Thực hành kiểm nghiệm vi sinh

Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO Trang 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO THỰC HÀNHKIỂM NGHIỆM VI SINH TRONG THỰC PHẨMGiản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

KIỂM NGHIỆM VI SINH TRONG THỰC PHẨM

Tháng 04 năm 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

KIỂM NGHIỆM VI SINH TRONG THỰC PHẨM

ĐỖ NGỌC BẢO CHÂN HUỲNH NGỌC THÙY DƯƠNG

PHẠM THỊ MỸ HẠNH ĐOÀN NGHI THẢO

Tháng 04 năm 2023

MỤC LỤC

MỤC LỤC DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT

TẮT DANH SÁCH CÁC HÌNH DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bài 1 ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS

VÀ E COLI 1.1 Định lượng Coliforms và E

coli bằng phương pháp khuẩn

lạc

1.1.1 Định lượng E coli bằng

phương pháp khuẩn lạc

1.1.2 Định lượng Coliforms bằng

phương pháp đếm khuẩn lạc

1.2 Định lượng Coliforms và E

coli bằng phương pháp MPN

1.2.1 Môi trường LSB

1.2.2 Định lượng Coliforms bằng

phương pháp MPN

1.2.3 Định lượng E coli bằng

phương pháp MPN Bài 3 ĐỊNH LƯỢNG

SALMONELLA

3.1 Định tính Salmonella trong thực

phẩm 3.1.1 Môi trường tăng sinh BPW 3.1.2 Môi trường tăng sinh chọn lọc

RVS 3.1.3 Môi trường HE 3.1.4 Môi trường XLD Bài 4 ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI

KHUẨN HIẾU KHÍ VÀ TỔNG NẤM MEN – NẤM MỐC

4.1 Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí

4.1.1 Kết quả

4.1.2 Biện luận

4.1.3 Kết luận

4.2 Định lượng nấm men – nấm mốc

4.2.1 Kết quả

4.2.2 Biện luận

4.2.3 Kết luận

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

TBX: Tryptone Bile X glucuronide

VRBL: Violet Red Bile Agar

LSB: Lauryl Sulfate Broth

BGBL: Brilliant Green Bile Broth Lactose

EC: E Coli Medium

EMB: Eosin Methylene Blue Agar

BPW: Buffered Peptone Water

RV: Rappaport Vassiliadis Soya

HE: Hektoen Entric Agar

XLD: Xylose Lysine Desoxycholate

PCA: Plate Count Agar

DRBC: Dichloran-Rose Bengal Chloramphenicol Agar

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1.1 Mẫu nước mía môi trường TBX 1

Hình 1.2 Mẫu nước mía môi trường VRBL 2

Hình 1.3 Mẫu nước mía pha loãng trên môi trường LSB 3

Hình 1.4 Mẫu nước mía pha loãng trên môi trường BGBL 4

Hình 1.5 Mẫu nước mía pha loãng trên môi trường EC 5

Hình 1.6 Đĩa petri có E coli được cấy ria trên môi trường EMB 6

Hình 3.1 Mẫu tôm khô mua từ chợ 7

Hình 3.2 Mẫu khi đã đồng nhất trong BPW 7

Hình 3.3 Mẫu sau 24 giờ tăng sinh trong RV 8

Hình 3.4 Đĩa môi trường HE sau 24 giờ phân lập khuẩn lạc 8

Hình 3.5 Đĩa môi trường XLD sau 24 giờ phân lập khuẩn lạc 9

Hình 4.1 Mẫu bún trong môi trường PCA 10

Hình 4.2 Mẫu bún trong môi trường DRBC 11

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Số lượng khuẩn lạc trên môi trường TBX 1 Bảng 3.1 Số lượng khuẩn lạc trên môi trường DRBC 12

Bài 1 ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS VÀ E COLI

1.1 Định lượng Coliforms và E coli bằng phương pháp khuẩn lạc

1.1.1 Định lượng E coli bằng phương pháp khuẩn lạc

1.1.1.1 Kết quả

Hình 1.1 Mẫu nước mía môi trường TBX A Nồng dộ 10 -1 ; B Nồng độ 10 -2

Nhận xét: không có sự xuất hiện của E coli trên môi trường TBX.

