báo cáo thực hành kiểm nghiệm vi sinh trong thực phẩm

Hiện tượng quan sát ở các nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp.... Hiện tượng quan sát ở các nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp.... Hiện tượng quan sát và thông kê số liệu ở các nồng độ ph

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRUONG DAI HOC NONG LAM THANH PHO HO CHi MINH

KHOA KHOA HOC SINH HQC

BAO CAO THUC HANH

KIEM NGHIEM VI SINH TRONG THUC PHAM

Giảng viên hướng dẫn : ThS Lê Phước Thọ Môn học : Thực hành kiểm nghiệm vi sinh Sinh viên thực hiện : Nhóm Í

Niên khóa : 2021 — 2025

TP Thu Dire, 05/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRUONG DAI HOC NONG LAM THANH PHO HO CHi MINH

KHOA KHOA HOC SINH HQC

BAO CAO THUC HANH

KIEM NGHIEM VI SINH TRONG THUC PHAM

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

ThS LÊ PHƯỚC THỌ LE THI MY QUYEN

PHAM THI NGOC HUYEN MAI NGUYEN THUC DIEM TRAN PHAM THAO NGUYEN NGUYEN DUC THIEN TRAN VAN QUOC

TP Thu Dire, 05/2023

CHƯƠNG 1 DINH LUGNG COLIFORMS VA E.COLI .cccscccsscesssesssessesssesssessseeane 1

1.1 Định lượng Coliforms và E.Coli bằng phương phap diém khuan lạc 1

1.1.1 Phuong phap tinh két qua cscs essessessessessessessessesscssessssnsssessesieseseaeasees 1

1.1.2 Định lượng số vi khuân Coliforms - s22 S 11251151555 55585 E5 eEEEtrerrrsee 1

1.1.2.1 Hiện tượng quan sát ở các nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp 1

1.1.2.2 Thống kê số liệu khuẩn lạc ở mỗi nồng độ pha loãng 2-52-5225 s¿ 1

1.1.2.3 Thao Wan oe cee cesessesesesesesecsesesaesesesacsesecaeseuacsesesseaenecaesenaesenenseseecseeenas 2

1.1.3 Dinh hong $6 vi khan E.Coli cecceccsscssesssssssssssessessessessessessessessessessess 3

1.1.3.1 Hiện tượng quan sát ở các nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp - 3

1.1.3.2 Thống kê số liệu khuẩn lạc ở nỗng độ pha loãng 10ˆ - 2 cc2c2cszc+ 3

II ha na 3

IE NCT /1‹4(15Ÿ-iẢẢÝÝỶÝỶÝỶÝỶÝÝÝ 4 1.1.4.1 Kết quả - s22 12 1211211211211 11 1222122 tt rryu 4 1.1.4.1 Kiến nghị 2s Sn TT TỰ 2212 1212121211111 rrrre 4

1.2 Định lượng Coliforms và E.Coli bằng phương pháp MPN 5c sec: 4

1.2.1 Hiện tượng quan sáắt - 2 2 2112112111 1111011111115 0118110111111 11H HH rời 4

1.2.2 Thống kê số liệu ống LBS sinh hơi -2- 52 St S+2E2E2E212121212E 2E ctyee 5

1.2.3.1.1 Hiện tượng quan sát - 0 c2 1212211211111 1511115 1181111111111 1 H110 1 reo 6

1.2.3.2 Định lượng E.Coli trong ống canh EC (chỉ tiêu E.Coli) 5: se: 7

1.2.3.2.1 Hiện tượng quan sát - 5c c1 2 22112111 11211211211 118111111111 1 110111 key 7

1.2.3.2.2 Kết quả khi cấy vào môi trường EMB 5c csct tren 7

1.2.3.3 Thảo luận - 1 2221121 111512111 151211115111 1111111 111111111111 1111111 01111110111 1111 tk §

1.2.3.4 Kết quả và kiến nghị 5 SE SE 121121121121121 21212121 1e rrerreree §

1.2.3.4.1 KẾT quả - + 211211211211211 11 11 T21 12t 12t 111111 reo § 1.2.3.4.2 Kiến nghị - sccn TT TH H221 1212121212121 rere 9

