Báo cáo thực tập kiểm nghiệm sinh học vi sinh 18shc. Trường đại học Nông Lâm TP. HCM. Khoa khoa học sinh học. Báo cáo thực tập kiểm nghiệm sinh học vi sinh 18shc. Trường đại học Nông Lâm TP. HCM. Khoa khoa học sinh học. Báo cáo thực tập kiểm nghiệm sinh học vi sinh 18shc. Trường đại học Nông Lâm TP. HCM. Khoa khoa học sinh học.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC **************** BÁO CÁO THỰC HÀNH MÔN HỌC: KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM Mã môn học : 211518 Lớp : DH18SHC Nhóm thực : Nhóm Niên khóa : 2018-2022 TP Thủ Đức, 01/2021 i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC **************** BÁO CÁO THỰC HÀNH MÔN HỌC: KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM Hướng dẫn khoa học Nhóm sinh viên thực ThS Trương Phước Thiên Hoàng Huỳnh Đức Anh 18126225 Hồ Hoàng Hải 18126226 Nguyễn Nhật Khang 18126227 Phạm Văn Toàn 18126182 Nguyễn Vương Thanh Trúc 18126233 TP Thủ Đức, 01/2021 ii MỤC LỤC Trang BÀI ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS VÀ E COLI PHẦN COLIFORMS 1.1 Quy trình định lượng Coliforms phương pháp đếm khuẩn lạc – Thực theo tiêu chuẩn quốc gia: TCVN 7924-2:2008 (ISO 16649-2:2001) (Xem tài liệu) 1.1.1 Cách tiến hành thí nghiệm tính kết 1.1.2 Kết trình định lượng Coliforms phương pháp đếm khuẩn lạc 1.2 Quy trình định lượng Coliforms phương pháp MPN – Thực theo tiêu chuẩn quốc gia: TCVN:6846:2007 (ISO 4832:2007) (Xem tài liệu) PHẦN 2: E Coli 1.1 Tóm tắt kiến thức (Xem tài liệu) 1.2 Quy trình định lượng E coli Quy trình định lượng E coli phương pháp đếm khuẩn lạc – Thự theo 1.2.1 tiêu chuẩn quốc gia: TCVN 7924-2:2008 (ISO 16649-2:2001) (Xem tài liệu) 1.3 Cách tiến hành thí nghiệm tính kết 1.4 Quy trình định lượng E coli phương pháp MPN (Xem tài liệu) 1.4.1 Phương pháp Most Probable Number (MPN) (Xem tài liệu) 1.4.2 Quy trình định lượng E coli phương pháp MPN – Thực theo tiêu chuẩn quốc gia: TCVN:6846:2007 (ISO 4832:2007) (Xem tài liệu) 1.4.2.1 Cách tiến hành thí nghiệm tính kết BÀI ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS 11 2.1 Quy trình định lượng Staphylococcus aureus phương pháp MPN 11 2.2 Kết 11 2.3 Kết luận 12 BÀI ĐỊNH TÍNH SALMONELLA 14 iii 3.1 Quy trình định tính Salmonella mẫu gan heo 14 3.2 Kết q trình định tính Salmonella mẫu gan heo 14 3.2.1 Kết sau trình phân lập nhận diện Salmonella hai môi trường XLD (Xylose Lysine Desoxycholate) HE (Hektoen Entric Agar) 14 3.2.2 Kết khẳng định Salmonella mẫu gan heo ba thử nghiệm sinh hóa KIA (Kliger Iron Agar), Indol, Urea VP (Voges-Proskauer) 16 3.3 Kết luận 16 BÀI 4: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ VÀ TỔNG NẤM MEN - NẤM MỐC 17 4.1 Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí 17 4.1.1 Mẫu kiểm định: Sơ dừa 17 4.1.2 Kết 17 4.1.3 Biện luận 17 4.1.4 Kết luận 18 4.2 Định lượng tổng nấm men – nấm mốc 18 4.2.1 Mẫu kiểm định: Ruột long 18 4.2.2 Kết 18 4.2.3 Biện luận 18 4.2.4 Biện luận 19 iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam VRBL Thạch lactoza mật đỏ trung tính tím tinh thể MPN Most Probable Number BGBL Brilliant Green Buke Broth Lactose EC E coli medium SPW Saline Pepton Water BPA Baird Parker Agar KIA Kliger Iron Agar XLD Xylose Lysine Desoxycholate HE Hektoen Entric Agar PCA Plate Agar DRBC Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar v DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 1.1: Khuẩn lạc