1.1.1.2 Biện luận

Môi trường TBX (Tryptone Bile X-glucuronide) là môi trường màu được thiết

kế nhằm mục đích xác định và làm giàu vi khuẩn Escherichia coli trong mẫu thực

phẩm, thức ăn chăn nuôi và nước

E coli được nuôi cấy trên Tryptone Bile X-Glucuronide (TBX) để xuất hiện

dưới dạng khuẩn lạc màu xanh sau thời gian ủ bệnh trong 24 giờ Escherichia coli có

thời gian ủ 12 - 72 giờ với nhiệt độ tăng trưởng tối ưu là 37°C

Số khuẩn lạc: số lượng khuẩn lạc trên đĩa có nồng độ pha loãng sau hai lần lặp lại của từng nồng độ khác nhau

Do số lượng khuẩn trên đĩa nồng độ 10-1 sau hai lần lặp lại đều là không nên không cần đề cập hình của đĩa có nồng độ 10-2 và 10-3

Qua thực nghiệm chỉ có sự xuất hiện sinh vật hiếu khí mà không thấy sự tồn tại

của E coli nên không cần tiếp tục các bước tiếp theo của thí nghiệm.

Bảng 1.1 Số lượng khuẩn lạc trên môi trường TBX

(n 1+0,1 n 2)×V × d = (2+0,1 ×2)× 1036+25+1−1

×10−2 ¿2,8 ×1 0

4 CFU/ml

1.1.1.3 Kết luận

Trên mẫu nước mía nghi ngờ có sự xuất hiện của E coli nhưng rất thấp (<15)

đồng thời trên môi trường cấy cũng xuất hiện các sinh vật hiếu khí với mật độ là

1.1.2 Định lượng Coliforms bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

1.1.2.1 Kết quả

Hình 1.2 Mẫu nước mía môi trường VRBL ở nồng độ 10-1 A Lặp lại lần 1;

B Lặp lại lần 2.

1.1.2.2 Biện luận

Môi trường VRBL (Violet Red Bile Lactose) là một môi trường chọn lọc được

sử dụng để phát hiện và định lượng Coliforms và Coliforms chịu nhiệt trong mẫu sữa

và thực phẩm

Coliforms được nuôi cấy trên môi trường VRBL theo phương pháp cấy đổ rồi ủ

ở nhiệt độ 30 - 37oC, sau 24 giờ để xuất hiện dưới dạng khuẩn lạc điển hình màu đỏ tía, có đường kính 0,5 mm trở lên

Số khuẩn lạc: đếm số khuẩn lạc sau khi ủ, chọn những đĩa có từ 10 - 150 khuẩn lạc:

Ở nồng độ 10-1, mật độ khuẩn lạc lớn, không thể đếm được số khuẩn lạc

Ở nồng độ 10-2, có khuẩn lạc đơn nhưng số lượng nằm ngoài phạm vi 10 - 150 nên không đếm

Ở nồng độ 10-3, khuẩn lạc xuất hiện với mật độ rất thấp (<10 khuẩn lạc/ 1 đĩa petri) nên không đủ điều kiện để chọn

Ngoài ra, ở các nồng độ còn có sự xuất hiện của các khuẩn lạc khác Điều này

có thể do các vi sinh vật tồn tại sẵn trong nước mía hoặc do trong quá trình cấy, thao tác cấy không chuẩn làm đĩa cấy bị nhiễm

Ở các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3 đều có xuất hiện Coliforms Tuy nhiên, số khuẩn lạc đơn ở các nồng độ không thỏa điều kiện để định lượng Coliforms trong mẫu theo

phương pháp CFU

1.1.2.3 Kết luận

Trong mẫu nước mía được chọn nghi ngờ có sự tồn tại của Coliforms nhưng

không định lượng được bằng phương pháp CFU

1.2 Định lượng Coliforms và E coli bằng phương pháp MPN

1.2.1 Môi trường LSB

1.2.1.1 Kết quả

Hình 1.3 Mẫu nước mía pha loãng trên môi trường LSB A Nồng độ 10 -1 ; B Nồng độ 10 -2 ; C Nồng độ 10 -3