CHUONG 2 DINH TINH SALMONELLA .cccccsssssessessesesseseesecsesessessesesseeverearestesees 10

2.1 Định tinh Salmonella trong thực pham Leveccesceseaececsessceccesessceccesensccsessauscceestsasensentes 10 2.1.1 Hiện tượng quan sát cccccscescessessesscescessessessesseessessessessessesesessesesseeses 10

2.1.1.1 Hiện tượng quan sát trong môi trường tăng sinh BPW co co 10 2.1.1.2 Hiện tượng quan sát trong môi trường tăng sinh chọn lọc RV 11

2.2 Phân lập khuân lạc đơn 2-52: s22 12E12E121211211211211 1112112122 erre 11

2.2.1 Phân lap khuan lạc đơn trên môi trường thạch XLD .- 52-52 525522 11

2.2.2 Phan lap khuan lạc đơn trên môi trường thạch HE . 2: 2 sz2z++25+2 12 2.3 Thảo luận s5 5s 12212215 211271121121122121121111111 1121112120121 E121212 re 12 2.4 Kết quả và kiến nghị 2 5c 5s s SE E2 122122 8212212221212 erei 12

2.4.1 KẾT quả c2 1211211211211 1121212122 12

2.4.2 Kiến nghị - 5c c S11 1211 1111212121111 re 13 CHƯƠNG 3 ĐỊNH LƯỢNG TÔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ VÀ TONG NAM MEN - NĂM MỘC 0 202222122 021221 02122112212 1121211 21121111 re 14 3.1 Phương pháp tính kết quả -:- 25s St tEE2Et2E12E2E12E12E22E2EE2EE21E11E 111tr 14

3.2 Hiện tượng quan sát và thông kê số liệu ở các nồng độ pha loãng 14

3.2.1 Định lượng tong vi khuân hiểu khí 2 SE S111 155551 155551 SE EEesrsrrrereer 14

3.2.2 Thống kê số liệu khuẩn lạc ở nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp 15

3.2.3 Định lượng tông nắm men - nấm mốc .- is 22s E212351 11215555 1E EErsse 15

3.2.4 Thống kê số liệu nấm men — nắm mốc ở nông độ pha loãng : 15

3.3 Thảo luận ¿2:21 2 2211211221221 1111211111111 2101110112111 reu 16 3.5 Kết quả và kiến nghị -: 5c ctct St E2 2121222222221 eerre 16 3.5.1 KẾT quả S0 5 nh TH HH n1 11111 16

3.5.2 Kiến nghị s2 1112112112112 1 121212 2t t1 re 16

TBX VRBL LSB BGBL

EC EMB BPW

RV XLD

HE PCA DRBC MPN CFU

DANH SACH CHU VIET TAT

: Thach trypton - mat — glucuronid

: Thạch lactoza mật đó trung tinh tim tinh thé : Lauryl Sulphate Broth

: Brilliant Green Bile Broth

- E coli medium : Eosin Methylene Blue Agar : Buffered Water

: Rappaport - Vassiliadis Soya Pepton : Xylose Lysine Desoxycholate : Hektoen Entric Agar : Plate agar : Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar : Most Probable Number

: Colony Forming Units

il

DANH SACH CAC HINH

Trang

Hinh 1 1 Đĩa petri chứa Coliforms ở nông độ pha loãng bậc 10 liên tiếp 1

Hình 1 2 Đĩa petri chứa khudin lac E.Coli .cccccccccccccccscsssscecesscssssesescevseecevsvecevevesevsesesves 3

Hình 1 3 Các ông canh LSB chứa mẫu ở các nông độ pha loãng sau khi ú ở 37°C trong 2Á ĐỒ Q.11 11 011 5111111111111 K 1x11 1111111111111 11111111111 1111111 1011111111111 11 tk 5

