Bài giảng Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm vi sinh

Trang 6 CƠ SỞ VẬT CHẤTPhải bố trí khu vực riêng hay có qui định rõ ràng phân biệt từng khu vực để thực hiện các công việc liên quan đến kiểm nghiệm mẫu như:• Các khu vực bảo quản, giao n

THỰC HÀNH TỐT PHÒNG KIỂM NGHIỆM VI SINH

ThS Lê Khánh Trúc Diễm

Khoa Vi sinh Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP Hồ Chí Minh

MỤC ĐÍCH

những hướng dẫn để xây dựng hệ thống chất lượng theo tiêu chuẩn thực hành tốt phòng kiểm nghiệm.

dụng cho công nhận đối với các phòng thử nghiệm (PTN) thuộc lĩnh vực sinh.

NHỮNG YÊU CẦU CHUNG

I. Nhân sự

II. Cơ sở vật chất, trang thiết bịIII. Quản lý kỹ thuật

NHÂN SỰ

 Năng lực cán bộ

• Kiểm nghiệm viên phòng kiểm nghiệm vi sinh phải có trình độ cơ bản về sinh học, có thể là Dược sĩ Đại học,

DS trung học hoặc cử nhân sinh học

• Được đào tạo các kỹ năng cơ bản về thực hành vi sinh và các phép thử sinh học thường gặp trong phòng kiểm

nghiệm vi sinh

NHÂN SỰ

 Quản lý:

• Cần phải có phân công, mô tả cụ thể các chức năng, nhiệm

vụ của từng vị trí nhiệm vụ trong phòng thí nghiệm như quản

CƠ SỞ VẬT CHẤT

Phải bố trí khu vực riêng hay có qui định rõ ràng phân biệt từng khu vực để thực hiện các công việc liên quan đến

kiểm nghiệm mẫu như:

• Các khu vực bảo quản, giao nhận mẫu, khu vực mẫu chưa kiểm, mẫu chờ kiểm, mẫu có những yêu cầu bảo quản đặc biệt…

• Các khu vực chuẩn bị môi trường, dụng cụ thử nghiệm

CƠ SỞ VẬT CHẤT

CƠ SỞ VẬT CHẤT

Các khu vực bảo quản

• môi trường đông khô/ môi trường đã pha chế

• dụng cụ đã/chưa tiệt trùng…,

• Hóa chất, thuốc thử, chủng vi sinh vật chuẩn

• Các khu vực thử nghiệm, khu vực để các thiết bị ủ, khu vực

xử lý dụng cụ sau thử nghiệm…

Việc bố trí các khu vực này phải đảm bảo phù hợp về các yêu cầu cấp độ sạch, nhiệt độ /độ ẩm, bố trí đường đi một chiều, thuận lợi cho công việc thử nghiệm cũng như làm vệ

CƠ SỞ VẬT CHẤT

CƠ SỞ VẬT CHẤT

Để giảm việc tạp nhiễm cũng như để thuận tiện cho

việc làm vệ sinh, cần chú ý đến việc thiết kế:

vật liệu chịu được các chất tẩy rửa mạnh

và trần nhà

CƠ SỞ VẬT CHẤT

CƠ SỞ VẬT CHẤT

• Không sử dụng đồ gỗ thô, nhám hoặc để trần

• Không bố trí quá nhiều máy móc thiết bị không cần thiết trong khu vực thử nghiệm Chỉ mang vào khu vực thử nghiệm

những tài liệu cần thiết

Khí dung

CƠ SỞ VẬT CHẤT

 Máy móc trang thiết bị phải đáp ứng với yêu cầu của nhiệm

vụ Phòng kiểm nghiệm vi sinh phải có các trang thiết bị sau:

• Tủ cấy vô trùng (Laminar Air Flow- LAF)/ Tủ an toàn sinh học (Bio Safety Cabinet-BSC)

• Tủ ấm ổn nhiệt

• Nồi hấp

CƠ SỞ VẬT CHẤT

LAF

CƠ SỞ VẬT CHẤT

BSC

CƠ SỞ VẬT CHẤT

• Cân kỹ thuật/ Cân phân tích

• Nồi cách thủy/ tủ sấy/ ly tâm

• Kính hiển vi

• Thiết bị đếm khuẩn lạc/ đo đường kính vòng vô khuẩn

• Máy quang phổ/ máy siêu âm

• Thiết bị đếm tiểu phân trong không khí/ Lấy mẫu vi sinh không khí

CƠ SỞ VẬT CHẤT

QUẢN LÝ KỸ THUẬT

1. Kiểm soát môi trường làm việc

2. Quản lý trang thiết bị

KIỂM SOÁT MÔI TRƯỜNG

 Yêu cầu chất lượng môi trường phụ thuộc vào từng loại công việc Đối với phòng kiểm nghiệm, chất lượng môi trường phụ thuộc vào phép thử có yêu cầu kiểm soát môi trường hay không

