∗ 0,1 ∗ 10−1) = 1,76 * 10 (CFU / ml) 3

Đố ới v i 6 đĩa môi trường DRBC, ta cũng thu được khuẩn lạc từ 4 đĩa cấy tại nồng

độ pha loãng 10 và -1 10-2 t mừ ẫu bún tươi mà nhóm kiểm định Từng nồng độ cho tổng

số khu n lẩ ạc như sau:

Bảng 4.2 Tổng số nấm men, nấm mốc của từng nồng độ pha loãng

Từ đó tổng vi sinh v t hiậ ếu khí thu được :

Tổng vi sinh v t hiậ ếu khí = tổng vi khu n hiẩ ếu khí + tổng n m men, n m m c ấ ấ ốThay số li u vệ ừa tính ta được kết qu sau : ả

Tổng vi sinh v t hiậ ếu khí = 1,76 * 10 + 1,2 * 10 = 1,4 * 10 (CFU/ml) 3 4 4

Với k t quế ả nhóm tính toán trên, ta tra khảo với quy định tiêu chuẩn v sinh An ệtoàn thực phẩm của Bộ Y tế với mật độ tổng vi sinh vật hiếu khí cho phép hiện diện trong m u s n ph m ch bi n tẫ ả ẩ ế ế ừ ngũ cốc, khoai củ, đậu đỗ, bánh bột (dùng trực ti p ếkhông qua xử lý nhiệt trước khi sử dụng) tổng vi sinh vật hiếu khí là 10 Tuy nhiên,4

mật độ t ng vi sinh v t hiổ ậ ếu khí của nhóm là 104không vượt quá ngưỡng cho phép nên mẫu có thể được sử dụng trong thực phẩm

4.4 K t lu n ế ậ

Tổng vi sinh v t hiậ ếu khí trong mẫu bún là 104 phù hợp với quy định tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực ph m cẩ ủa Bộ Y tế