Hình I1 4 Các ống canh BGBL chứa dung dịch LSB đương tính ở các nồng độ pha

0 6 Hình I 5 Các ống canh EC chứa dung dịch LSB đương tính ở các nồng độ pha loãng

¬— 7

Hình 1 6 Đĩa petri chứa khuain lac E.Colis.cccccccccccccccccsssscecesscssssesescsvseecsvsveceveeeevseeesves 8

Hình 2 1 Mẫu (tôm khô) khi ú ở môi trường tăng sinh BPW eee 10 Hình 2 2 Chuyên dịch mẫu vào môi trường tăng sinh RV sao 24 giờ II

Hình 2 3 Phân lập khuẩn lạc đơn trên đĩa petri chứa môi trường XLD 11

Hình 2 4 Phân lập khuẩn lạc đơn trén dia petri chứa môi trường HE 12 Hình 3 1 Đĩa petri chứa vi khuẩn hiếu khí ở nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp 4

Hinh 3 2 Dia petri chứa nấm men — nắm mốc ở nồng độ 10'Ì - + + zzcs+ 15

DANH SACH CAC BANG

Trang

Bang 1.1 Mật độ Coliforms xuất hiện ở những nồng độ pha loãng 1

Bang 1.2 Mật độ khuẩn lạc xuất hiện ở nồng độ 10'1 - + s22 EeEEerErrrre 3

Bang 1.3 Số lượng ống LSB dương tính - 5: s2 2 15E15E1211211211211E11Ecrre 5

Bang 3.1 Mật độ vi khuẩn hiếu khí ở nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp 15

Bang 3.2 Mật độ nắm men — nam mốc ở nồng độ pha loãng 10'1 - 5-55: 15

CHUONG 1 DINH LUQNG COLIFORMS VA E.COLI

1.1 Định lượng Coliforms và E.Coli bằng phương pháp điểm khuẩn lạc

1.1.2 Định lượng số vi khuẩn Coliforms

1.1.2.1 Hiện tượng quan sát ớ các nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp

Sau khi trộn đều mẫu với môi trường VRBL (44 - 47°C) và ủ ở 37°C, 24 giờ Xuất

hiện khuẩn lạc màu đỏ tía và có vùng mật tủa hơi đỏ bao quanh, đó la vi khuân

Tey )

Hình 1 1 Dia petri chứa Coliforms ớ nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp (4) nỗng độ

pha loãng 10”, (B) nông độ pha loãng 10”, (C) nông độ pha loãng 10”

Coliforms

1.1.2.2 Thống kê số liệu khuẩn lạc ở mỗi nồng độ pha loãng

Bang 1.1 Mật độ Coliforms xuất hiện ở những nồng độ pha loãng

Mau Nông độ pha loãng Đĩa Mật độ

Chon nhiing dia petri cé sé long khuan lac tir 10 — 150, dém nhing khuan lac

điển hình có màu đó tía có đư ờng kính 0,5 mm trở lên (đôi khi có vùng mật tủa hơi đỏ bao quanh) Áp dụng công thức trên:

— 111+112

Dựa vào kết quả trên ta xác định được mật độ Coliforms có trong nước mía cao

hơn mức chỉ tiêu cho phép sự có mặt trong nước giải khát không côn là 10 CFU/ml

Theo “ Giới hạn sinh vật trong thực phẩm - Giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học

trong thực phâm (Ban hành kèm Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT ngày 19/12/2007 của