 Một số phép thử có kiểm soát môi trường

KIỂM SOÁT MÔI TRƯỜNG

 Khái niệm khu vực có kiểm soát chất lượng môi trường: Khu

vực có kiểm soát chất lượng môi trường là khu vực cần phải được quản lý các yếu tố như tiểu phân bụi, vi sinh trong

không khí / bề mặt nhà xưởng, vị trí làm việc… nhiệt độ, độ ẩm

KIỂM SOÁT MÔI TRƯỜNG

 Người ta đã thống kê và xác định các nguồn gây nhiễm

Phân loại cấp độ sạch theo tiểu phân

Phân loại cấp độ sạch theo giới hạn tiểu phân vi sinh (EU/WHO)

Một số chỉ tiêu đánh giá khác

So sánh các cấp sạch tương ứng (sử dụng trong ngành Dược).

Các yếu tố cần giám sát

 Là những yếu tố có thể ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm, chất lượng làm việc hay kết quả thử nghiệm Các yếu tố bao gồm:

• Số lượng tiểu phân ( airborne) trong không khí

• Số lượng tiểu phân vi sinh trong không khí

• Số lượng tiểu phân vi sinh trên bề mặt các thiết bị có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm

Các yếu tố cần giám sát

• Số lượng tiểu phân vi sinh ở tay/găng tay, trang phục của kiểm nghiệm viên

• Kiểm soát nhiệt độ, độ ẩm

• Kiểm soát tốc độ gió, tốc độ trao đổi không khí, chênh áp giữa các khu vực sạch khác nhau

• Kiểm soát chất lượng nước

Biện pháp thực hiện

Hướng dẫn công việc:

• Mô tả chi tiết và cụ thể kế hoạch, vị trí và tần số lấy mẫu.

mẫu cần lấy, phương pháp xử lý/kiểm nghiệm, mẫu sau khi lấy mẫu.

Biện pháp thực hiện

• Trình bày chi tiết cách thiết lập giới hạn cảnh báo và giới hạn hành động Biện pháp xử lý khi gặp giới hạn cảnh báo/hành động Phân tích xu hướng, biện pháp và các bước trong quá trình điều tra khi gặp giới hạn hành động

• Các công tác về đào tạo nhân sự trong mọi khâu như kỹ thuật làm vệ sinh, phương pháp lấy mẫu, xử lý phân tích mẫu, sử dụng thành thạo các trang thiết bị , phương pháp điều tra,

khắc phục…

SOP cho từng công việc cụ thể

Kế hoạch và vị trí lấy mẫu

• Phải xác định vị trí lấy mẫu ngay từ khi khu vực có yêu cầu kiểm soát được đưa vào hoạt động

• Các vị trí lấy mẫu này phải được thể hiện cụ thể trên

Kế hoạch và vị trí lấy mẫu

 Việc xác định vị trí lấy mẫu phải được xác định theo nguyên tắc:

• Ưu tiên chọn các vị trí mà không khí có tiếp xúc với các sản phẩm hở, gọi là khu vực có nguy cơ cao và vùng phụ cận

• Ưu tiên chọn những vị trí có khả năng nhiễm bẩn cao nhất trong khu vực cần giám sát như khu vực bên trong hay xung quanh những khu vực mà hoạt động sản xuất hay kiểm

nghiệm diễn ra với cường độ cao nhất

Kế hoạch và vị trí lấy mẫu

nguyên tắc:

kiểm tra các vị trí có tốc độ trao đổi khí thấp nhất

hay nơi mà không khí bị xáo trộn nhiều nhất như

cửa ra vào, hộp chuyển dụng cụ cửa thoát hay hồi lưu không khí, giữa 2 lọc HEPA, các góc phòng…

Ví dụ về vị trí lấy mẫu

Minh họa sơ đồ lấy mẫu

A: Lấy mẫu bề mặt B: Lấy mẫu không khí C: Lấy mẫu bề mặt tường HD: Máy sấy tay

Tần số lấy mẫu

 Tần số lấy mẫu phụ thuộc vào:

• Cấp độ sạch của khu vực

• Nguy cơ nhiễm bẩn của vị trí

• Bản chất, yêu cầu của quá trình sản xuất/kiểm nghiệm

Tần số lấy mẫu theo cấp sạch của một số tham

số (WHO)