Coliforms mơi trường VRBL nồng độ 10-1 Hình 1.2 Cấy mẫu pha lỗng 10-2, 10-3, 10-4 vào mơi trường LSB có sinh 11 Hình 1.3 Các ống BGBL sinh nồng độ liên tiếp 10-2,10-3,10-4 12 Hình 1.4 Khuẩn lạc đặc trưng quan sát thấy nồng độ pha loãng 10-1 (trái; A) không quan sát thấy nồng độ 10-2 (phải) 14 Hình 1.5 Cấy mẫu pha lỗng 10-2, 10-3, 10-4 vào mơi trường LSB có sinh 15 Hình 1.6 Cấy chuyển dịch mẫu từ ống LSB sinh (+) sang môi trường canh EC quan sát 16 Hình 1.7 Cấy ria dịch mẫu từ ống (+) canh EC sang môi trường thạch đĩa EMB Chọn khuẩn lạc đường kính lớn mm (trịn, dẹt hình đĩa có ánh kim xanh) Hình 1.8 Kết thử nghiệm IMViC 16 Hình 2.1 Ống nghiệm MSB chứa ml dung dịch mẫu nồng độ 10-1; 10-2; 10-3 lặp lại nồng độ lần 18 Hình 2.2 Ống nghiệm MSB chứa ml dung dịch mẫu nồng độ 10-4; 10-5 lặp lại nồng độ lần 18 Hình 2.3 Cấy ria khuẩn lạc từ ống nghiệm MSB sang đĩa thạch BPA, 48h (a) Nồng độ ống nghiệm 10-2; (b) Nồng độ ống nghiệm 10-3; (c) Nồng độ ống nghiệm 10-4 19 Hình 3.1 Khuẩn lạc đĩa mơi trường XLD sau ủ 37oC 24 21 Hình 3.2 Khuẩn lạc đĩa mơi trường HE sau ủ 37oC 24 (trái (a); phải (b)) 22 Hình 3.3 Kết thử nghiệm sinh hóa Salmonella 23 Hình 4.1 Khuẩn lạc môi trường PCA (a) Nồng độ 10-3; (b) Nồng độ 10-4; (c) Nồng độ 10-5 24 Hình 4.2 Khuẩn lạc mơi trường DRBC (a) Nồng độ 10-1; (b) Nồng độ 10-2; (c) Nồng độ 10-3 25 vi DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Số lượng khuẩn lạc hai nồng độ thu 10 vii BÀI ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS VÀ E COLI PHẦN COLIFORMS 1.1 Quy trình định lượng Coliforms phương pháp đếm khuẩn lạc – Thự theo tiêu chuẩn quốc gia: TCVN 7924-2:2008 (ISO 16649-2:2001) (Xem tài liệu) 1.1.1 Cách tiến hành thí nghiệm tính kết Mẫu phân tích: Nước mía Định lượng Coliforms theo quy trình Chuẩn bị dịch đồng pha lỗng mẫu để có độ pha lỗng 10-1, 10-2, 10-3 Chuyển ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào tâm đĩa petri, nồng độ có lần lặp lại Rót khoảng 15 ml mơi trường VRBL (44 – 47oC) vào đĩa petri Trộn môi trường với dịch cấy, để hỗ hợp đông đặc Đồng thời chuẩn bị đĩa chứa 15 ml môi trường (không có dịch cấy để kiểm tra vơ trùng mơi trường) Rót khoảng ml mơi trường VRBL (44 – 47oC) lên bề mặt môi trường cấy Để cho đông đặc đem ủ 30°C 37°C, 24 Chọn đĩa petri có số lượng khuẩn lạc từ 10 – 150, đếm khuẩn lạc điển hình có màu đỏ tía có đường kính 0,5 mm trở lên (đơi có vùng mật tủa đỏ bao quanh) Coliform Xác định mật số Coliforms Nếu có khuẩn lạc có hình thái khơng điển hình đếm chọn khuẩn lạc cấy vào ống nghiệm chứa môi trường canh thang mật lactoza lục sáng để khẳng định Ủ ống nghiệm tủ 30°C 37°C 24 h ± h Các ống Durham cho thấy có sinh khí coi có chứa Coliforms 1.1.2 Kết trình định lượng Coliforms phương pháp đếm khuẩn lạc Để kết có giá trị, thường cần đếm khuẩn lạc đĩa có chứa 10 khuẩn lạc (tổng số khuẩn lạc, khuẩn lạc điển hình khuẩn lạc phù hợp với tiêu chí xác định) Tính số lượng N vi sinh vật có mẫu thử theo trung bình khối lượng từ hai độ pha lỗng liên tiếp cách sử dụng công thức: N= 𝐶 𝑉×1,1×𝑑 Trong đó: ∑C tổng số khuẩn lạc đếm hai đĩa giữ lại từ hai độ pha lỗng liên tiếp, đĩa chứa tối thiểu 10 khuẩn lạc V thể tích chất cấy đưa vào đĩa, tính mililit (ml) d độ pha loãng tương ứng với dung dịch pha loãng giữ lại (d = sản phẩm dạng lỏng chưa pha loãng (mẫu thử) giữ lại) Sau nuôi cấy môi trường VRBL, chọn đĩa có mẫu nồng độ 10-1,10-2 đếm khuẩn lạc kết