Bộ trưởng Bộ Y tế)” thi long Coliforms cho phép la 10? CFU/ml Nguyên nhân dẫn

đến nông độ CFU/ ml vượt ngưỡng ở mẫu có thê do chế biến nước mía chưa được đảm

bảo an toàn vệ sinh thực phẩm, mang tính tự phát, nguyên vật liệu sử dụng chưa bảo

quản đúng cách, thiết bị sử dụng để chế biến được vệ sinh câu thả, Mía là một nguyên liệu chứa nhiều đường, do vậy các côn trùng (kiến, ruỏi, ) sẽ bị hấp dẫn Từ đó, côn trùng sẽ mang nhiều chúng loài vi sinh vật đến, dẫn đến khi sử dụng sẽ mang một lượng

lớn vi khuân có hại vào cơ thê

1.1.3 Định lượng số vi khuẩn E.Coli

1.1.3.1 Hiện tượng quan sát ớ các nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp

Sau khi cấy mẫu vào môi trường TBX ú ở 44°C, 24 giờ Môi trường TBX sẽ xuất hiện khuẩn lạc gồm khuẩn lạc điên hình và không điền hình Nếu trên đĩa có khuẩn lạc

màu xanh thì trong mẫu có chứa E.Coli

Hình I 2 Đĩa petri chứa khuân lạc E.Coli (4) nông độ 10°

1.1.3.2 Thống kê số liệu khuẩn lạc ở nồng độ pha loãng 10

Bảng 1.2 Mật độ khuân lạc xuất hiện ở nồng độ 10

Số khuẩn Số khuẩn Tổng số Mẫn Nông độ Đĩa T T

lac dién hinh lạc không điênhình khuân lạc

Chọn những đĩa petri có số lượng khuẩn lạc điên hình (có màu xanh) nhỏ hơn 150

và tông số khuẩn lạc nhỏ hơn 300 (gồm cả điển hình và không điền hình) Số khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa chứa ít nhất có 15 khuẩn lạc điển hình

Với tông số khuẩn lạc trên đĩa ở nồng độ 10), ta chia làm 2 trường hợp để giải thích cho kết quả trên:

Trường hợp 1: Số khuẩn lac dién hinh khéng xuat hiện trên đĩa, tống số khuẩn lạc

bằng 1 (bao gỗm cả điền hình và không điền hình) Với kết quả trên, mat d6 E.Coli trong mẫu nước mía bằng 0 CFU/ml thì phủ hợp với chỉ tiêu cho phép sự có mặt E.Coli trong

nước giải khát không côn Theo “ Giới hạn sinh vật trong thực phẩm - Giới hạn tôi da 6

nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm (Ban hành kèm Quyết định số 46/2007/QD-

BYT ngay 19/12/2007 của Bộ trưởng Bộ Y tế)” thì lượng E.Coli cho phép là không có ngia la 0 CFU/ml

Trường hợp 2: Trong quá trình thực hiện có sai sót, chưa cân thận, khá chủ quan dẫn đến vi sinh vật trong mẫu chết ảnh hướng đến kết quả Thao tác cấy bị sai, que cay nóng, dịch cấy chưa khô, cấy gần sát đèn cồn dẫn đến chết vi sinh vật Quá trình đồng nhất mẫu, pha loãng mẫu qua các nồng độ, thao tác sử dụng micropipette hút mẫu dẫn

đến mật độ vi sinh vật giảm

1.1.4 Kết quả và kiến nghị

1.1.4.1 Kết quả

Dựa vào số liệu có được, Coliforms có trong mẫu vượt ngưỡng cho phép, E.Coli

có trong mẫu đạt chỉ tiêu cho phép Kết luận này chỉ mang tính chất tham khảo cần có

sự kiểm tra cụ thê chính xác từ các cơ quan chức năng đề có thể đưa ra kết quả chính xác nhất

1.1.4.1 Kiến nghị

Cần thực hiện lại qui trình, cần thận hơn khi tao thác, tránh sai nhiều lần làm tốn thời gian và vật liệu

1.2 Định lượng Coliforms và E.Coli bằng phương pháp MPN

1.2.1 Hiện tượng quan sát

Chuan bi dich đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có nồng độ pha loãng 101, 107,

