Báo cáo thực tập trong phòng thí nghiệm (NLU)

Báo cáo thực tập trong phòng thí nghiệm (NLU)Báo cáo thực tập trong phòng thí nghiệm (NLU)Báo cáo thực tập trong phòng thí nghiệm (NLU)Báo cáo thực tập trong phòng thí nghiệm (NLU)Báo cáo thực tập trong phòng thí nghiệm (NLU)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC  BÁO CÁO THỰC TẬP NGHIÊN CỨU TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM Đề tài: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA CHỦNG NẤM TRICHODERMA SP VỚI NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT FUSARIUM SP GVHD: Lê Thị Diệu Trang Mã học phần: 211912 Danh sách nhóm: Hồ Trần Thị Bảo Trân 20126385 DH20SHB Nguyễn Thị Kim Phụng 20126340 DH20SHB Phùng Thị Mỹ Linh 20126290 DH20SHB Huỳnh Công Chiến 20126197 DH20SHB Lê Quang Lĩnh 20126293 DH20SHD Phan Tấn Lộc 20126294 DH20SHA Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2022 DANH SÁCH NHÓM THAM GIA BÀI BÁO CÁO HỌC KÌ 2, NĂM HỌC: 2022 - 2023 Đề tài: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA CHỦNG NẤM TRICHODERMA SP VỚI NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT FUSARIUM SP Tỉ lệ % hoàn STT Họ tên MSSV thành Hồ Trần Thị Bảo Trân 20126385 100% Nguyễn Thị Kim Phụng 20126340 100% Phùng Thị Mỹ Linh 20126290 100% Huỳnh Công Chiến 20126197 100% Lê Quang Lĩnh 20126293 100% Phan Tấn Lộc 20126294 100% Nhận xét giáo viên: Ký tên MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nấm Trichoderma .4 2.2 Nấm Fusarium 2.3 Môi trường PDA VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu .7 3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Mục đích nghiên cứu .7 3.3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.3.3 Bố trí thí nghiệm 3.3.4 Các bước tiến hành KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết thí nghiệm .8 4.1.1 Hình ảnh quan sát thí nghiệm .8 4.1.2 Số liệu thô .11 4.1.3 Số liệu sau tính tốn .12 4.2 Thảo luận 15 4.3 Đề xuất 15 ĐẶT VẤN ĐỀ Nấm Trichoderma sp loại nấm đối kháng có khả kiểm sốt hầu hết loài nấm gây bệnh khác trồng Chúng kiểm sốt ngăn ngừa loại nấm gây hại, kích thích tăng trưởng phục hồi rễ cho trồng, cải tạo đất tăng mật độ vi sinh vật có lợi cho đất, Trên sở đó, để ứng dụng chủng vi sinh vật kiểm sốt bệnh đối tượng trồng khác việc khảo sát khả đối kháng chủng nấm Trichoderma sp với nấm gây bệnh thực vật phương pháp tốt Vì nấm Trichoderma sp kiểm sốt tất loài nấm gây bệnh nấm Fusarium sp (gây bệnh thối rễ cam quýt, bệnh vàng chết chậm tiêu) cách chúng tiết enzyme endochitinase làm tan vách tế bào nấm, sau công vào bên trong, ký sinh, lấy chất dinh dưỡng tiêu thụ chúng Sự kết hợp cho phép bảo vệ vùng rễ trồng chống lại loại nấm gây thối rễ đồng ruộng Ngoài ra, chúng cịn có khả phân hủy cellulose, phân giải