Tần số lấy mẫu theo cấp sạch theo USP30

Thời điểm lấy mẫu

• Lấy mẫu tĩnh: Là hành động lấy mẫu khi không có bất kỳ

một hoạt động nào diễn ra trong khu vực có kiểm soát Lấy mẫu tĩnh thường được thực hiện sau khi lắp đặt hệ thống, sửa chữa, bảo trì hoặc làm vệ sinh Thời điểm thích hợp nhất là sau khi làm vệ sinh 15-20 phút

• Lấy mẫu động: Nên chọn thời điểm lấy mẫu thích hợp để

tránh gây cản trở các hoạt động diễn ra trong khu vực cần lấy mẫu Đa số trường hợp, thời điểm thích hợp là lúc khi qui

Thời điểm lấy mẫu

• Lấy mẫu để thẩm định chương trình vệ sinh: Lấy mẫu

trước và sau khi vệ sinh nhà xưởng, bề mặt máy móc, trước

và sau khi rửa tay

air

as built

Cỡ mẫu

• Lượng mẫu cần lấy như thể tích bề mặt, diện tích không khí, nước phải đủ lớn để thu được kết quả phân tích có ý nghĩa

• Kích cỡ mẫu lấy tùy theo bản chất mẫu và phương pháp lấy mẫu

• Thông thường, số mẫu lấy được tính bằng (mS 2)

Phương pháp lấy mẫu

• Nguyên tắc: Lấy một thể tích không khí, đếm

số lượng tiểu phân có kích cỡ lớn hơn qui định, ví dụ 0,5 hoặc 5 µm Báo cáo kết quả số

• Dụng cụ: Thiết bị đếm tiểu phân

Phương pháp lấy mẫu

 Xác định số lượng tiểu phân vi sinh trong không khí:

 Phương pháp thụ động: đặt hộp

• Nguyên tắc: Là phương pháp đặt hộp Petri có chứa môi

trường dinh dưỡng thích hợp tại vị trí cần lấy mẫu

• Cho lớp môi trường dinh dưỡng trong hộp Petri được tiếp xúc với không khí trong thời gian nhất định, thường là 4 giờ cho hộp đường kính 90 mm

• Vi sinh vật nếu có trong không khí sẽ rơi vào môi trường

Phương pháp lấy mẫu

 Xác định số lượng tiểu phân vi sinh trong không khí:

 Phương pháp thụ động: đặt hộp

• Kết quả thu được sẽ được biểu diễn bằng số lượng vi sinh vật đếm được trên diện tích trong thời gian lấy mẫu

• Phương pháp mang tính định tính

Phương pháp lấy mẫu

 Xác định số lượng tiểu phân vi sinh trong không khí:

 Phương pháp chủ động: Dùng thiết bị lấy mẫu

• Nguyên tắc: Thiết bị lấy một thể tích không khí xác định

thổi lên bề mặt môi trường dinh dưỡng phù hợp Thường thể tích không khí là 1 m3 cho mỗi khu vực sạch và tối thiểu là

280 lít tại mỗi vị trí lấy mẫu Kết quả sẽ được tính toán và qui về lượng cfu trong một thể tích không khí

Phương pháp lấy mẫu

 Xác định số lượng tiểu phân vi sinh trong không khí:

 Phương pháp chủ động: Dùng thiết bị lấy mẫu

Phương pháp lấy mẫu

 Xác định số lượng tiểu phân vi sinh trong không khí:

 Phương pháp chủ động: Dùng thiết bị lấy mẫu

Phương pháp lấy mẫu

 Xác định số lượng tiểu phân vi sinh bề mặt: Tường, sàn nhà,

trang thiết bị, tay và trang phục của kiểm nghiệm viên/người vận hành

 Để chọn lựa phương pháp thích hợp, cần chú ý những đặc điểm sau:

 Loại vi sinh vật và số lượng dự kiến của chúng tại vị trí lấy mẫu.

 Đặc điểm hình học của vị trí cần lấy mẫu: phẳng hay cong, nhẵn hay sần sùi.