Nhận xét: các ống nghiệm LBS (+) sau khi ủ trong nhiệt độ 37oC trong 48 giờ Các ống dương tính ở các nồng độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 cho thấy có sự sinh hơi trong ống Durham và các ống bị đục màu

1.2.1.2 Biện luận

Môi trường LSB (Lauryl Sulphate Broth) được thiết kế để thu nhận sự sinh

trưởng mạnh mẽ và lượng khí lớn từ cấu lượng nhỏ Coliforms.

Coliforms được nuôi cấy trong môi trường LSB (Lauryl Sulphate Broth) để

xuất hiện hiện tượng sinh hơi và vẩn đục ở nhiệt độ 37oC trong 48 giờ

1.2.1.3 Kết luận

Mẫu nước mía nghi ngờ có sự tồn tại của vi khuẩn Coliforms.

1.2.2 Định lượng Coliforms bằng phương pháp MPN

1.2.2.1 Kết quả

Hình 1.4 Mẫu nước mía pha loãng trên môi trường BGBL A Nồng độ 10 -1 , B Nồng độ 10 -2 ; C Nồng độ 10 -3 ; D Đối chứng.

Nhận xét: các ống nghiệm BGBL (+) khi cấy mẫu từ các ống LBS (+) sau khi ủ trong nhiệt độ 37oC trong 48 giờ Các ống dương tính ở các nồng độ pha loãng 10-1, 10

-2, 10-3 cho thấy có sự sinh hơi trong ống Durham và các ống bị đục màu

1.2.2.2 Biện luận

Môi trường nuôi cấy vi sinh BGBL (Brilliant Green Lactose Bile Broth) được

sử dụng để định lượng và phát hiển vi khuẩn Coliforms trong thực phẩm, sản phẩm từ

sữa, nước sạch, nước thải và nhiều loại thực phẩm khác

Coliforms được nuôi cấy trong môi trường BGBL (Brilliant Green Lactose Bile

Broth) để xuất hiện hiện tượng sinh hơi và vẩn đục ở nhiệt độ 37oC trong 48 giờ

MPN/100ml = >1,1 x 102

Do chỉ pha loãng ở các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3 nên không biết chính xác mật độ của khuẩn lạc, cần pha loãng thêm nhiều nồng độ tiếp theo nữa để xác định rõ mật độ

của Coliforms.

Dựa trên quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm

thì đối với nhóm nước giải khát không cồn, giới hạn tối đa có 1000 vi khuẩn Coliforms

được tìm thấy trong 100 ml sản phẩm nên mẫu thu được có mật độ lớn hơn mật độ cho phép

1.2.2.3 Kết luận

Mẫu nước mía nghi ngờ có sự tồn tại của vi khuẩn Coliforms nên không an toàn

cho người sử dụng

1.2.3 Định lượng E coli bằng phương pháp MPN

1.2.3.1 Môi trường EC

1.2.3.1.1 Kết quả

Hình 1.5 Mẫu nước mía pha loãng trên môi trường EC A Đối chứng; B Nồng độ 10 -3 ; C Nồng

độ 10 -2 ; D Nồng độ 10 -1

Nhận xét: các ống nghiệm cho kết quả dương tính (có sinh hơi và đục môi trường)

1.2.3.1.2 Biện luận

Trong môi trường EC nhận thấy có sinh hơi và đục môi trường nên dương tính

nghi ngờ có E coli ta phải tiếp tục cấy ria ở môi trường EMB ủ ở 37°C trong 24 giờ

Môi trường EC là một môi trường chọn lọc được sử dụng để khẳng định có E.

coli trong nước, sữa và thực phẩm.

1.2.3.1.3 Kết luận

Mẫu nước mía nghi ngờ có E coli.