lân chậm tan phương pháp trộn Trichoderma vào trình sản xuất phân hữu vi sinh để thúc đẩy trình phân hủy hữu nhanh chóng Vì vậy, khảo sát khả đối kháng chủng nấm Trichoderma sp với nấm gây bệnh thực vật Fusarium sp nhằm kiểm soát, tiêu diệt nấm bệnh gây hại phương pháp mang đến nhiều hiệu không tác động đến môi trường TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nấm Trichoderma Nấm Trichoderma loại nấm sống vùng rễ chế thành sản phẩm vi sinh, có đặc tính sinh sản vơ tính đính bào tử Conidia Nấm Trichoderma thuộc giới Fungi, ngành Ascomycota, lớp Euascomycetes, Hypocreales, họ Hypoceaceae, giống Trichoderma Chúng thuộc nhóm nấm Deuteromycetes (nhóm nấm bất toàn – Fungi imperfecti) gồm khoảng 33 loài: 20 loài Pachybasium, 10 loài Longibrachiatum, loài Trichoderma Saturnisporum lồi Hypocreanum Nấm tồn điều kiện lý tưởng khoảng năm rưỡi bị tiêu diệt ánh nắng gắt mưa lâu Nhiệt độ phù hợp cho chúng sinh trưởng khoảng 25 – 30oC Hình 2.1 Nấm đối kháng Trichoderma sp Một vài ứng dụng bật nấm Trichoderma như: • Ngăn ngừa tốt bệnh thối rễ, lở cổ rễ, thối thân, … cho tất loại trồng • Hiệu cao việc phòng ngừa loại bệnh tuyến trùng hại rễ • Tăng cường vi sinh vật có ích giảm thiểu vi sinh vật gây hại nấm: Rhizoctonia, Fusarium, Phytophtora, … • Ngồi ra, Trichoderma tiết nhiều enzyme cellulase, chitinase, … có khả phân hủy nhanh chất xơ thành chất hữu cung cấp dinh dưỡng tăng cường đề kháng cho trồng Ngoài ra, số nghiên cứu cho thấy nấm Trichoderma sp có khả tiêu diệt nấm Fusarium (gây bệnh thối rễ cam quýt, bệnh vàng chết chậm tiêu) hay số loại nấm gây bệnh khác Sclerotium rolfsii, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, … 2.2 Nấm Fusarium Nấm Fusarium tên loài nấm sợi thuộc phức hợp gồm 26 lồi có mối liên hệ với Chúng lồi sinh sản vơ tính thường biết đến loài sinh sống đất loài thực vật mở đường Nấm Fusarium thuộc giới Fungi, ngành Ascomycota, lớp Ascomycetes, Hypocreales, họ Nectriaceae, chi Fusarium loài Solani Chúng sinh sống khu vực nhiệt đới, cận nhiệt đới nơi có khí hậu ơn hịa khơng sinh sống vùng núi cao Nấm Fusarium có khả gây bệnh cho trồng người Đặc biệt, chúng nhạy cảm loại thuốc diệt nấm đất tìm thấy ao, sơng, hệ thống cống rãnh ống dẫn nước Vì vậy, muốn tiêu diệt nấm Fusarium gây bệnh giống trồng sử dụng chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma tác động vào giúp loại bỏ chất gây bệnh làm tăng sinh trưởng Hình 2.2 Nấm Fusarium sp gây bệnh thực vật 2.3 Môi trường PDA Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) môi trường nuôi cấy vi sinh vật phổ biến tạo từ bột khoai tây đường dextrose PDA môi trường nuôi cấy sử dụng rộng rãi để phát triển ni cấy nấm vi khuẩn Bên cạnh đó, PDA bổ sung với acid kháng sinh khác Chloramphenicol, Tartaric