sau: Hình 1.1: Khuẩn lạc Coliforms môi trường VRBL nồng độ 10-1 Bảng 1.1 Số lượng khuẩn lạc hai nồng độ thu Nồng độ Số khuẩn lạc 10-1 25 10-2 15 Ta có: N= 25+15 × 1.1×10−1 = 2,19 × 102 (CFU/g) Kết luận Vậy mẫu nước mía có 2,19×102 Coliforms có ml nước mía 1.2 Quy trình định lượng Coliforms phương pháp MPN – Thực theo tiêu chuẩn quốc gia: TCVN:6846:2007 (ISO 4832:2007) (Xem tài liệu) Cách tiến hành thí nghiệm Mẫu phân tích: Nước mía Chuẩn bị dịch đồng pha lỗng mẫu để có độ pha lỗng 10-1, 10-2, 10-3 Chuyển ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10 ml canh LSB, nồng độ có ống lặp lại, ủ 37oC, 48 Ghi nhận ống LSB (+) (sinh hơi) nồng độ pha lỗng Hình 1.3 Các ống BGBL sinh nồng độ liên tiếp 10-2,10-3,10-4 Kết luận Sự xuất kiện ống nghiệm sinh cho ta thấy mẫu có chứa nhóm vi sinh vật Coliforms nhóm vi khuẩn Coliforms có khả lên men lactose có mơi trường BGBL sinh acid sinh 37°C 24 - 48 Sau ủ ống canh BGBL có chứa dịch mẫu ta nhận thấy tất ống nghiệm sinh hơi, cho thấy mật độ vi sinh vật cao, ta phải tiếp tục pha lỗng nồng độ cao xuất ống nghiệm khơng sinh kết xác PHẦN 2: E Coli 1.1 Tóm tắt kiến thức (Xem tài liệu) 1.2 Quy trình định lượng E coli 1.2.1 Quy trình định lượng E coli phương pháp đếm khuẩn lạc – Thự theo tiêu chuẩn quốc gia: TCVN 7924-2:2008 (ISO 16649-2:2001) (Xem tài liệu) 1.3 Cách tiến hành thí nghiệm tính kết Mẫu phân tích: Nước mía Bước 1: Pha mơi trường Bước 2: Khử trùng dụng cụ môi trường pha Bao gói dụng cụ phân phối mơi trường vào dụng cụ, gắn nút bao gói Hấp tiệt trùng 121oC 15 phút Bước 3: Định lượng E coli theo quy trình Bước 4: Tính kết Để có kết đúng, cần đếm CFU điển hình đĩa chứa 15 CFU màu xanh điển hình Tính N, số lượng CFU E coli dương tính β-glucuronidase có mặt mẫu thử mililit gam sản phẩm từ hai độ pha lỗng liên tiếp, sử dụng cơng thức: 𝑁= ∑𝑎 𝑉 ∗ (𝑛1 + 0,1𝑛2) ∗ 𝑑 Trong đó: ∑𝑎 : tổng số khuẩn lạc đếm tất đĩa giữ lại sau hai độ pha lỗng liên tiếp có đĩa chứa 15 CFU màu xanh; N1: số đĩa giữ lại độ pha lỗng thứ nhất; V: Thể tích dịch cấy dùng đĩa, tính mililit; N2: số đĩa giữ lại độ pha loãng thứ hai D: hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ giữ lại (d = trường hợp mẫu dạng lỏng cấy trực tiếp) Kết quả: Số lượng khuẩn lạc đặc trưng E coli quan sát thấy hai nồng độ liên tục q ( x 105 CFU/g theo tiêu chuẩn Bộ y tế nên khơng an tồn cho việc sử dụng 4.2 Định lượng tổng nấm men – nấm mốc 4.2.1 Mẫu kiểm định: Ruột long 4.2.2 Kết a) b) c) Hình 4.2 Khuẩn lạc mơi trường DRBC (a) Nồng độ 10-1; (b) Nồng độ 10-2; (c) Nồng độ 10-3 4.2.3 Biện luận Quan sát đếm số khuẩn lạc môi trường DRBC Ở nồng độ 10-1, số lượng khuẩn lạc đĩa số 33 đĩa số hai 28 Ở nồng độ 10-2, số lượng khuẩn lạc đĩa số 16 đĩa số hai Ở nồng độ 10-3, số lượng khuẩn lạc đĩa số đĩa số hai không xuất khuẩn lạc Có thể q trình đếm Mật độ tổng nấm men – nấm mốc tính sau: 𝐴= 𝑁 𝑛1 × 𝑉 × 𝑓1 + … + 𝑛𝑖 × 𝑉 × 𝑓𝑖 18 Trong đó: A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn (hay nấm mốc, nấm men) 1g hay 1mL mẫu (CFU/g CFU/mL) N: tổng số khuẩn lạc đếm đĩa chọn ni: số lượng đĩa cấy độ pha lỗng thứ i V: thể tích dịch mẫu (mL) cấy vào đĩa fi: độ pha loãng tương ứng Ta có: 𝐴 = 33+28+16+7+3+0 2×10−1 ×10−1 +2×10−1 ×10−2 +2×10−1 ×10−3 = 3,91×103 (CFU/g) 4.2.4 Biện luận Với kết tính với tiêu tổng số nấm men – nấm mốc mẫu ruột long 3,91 x 103 CFU/g > 102 CFU/g theo tiêu chuẩn Bộ y tế nên khơng an tồn cho việc sử dụng 19