1.2.3.2 Môi trường EMB

1.2.3.2.1 Kết quả

Hình 1.6 Đĩa petri có E coli được cấy ria trên môi trường EMB

Nhận xét: có khuẩn lạc đơn nhưng không có sự xuất hiện của E coli cho khuẩn

lạc có ánh kim xanh

1.2.3.2.2 Biện luận

Không có sự có mặt của E coli nhưng vẫn có những khuẩn lạc khác Môi

trường EMB (Eosin methylene blue) là môi trường nuôi cấy chọn lọc cho vi khuẩn

gram âm và thường được sử dụng cho phân lập và phân biệt Coliforms.

1.2.3.2.3 Kết luận

Trong mẫu nghi ngờ không có E coli.

Bài 3 ĐỊNH LƯỢNG SALMONELLA

3.1 Định tính Salmonella trong thực phẩm

Mẫu tôm khô tại chợ nghi ngờ nhiễm Salmonella Tiến hành định tính

Salmonella trong mẫu thực phẩm nghi ngờ.

Hình 3.1 Mẫu tôm khô mua từ chợ

3.1.1 Môi trường tăng sinh BPW

Đồng nhất 10g mẫu tôm khô trong 90ml môi trường tăng sinh BPW

Hình 3.2 Mẫu khi đã đồng nhất trong BPW

Nhận xét: sau 24 giờ tăng sinh, môi trường có màu đục và có mùi hôi, chứng tỏ trong môi trường đã có vi khuẩn

3.1.2 Môi trường tăng sinh chọn lọc RVS

Cấy 0,1 ml dịch tăng sinh sang môi trường tăng sinh chọn

lọc RVS, ủ ở 42oC trong 18 - 24h Tiếp tục thực hiện phân lập

khuẩn lạc đơn lên đĩa môi trường HE, XLD chọn lọc phân biệt

đặc trưng cho Salmonella.

Nhận xét: môi trường tăng sinh chọn lọc RVS sau khi cấy

dịch tăng sinh có màu nhạt dần, chứng tỏ trong mẫu có vi khuẩn

đang tăng sinh

3.1.3 Môi trường HE

3.1.3.1 Kết quả

Hình 3.4 Đĩa môi trường HE sau 24 giờ phân lập khuẩn lạc

Nhận xét: có xuất hiện khuẩn lạc đơn nhưng không có sự xuất hiện của

Salmonella để cho khuẩn lạc đặc trưng.

3.1.3.2 Biện luận

Môi trường HE có xuất hiện khuẩn lạc đơn nhưng không xuất hiện khuẩn lạc

đặc trưng, cho thấy mẫu âm tính với Salmonella nhưng chỉ có thể nghi ngờ chứ không

thể chắc chắn là không có khuẩn lạc Salmonella tồn tại nên để chắc chắn ta cần tiến

hành thử nghiệm sinh hóa để đảm bảo kết quả không sai

3.1.3.3 Kết luận

Dựa theo kết quả thu được từ thực nghiệm, mẫu tôm khô tại chợ nghi ngờ

không có Salmonella.

Hình 3.3 Mẫu sau 24 giờ tăng sinh trong RV

3.1.4 Môi trường XLD

3.1.4.1 Kết quả

Hình 3.5 Đĩa môi trường XLD sau 24 giờ phân lập khuẩn lạc

Nhận xét: có xuất hiện khuẩn lạc đơn nhưng không có sự xuất hiện của

Salmonella để cho khuẩn lạc đặc trưng là khuẩn lạc có tâm đen.

3.1.4.2 Biện luận

Môi trường XLD chỉ có các khuẩn lạc màu hồng trong suốt xuất hiện nhưng không phát hiện khuẩn lạc có tâm đen nên chỉ có thể nghi ngờ chứ không thể chắc

chắn là không có khuẩn lạc Salmonella tồn tại nên để chắc chắn ta cần tiến hành thử

nghiệm sinh hóa để đảm bảo kết quả không sai

3.1.4.3 Kết luận

Dựa theo kết quả thu được từ thực nghiệm, mẫu tôm khô tại chợ nghi ngờ

không có Salmonella.