Acid Chlortetracycline để ức chế phát triển vi khuẩn gây trở ngại cho nấm men nấm mốc Potato Dextrose Agar (PDA) chứa dextrose nguồn carbonhydrate cho trình tăng trưởng, dịch khoai tây cung cấp nguồn dinh dưỡng cho phát triển hầu hết loại nắm Thạch tác nhân làm đặc môi trường Một số ứng dụng môi trường PDA: • PDA sử dụng để phát nấm men nấm mốc sản phẩm sữa thực phẩm chế biến sẵn • Mơi trường PDA sử dụng để ni cấy nấm men nấm mốc từ mẫu bệnh phẩm (mẫu da) Chare • PDA với TA (Tartaric Acid) khuyến nghị dùng để kiểm tra vi sinh vật thực phẩm sản phẩm từ sữa • PDA với Chlortetracycline khuyên dùng để kiểm tra vi sinh vật tổng số nấm men nấm mốc từ sản phẩm mỹ phẩm • PDA với Chloramphenicol khuyến cáo để nuôi cấy chọn lọc nấm từ mẫu hỗn hợp VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu - Thời gian: Vào lúc 8h00 sáng thứ 4, ngày 26/05/2022 - Địa điểm: Tại phịng BIO305, tịa nhà A1, Đại học Nơng Lâm TP HCM 3.2 Vật liệu nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Nấm Trichoderma sp - Vật liệu nghiên cứu: • Chủng nấm Trichoderma sp • Chủng nấm gây bệnh thực vật Fusarium sp 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Mục đích nghiên cứu Khảo sát khả đối kháng chủng nấm Trichoderma sp với nấm gây bệnh thực vật Fusarium sp 3.3.2 Phương pháp nghiên cứu Khảo sát khả đối kháng cho chủng nấm Trichoderma sp dựa chủng nấm gây bệnh thực vật Fusarium sp cách nuôi cấy chủng nấm Trichoderma sp nấm Fusarium sp riêng biệt đĩa Petri chứa mơi trường PDA 25oC nhằm đánh giá tính đối kháng chủng Trichoderma sp với nấm bệnh dựa vào phần trăm ức chế theo công thức: (C – T)/C * 100 với C bán kính khuẩn lạc nấm bệnh nghiệm thức đối chứng; T bán kính khuẩn lạc nấm bệnh ni với Trichoderma sp 3.3.3 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm tiến hành theo phương pháp đồng nuôi cấy gồm nghiệm thức (1 chủng nấm Trichoderma sp nghiệm thức đối chứng), nghiệm thức lặp lại lần, lần lặp lại đĩa Petri 3.3.4 Các bước tiến hành Bước 1: Chuẩn bị môi trường PDA, nấm Trichoderma nấm Fusarium Bước 2: Đổ môi trường PDA vào đĩa Petri vừa chạm thành đĩa chờ khoảng 10 – 15 phút Bước 3: Sử dụng que cấy thẳng lấy lượng bào tử vừa đủ nấm Trichoderma sp chuyển sang đĩa Petri, lấy lượng bào tử từ nấm Fusarium sp cấy vào phía đối diện cho đối xứng qua đường kính đĩa hai cách mép đĩa cm lặp lại bước cấy cho đĩa lại Đĩa Petri số (đối chứng) cấy loại nấm gây bệnh Fusarium sp Bước 4: Sau đó, ni cấy đĩa Petri 25oC Bước 5: Quan sát đo bán kính chuẩn lạc nấm bệnh nghiệm thức vào ngày 4, 5, sau cấy KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết thí nghiệm 4.1.1 Hình ảnh quan sát thí nghiệm Ngày Ngày Đĩa Đĩa Đĩa Ngày Đĩa đối chứng Đĩa đối chứng Đĩa đối chứng Hình 4.1 Hình ảnh