Phương pháp lấy mẫu

 Xác định số lượng tiểu phân vi sinh bề mặt

 Các phương pháp lấy mẫu vi sinh bề mặt:

• Phương pháp hộp tiếp xúc

• Phương pháp swab

• Phương pháp rửa/ngâm

• Phương pháp lấy mẫu găng tay

 Mỗi phương pháp đều có ưu nhược điểm riêng và chỉ thích hợp với một hay vài loại bề mặt nhất định, do đó trước khi lấy mẫu

Phương pháp lấy mẫu

 Xác định số lượng tiểu phân vi sinh bề mặt

• Phương pháp hộp tiếp xúc

 Dụng cụ lấy mẫu: hộp RODAC ∅ = 55 – 60 mm

 Ép hộp petri RODAC chứa môi trường rắn thích hợp lên bề mặt cần kiểm tra để lấy đi các vi sinh vật khu trú trên đó

 Đậy nắp hộp, đem ủ và đếm trực tiếp

 Tiệt trùng bề mặt đã lấy mẫu bằng cồn 70%

Biểu diễn kết quả: CFU/hộp hay CFU/cm2 (bằng cách chia tổng số vi sinh vật đếm được cho 25)

Phương pháp lấy mẫu

 Xác định số lượng tiểu phân vi sinh bề mặt

Phương pháp lấy mẫu

 Xác định số lượng tiểu phân vi sinh bề mặt

 Phương pháp hộp tiếp xúc

Phương pháp lấy mẫu

 Xác định số lượng tiểu phân vi sinh bề mặt

 Phương pháp swab

 Làm ẩm swab với dung dịch pha loãng vô trùng.

 Quét swab lên một diện tích chính xác của bề mặt cần lấy mẫu (24 – 30 cm2) Có thể dùng template.

 Lắc kỹ hay siêu âm swab với một thể tích chính xác dung dịch pha loãng.

Phương pháp lấy mẫu

 Xác định số lượng tiểu phân vi sinh bề mặt

Phương pháp lấy mẫu

 Xác định số lượng tiểu phân vi sinh bề mặt

 Phương pháp swab

 có thể lấy mẫu các bề mặt không phẳng, như bề mặt các thiết

bị, các vị trí khó với đến (các khe hay góc, ) cũng đồng thời

là những vị trí khó vệ sinh nhất.

 Nhược điểm:

 Kém chính xác, do đó không thích hợp với các bề mặt có mức nhiễm khuẩn thấp.

Phương pháp lấy mẫu

 Xác định số lượng tiểu phân vi sinh bề mặt

 Phương pháp rửa/ngâm

 Phương pháp này thường được áp dụng để lấy mẫu các chai,

lọ nhỏ, thùng chứa, vật đựng hoặc bộ phận rời của thiết bị

Đồ vật cần lấy mẫu sẽ được ngâm hoặc rửa với một thể tích xác định dung dịch rửa vô trùng Dịch thu được đem xác

định số vi sinh vật nhiễm bằng phương pháp pha loãng hoặc màng lọc

Các dung dịch rửa và pha loãng thường được sử dụng trong phương pháp lấy mẫu bề mặt

Phương pháp lấy mẫu

găng tay tiến hành vào cuối phiên làm việc, trước khi rửa tay Phải đảm bảo găng tay khô và không có vết chất sát trùng Khi lấy mẫu, ép nhẹ mỗi đầu của ngón tay lên bề mặt môi trường dinh dưỡng vô

trùng và giữ trong 10 giây Ủ hộp petri lấy mẫu Kết

Phương pháp lấy mẫu

 Xác định số lượng tiểu phân vi sinh bề mặt

 Phương pháp lấy mẫu găng tay:

Kiểm soát chất lượng nước

 Phân loại nước và mục đích sử dụng

Kiểm soát chất lượng nước

 Tần suất lấy mẫu kiểm tra chất lượng nước

Phương pháp lấy mẫu nước kiểm tra vi sinh

1. Mở van hết mức và cho nước chảy trong 2-3 phút

để làm sạch đường ống

2. Tiệt trùng vòi bằng dung dịch Natri hypochlorite

(100 mg NaOCl/l) nếu nghi ngờ vòi nước không sạch và cho nước chảy tiếp 3 phút cho hết chất sát khuẩn mới lấy mẫu

3. Vặn nhỏ vòi nước để lấy mẫu nước sao cho nước

không chảy ra ngoài

Phương pháp lấy mẫu nước kiểm tra vi sinh

4. Sử dụng chai dung tích 500 ml để lấy mẫu Chai đựng mẫu

nước phải được xử lý vệ sinh, tráng bằng WFI và tiệt trùng Chỉ mở nắp chai ngay trước khi lấy mẫu nước Khi chai đã

mở nắp, tránh không chạm vào mặt trong của nắp và cổ

chai Thể tích mẫu lấy khoảng 100-300 ml

5. Hứng nước sao cho lớp nước cách miệng chai khoảng 2,5

cm

Đậy nhanh nắp chai và ghi các thông tin cần thiết như ngày,

Phương pháp xử lý và phân tích mẫu

1. Mẫu sau khi lấy cần phải tiến hành phân tích càng sớm càng

tốt Trong trường hợp không thể tiến hành phân tích trong vòng 1 giờ sau khi lấy mẫu thì phải bảo quản mẫu ở nhiệt độ