103 Sau đó chuyên 1 ml dung dịch mẫu 101, 102, 103 vào ống 10 ml canh LSB, mỗi nông độ có 3 ống lặp lai, 1 37°C, 24 giờ

Ong canh LSB (Lauryl Sulphate Broth) được thiết kế dé thu nhận sự sinh trưởng mạnh mẽ và lượng khí lớn từ cầu lượng nhỏ Coliform Thể mang bào tử hoàn toàn bị ức chế trong môi trường này Tryptose cung cấp các chất sinh trưởng cần thiết, như hợp

chất Nitơ và Cacbon, Sulfate và các thành phần vi lượng Hệ đệm của môi trường là

Potassium Phosphates, trong khi Sodium Chloride duy trì cân bằng áp suất thấm thấu Sodium Lauryl sulphate ức chế các sinh vật khác không phải Coliforms

Hình 1 3 Các ông canh LSB chứa mẫu ở các nồng độ pha loãng sau khi ủ ở 37°C

trong 24 giờ (4) nông độ pha loãng 101, (R) nông độ pha loãng 102, (C) nẵng độ pha

loãng 10”, (ĐC) ống đối chứng

Kết quả cho thấy các ống ở nồng độ 10}, 102 đều có hiện tượng đục và sinh hơi

trong ống Durham cho thấy có sự lên men lactose bởi Coliform va E.Coli Giả định là sản phẩm mẫu chứa nhiều Coliforms và E.Coli

So với ông đối chứng: Nông độ 101: 3 ống (A) bị đục, ống durham sinh hơi Nồng

độ 102: 3 ống (B) bị đục, ống durham sinh hơi Nồng độ 10”: 3 ống (C) không bị đục,

ống durham không sinh hơi

1.2.2 Thống kê số liệu ống LBS sinh hơi

Bang 1.3 Số lượng ống LSB dương tính

Mẫu Nông độ Số ông đương tính

101 3 Nước mía 102 3

10° 0

1.2.3 Dinh lgng Coliforms va E.Coli trong ống canh BGBL va EC

1.2.3.1 Định lượng Coliforms trong ống canh BGBL (chỉ tiêu Coliforms)

1.2.3.1.1 Hiện tượng quan sat

Cấy 0,1 ml các ống LSB đương tính có mẫu ở nông độ 10!, 102 vào ống canh BGBL ủ ở 37°C trong 24 giờ

Hình I 4 Các ống canh BGBL chứa dung dịch LSB dương tính ở các nồng độ pha

loãng (4) nông độ pha loãng 101, (B) nông độ pha loãng 10?, (ĐC) đối chứng

Ong canh BGBL (Brilliant Green Bile Broth) thuong duoc goi bang tén khac —

Brilliant Green Lactose Bile Broth — được sử dung đề định lượng và phát hiển vi khuẩn Coliform trong thực phẩm, sản phẩm từ sữa, nước sạch, nước thải và nhiều loại thực

pham khac Brilliant Green Bile Broth 2% chita hai chất ức chế cả vi khuẩn Gram âm, là Thuốc nhuộm xanh Oxygall và Brilliant Mô động vật được tiêu hóa cung cấp các đưỡng

chất cần thiết cho sự tăng trướng: Nitơ, Vitamin, Khoảng chất và Axit Amin Các vi sinh vật Coliforms có khả năng chống lại sử hoạt động của các chất ức chế và Quá trình lên mem Lactose Quá trình lên mem được phát hiện thông qua việc sản xuất khí trong ông Durham

Tất cả các ống BGBL ở hai nồng độ đều cho kết quả dương tính Chứng tỏ sự phát triển của Coliform có trong môi trường ở nông độ rất cao

So với ống đối chứng: Nông độ 101: 3 ống bị đục, ống durham sinh hơi Nồng độ 102: 3 ống bị đục, ống durham sinh hơi

1.2.3.1.1 Mật độ Coliforms theo chỉ số MPN/ml

Các ống canh BGBL đều dương tính