đĩa Petri thu sau nuôi cấy 25oC vào ngày 4, 5, - Giải thích hình ảnh sau thu được: • Nguyên nhân đĩa Petri số cấy không thành công nấm gây bệnh Fusarium sp Nguyên nhân xuất phát từ sai sót q trình thao tác (Khi khử trùng đầu que cấy lửa đèn cồn không để nguội mà trực tiếp lấy bào tử nấm để cấy dẫn 10 đến chết bào tử nấm) lượng bào tử nấm gây bệnh Fusarium sp mang cấy q làm cho q trình phát triển bị bào tử nấm Trichoderma sp lấn át dẫn đến nghèo nguồn dinh dưỡng làm cho bào tử chậm tăng sinh chết • Nguyên nhân gây phơi nhiễm mẫu cấy Do người thao tác khử trùng tay tuyệt đối trước đưa tay vào tủ cấy, thao tác cấy có sai sót (khơng khử trùng đủ que cấy, thành đĩa Petri môi trường định cấy thành đĩa Petri nấm chuẩn bị để cấy) Trong thao tác cách xa lửa đèn cồn, người thao tác đưa tay khỏi tủ cấy q trình cấy, khơng vệ sinh tủ cấy liên tục thao tác bị nhiễm khuẩn đổi người thao tác liên tục nguyên nhân dễ làm cho mẫu bị phơi nhiễm 4.1.2 Số liệu thơ Bảng 4.1.2a Bảng số liệu đường kính (mm) nấm nghiệm thức Fusarium nuôi với nấm Tricoderma Lần lặp lại Thời gian ngày 24 24 23 16 14 14 0 13.33 12.67 12.33 Giá trị trung bình lần lặp lại Bảng 4.1.2b Bảng số liệu đường kính (mm) nấm nghiệm thức đối chứng Fusarium Lần lặp lại Thời gian ngày 30 35 42 22 30 34 20 20 20 24 28.33 32 Giá trị trung bình lần lặp lại 11 Biểu đồ đường kính (mm) nấm Fusarium cấy chung với Trichoderma cấy riêng (đối chứng) 35 30 25 20 15 10 Sau ngày Sau ngày Sau ngày Đối chứng Fusarium sp 4.1.3 Số liệu sau tính tốn Đánh giá tính đối kháng chủng Trichoderma sp với nấm bệnh dựa vào phần trăm ức chế theo cơng thức: (C - T)/C *100 Trong đó: C: bán kính khuẩn lạc nấm bệnh nghiệm thức đối chứng T: bán kính khuẩn lạc nấm bệnh nuôi với Trichoderma sp T1, T2, T3: số lần lặp lại nấm bệnh nuôi với Trichoderma sp C1, C2, C3: số lần lặp lại nấm bệnh nghiệm thức đối chứng Bảng 4.1.3a Bảng số liệu bán kính (mm) nấm nghiệm thức Lần lặp T1 T2 T3 C1 C2 C3 C/T - Sau ngày 12 15 11 10 C/T - Sau ngày 12 17.5 15 10 C/T - Sau ngày 11.5 21 17 10 nghiệm thức 12 Bảng 4.1.3b Bảng tính phần trăm ức chế chủng Trichoderma sp với nấm bệnh C\T - Sau T1 ngày C1 C2 C3 15 − 15 − 15 15 15 ×100 = 20 C3 11 − 11 11 11 C3 ×100 = 300/11 ×100 = 100 10 − 12 10 − 10 − 10 10 10 ×100 = -20 ×100 = 20 T1 17.5 − 12 17.5 ×100 = 220/7 15− 12 15 10− 12 10 ×100 = 20 ×100 = -20 21 − 11.5 21 17 − 11.5 17 ×100 = 950/21 ×100 = 550/17 10 − 11.5 10 ×100 = -15 ×100 = 100 T2 T3 17.5 − 17.5 − 17.5 17.5 ×100 = 60 ×100 = 100 15 − 15 − 15 15 ×100 = 160/3 10 − 10− 10 10 ×100 = 30 T1 ngày C2 ×100 = 100 11 − ×100 = -100/11 C\T - Sau C1 ×100 = 140/3 11 − 12 ngày C2 T3 15 − 12 C\T - Sau C1 T2 ×100 = 100 ×100 = 100 T2 T3 21 − 21 − 21 21 ×100 = 200/3 ×100 = 100 17 − 17 − 17 17 ×100 = 