<100C nhưng không được quá 24 giờ

2. Cần ghi lại nhiệt độ và thời gian bảo quản mẫu khi chờ phân

tích

3. Phân tích mẫu theo hướng dẫn của dược điển Việt nam IV,

phụ lục 10.7 Thử giới hạn nhiễm khuẩn

Kiểm soát chất lượng nước

 Vị trí lấy mẫu và các giới hạn vi sinh

Môi trường dinh dưỡng sử dụng trong kiểm soát chất lượng môi trường

 Thông thường, cách pha chế, công thức, bảo quản môi trường trước và sau khi pha chế theo hướng dẫn của nhà sản xuất

 Trong một số trường hợp, bề mặt cần lấy mẫu có thể còn vết của chất tẩy rửa hay chất sát trùng thì cần bổ sung vào môi

trường dinh dưỡng hay môi trường pha loãng một hay vài chất trung hòa

 Phải tiến hành song song một mẫu kiểm tra để loại bỏ khả

năng kháng vi sinh vật của chất sát trùng, tẩy uế tồn dư trong

Môi trường dinh dưỡng sử dụng trong kiểm soát chất lượng môi trường

Một số chất trung hòa và nồng độ

Thiết lập giới hạn cảnh báo, giới hạn hành động

 Khái niệm

 Giới hạn cảnh báo: Là giới hạn vi sinh vật cao hơn giới hạn

căn bản (điều kiện hoạt động bình thường) nhưng chưa cần tiến hành các hành động khả sát và khắc phục

 Giới hạn hành động: Là giới hạn vi sinh vật vượt đáng kể

so với giới hạn cảnh báo Giới hạn hành động yêu cầu phải

có hành động khảo sát và khắc phục

 Giới hạn cảnh báo thấp hơn giới hạn hành động

Thiết lập giới hạn cảnh báo, giới hạn hành động

 Giới hạn cảnh báo và giới hạn hành động được thiết lập từ những số liệu thu được từ chương trình giám sát chất lượng môi trường

 Đối với những tiện ích mới, giới hạn này được thiết lập theo kinh nghiệm của những cơ sở đã sử dụng những tiện ích

tương tự

 Để thiết lập giới hạn cảnh báo và giới hạn hành động, trước hết, phải thiết lập mức căn bản

Thiết lập giới hạn cảnh báo, giới hạn hành động

 Thiết lập mức căn bản

1. Vệ sinh và tẩy uế tất cả các khu vực cần giám sát

2. Tiến hành lấy mẫu tại các vị trí đã chọn trong khu vực, cả trong điều kiện tĩnh và động, mỗi ngày một lần trong 1-2 tuần Sau đó, tiếp tục lấy mẫu 1 lần/tuần trong 12 tuần Kết quả trung bình cộng tại mỗi vị trí lấy mẫu được xem như mức căn bản

Thiết lập giới hạn cảnh báo, giới hạn hành động

 Thiết lập mức căn bản

 Lấy mẫu trong điều kiện tĩnh: Tiến hành khi các tiện ích và thiết bị đã được lắp đặt nhưng chưa có người vận hành Kết quả giám sát chất lượng môi trường trong điều kiện tĩnh cho phép đánh giá tình trạng của hệ

thống cấp khí, hiệu quả của chương trình vệ sinh.

 Lấy mẫu trong điều kiện động: Tiến hành lấy mẫu trong điều kiện hoạt động bình thường Ngoài việc lấy mẫu không khí và các bề mặt còn phải tiến hành lấy mẫu tay và quần áo người vận hành So sánh kết quả lấy mẫu tĩnh và động cho phép đánh giá được ảnh hưởng của sự có mặt của con người và các hoạt động của họ với chất lượng môi trường.

Thiết lập giới hạn cảnh báo, giới hạn hành động

 Việc tính toán các giới hạn dựa vào yêu cầu cấp độ sạch và tùy thuộc vào phân phối của kết quả kiểm tra Nếu môi trường có yêu cầu cao, trung bình cfu thì việc xác định giới hạn cảnh báo và giới hạn hành động nên tính theo phân phối Poisson, nếu cfu thì có thể tính theo qui luật phân phối bình thường.

 Thông thường, giới hạn cảnh báo là giá trị tại đó hàm phân phối tích lũy là 95% và giới hạn hành động là giá trị tại đó hàm phân phối tích lũy đạt 99%.