Bài 4 ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ VÀ

TỔNG NẤM MEN – NẤM MỐC

4.1 Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí

4.1.1 Kết quả

Hình 4.1 Mẫu bún trong môi trường PCA A Nồng độ 10 -1 ; B Nồng độ 10 -2 ; C Nồng

độ 10 -3

4.1.2 Biện luận

Môi trường Plate Count Agar (PCA) là môi trường không chọn lọc, dùng để định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí trong thực phẩm, các sản phẩm từ sữa, nước, nước thải

Tổng số vi khuẩn hiếu khí trong thực phẩm có thể được xác định bằng phương pháp nuôi cấy trên bề mặt thạch

Vi sinh vật hiếu khí được nuôi cấy trên Plate Count Agar (PCA) để xuất hiện dưới dạng khuẩn lạc màu trắng sau thời gian ủ trong 24 giờ ở 30oC

Tổng số vi sinh vật hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm, đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm, mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm

Số khuẩn lạc: số lượng khuẩn lạc trên đĩa có nồng độ pha loãng sau hai lần lặp lại của từng nồng độ khác nhau

Trên đĩa nồng độ 10-1 xuất hiện nhiều khuẩn lạc màu trắng là những vi khuẩn hiếu khí

Trên đĩa nồng độ 10-2 ở lần lặp lại 1 không xuất hiện khuẩn lạc do thao tác cấy sai (cấy trang chưa khô,…) Trên đĩa nồng độ 10-2 ở lần lặp lại 2 có xuất hiện khuẩn lạc và có thêm các vi sinh vật hiếu khí khác

Số lượng khuẩn trên đĩa nồng độ 10-3 sau hai lần lặp lại đều là 0 (có nhiễm vi sinh vật khác do thao tác sai ở lần lặp lại thứ 1; cấy trang chưa khô ở lần lặp lại thứ 2)

4.1.3 Kết luận

Có vi sinh vật hiếu khí phát triển trong mẫu bún, đồng thời có vi sinh vật hiếu khí khác

4.2 Định lượng nấm men – nấm mốc

4.2.1 Kết quả

Hình 4.2 Mẫu bún trong môi trường DRBC A Nồng độ 10 -1 ; B Nồng độ 10 -2 ; C Nồng độ

10 -3

4.2.2 Biện luận

Môi trường Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC) là môi trường phân lập có chọn lọc nấm men và nấm mốc đặc biệt trong các mẫu thực phẩm

Nấm mốc là vi nấm dạng sợi, sinh sản bằng bào tử hoặc khuẩn ty Nấm men là những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, thỉnh thoảng có thể tồn tại ở dạng khuẩn ty giả trong đó các tế bào kết nhau thành chuỗi

Nấm men, nấm mốc được nuôi cấy trên Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC) để xuất hiện dưới dạng khuẩn lạc màu hồng sau thời gian ủ trong 3 - 5 ngày ở 25oC

Nấm men, nấm mốc được coi là chỉ thị chất lượng thực phẩm, trước khi đưa thực phẩm ra tiêu thụ ngoài thị trường thì các cơ sở chế biến thực phẩm cần kiểm tra nấm men, nấm mốc trong thực phẩm với mục đích xác định tính an toàn của thực phẩm

Trên đĩa nồng độ 10-1 xuất hiện nhiều lạc nấm màu hồng là những vi sinh vật hiếu khí

Số lạc nấm: số lượng lạc nấm trên đĩa có nồng độ pha loãng sau hai lần lặp lại của từng nồng độ khác nhau, giảm dần từ nồng độ 10-1 đến nồng độ 10-2 và 10-3

Bảng 3.1 Số lượng khuẩn lạc trên môi trường DRBC

Số lượng Lần lặp 1Lần lặp 2 >250>250 125240 5557

CFU/ml

4.2.3 Kết luận

Có xuất hiện nấm men, nấm mốc trong mẫu bún Với mẫu bún có số tế bào nấm men nấm mốc là 2,17×105 CFU/ml, vượt mức an toàn so với quyết định 46/2007/QD BYT Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học hóa học thực phẩm