1000/17 ×100 = 100 10 − 10 − 10 10 13 ×100 = 30 ×100 = 100 Bảng 4.1.3c Bảng phần trăm ức chế nghiệm thức chủng Trichoderma với nấm bệnh Lần lặp Phần trăm ức Trung bình Độ lệch (sd) Bình phương độ lại chế (1) (2) (1) - (2) lệch (𝒔𝒅)𝟐 32.22 72.5 -40.28 1622.48 57.77 72.5 -14.73 216.97 100 72.5 27.5 756.25 Tổng bình phương độ lệch 2595.7 Tính giá trị phương sai Variance: Phương sai = Tổng bình phương độ lệch/(N-1) = 2595.7/(3-1) = 1297.85 Độ lệch chuẩn SD = (𝑝ℎươ𝑛𝑔 𝑠𝑎𝑖)1/2 = (1297.85)1/2 = 36.03 Lần lặp Phần trăm ức Trung bình Độ lệch (sd) Bình phương độ lại chế (1) (2) (1) - (2) lệch (𝒔𝒅)𝟐 43.26 63.25 -19.99 399.6 46.48 63.25 -16.77 281.23 100 63.25 36.75 1350.56 Tổng bình phương độ lệch 2031.39 Tính giá trị phương sai Variance: Phương sai = Tổng bình phương độ lệch/(N-1) = 2031.39/(3-1) = 1015.7 Độ lệch chuẩn SD = (𝑝ℎươ𝑛𝑔 𝑠𝑎𝑖)1/2 = (1015.7)1/2 = 31.87 Lần lặp Phần trăm ức Trung bình Độ lệch (sd) Bình phương độ lại chế (1) (2) (1) - (2) lệch (𝒔𝒅)𝟐 -18.33 36.11 -54.44 2963.71 26.67 36.11 -9.44 89.11 100 36.11 63.89 4081.93 Tổng bình phương độ lệch 14 7134.75 Tính giá trị phương sai Variance: Phương sai = Tổng bình phương độ lệch/N-1 = 7134.75/(3-1) = 3567.38 Độ lệch chuẩn SD = (𝑝ℎươ𝑛𝑔 𝑠𝑎𝑖)1/2 = (3567.38)1/2 = 59.73 4.2 Thảo luận Nấm Trichoderma mang màu xanh đậm có vịng trắng bao phủ bên ngồi ngày thứ vòng màu trắng dần bị vào ngày sau Nấm Fusarium có màu trắng, lớn dần kích thước, khơng đổi màu sắc Đĩa đĩa 2: Nấm Trichoderma có kích thước lớn nhiều so với nấm Fusarium Sau ngày cho thấy bán kính Fusarium giảm bị ức chế nấm Trichoderma Đĩa đĩa 4: Khơng có phát triển nấm Fusarium Ta thấy phát triển nấm Trichoderma, bán kính tăng khơng có xu hướng giảm Vì vậy, nuôi cấy hai nấm Trichoderma Fusarium môi trường, vị trí gần cho thấy cạnh tranh dinh dưỡng, nấm Fusarium bị giảm bán kính cịn nấm Trichoderma tăng bán kính, tức Fusarium có xu hướng giảm sinh trưởng sau nhiều ngày nuôi nấm Trichoderma Điều cho thấy sức cạnh tranh dinh dưỡng nấm gây bệnh Fusarium không nấm đối kháng Trichoderma 4.3 Đề xuất Nấm Trichoderma loại nấm đối kháng có khả kiểm sốt tất loại nấm gây bệnh khác, giết nhiều loại nấm gây thối rễ chủ yếu như: Pythium, Rhizoctonia Fusarium, Ngồi ra, tiết đất chất kích thích để rễ ăn sâu xuống lòng đất, làm cho rễ khỏe tăng khả hút dinh dưỡng, tăng khả phòng vệ, tạo thành lớp măng - xông bảo vệ vùng rễ tránh xâm nhập mầm bệnh loại nấm bệnh Bên cạnh khảo sát thêm khả đối kháng nấm Trichoderma với nấm gây bệnh Pythium đem so sánh với phương pháp khảo sát nấm gây bệnh thực vật Fusarium để đánh giá phương pháp có hiệu tốt mang đem đến nhiều lợi ích Vì vậy, việc nghiên cứu sâu loại nấm Trichoderma có ích việc sản xuất chất kiểm soát sinh học cách hiệu có ích ngành nơng nghiệp 15