Báo cáo thực tập vi sinh thí nghiệm 1 phát hiện vi sinh vật dựa trên môi trường chọn lọc

BÁO CÁO THỰC TẬP VI SINH Giảng viên: TS.Lê Mai Hương Xn Nhóm Lớp: Thành viên: Dỗn Ngọc Yến Nhi_21180080 Âu Ngọc Yến Nhi_21180079 Nguyễn Vu Kim Ngân_21180068 THÍ NGHIỆM 1: PHÁT HIỆN VI SINH VẬT DỰA TRÊN MÔI TRƯỜNG CHỌN LỌC Giới thiệu: Về nguyên tắc chia thành ba nhóm là:  Phát dựa kiểu hình: mơi trường dinh dưỡng đặc lỏng điều kiện nuôi cấy phù hợp phát vi sinh vật cần tìm qua tăng trưởng ưu chúng so với loài khác dựa vào đặc tính dễ thấy tạo sắc tố, khả sử dụng chất đặc biệt, khả đề kháng với vài kháng sinh hay kim loại nặng  Phát dựa tính miễn dịch: phương pháp miễn dịch với chất phát huỳnh quang phát vi sinh vật có mẫu tự nhiên (nước, bề mặt rễ, nốt sần, đất) Cho phép phát vi khuẩn không thông qua nuôi cấy  Phát dựa DNA: dùng mẫu dò lai phân tử để phát vi sinh vật Cách thực hành: Trải 0,1ml dịch hỗn hợp vi sinh vật que gạt thủy tinh lên hộp petri chứa môi trường cao thịt pepton, môi trường czapek dox, môi trường Hansen, môi trường Gause Gói hộp lại Ủ nhiệt độ 37℃ ngày môi trường cao thịt pepton, nhiệt độ thường môi trường czapek dox môi trường Hansen, 40℃ ngày môi trường Gause Kết quả:  Môi trường PGA: khuẩn lạc to, có sợi khuẩn ty lớn, xù lơng  Mơi trường Hansen: khuẩn lạc có kích thước bình thường, màu vàng nhạt ngà, khô mọc bề mặt lớp thạch  Mơi trường LB: Khuẩn lạc bóng, ướt, trắng vàng ngà, mọc bề mặt lớp thạch  Mơi trường Gause: Khuẩn lạc kích thước nhỏ, khuẩn ty nhỏ, màu trắng đục Nhận xét, đánh giá: Dựa vào đặc điểm quan sát môi trường xác định: Trên mơi trường PGA có diện khuẩn lạc đặc trưng cho nấm mốc Trên mơi trường Hasen có diện khuẩn lạc đặc trưng cho nấm men Trên mơi trường LB có diện khuẩn lạc đặc trưng cho vi khuẩn E.coli Trên mơi trường Gause có diện khuẩn lạc đặc trưng cho xạ khuẩn Các đĩa petri mơi trường khơng có diện khuẩn lạc lạ → thực thao tác vô trùng Kết luận: Khuẩn lạc môi trường PGA nấm mốc Khuẩn lạc môi trường Hasen nấm men Khuẩn lạc môi trường LB vi khuẩn E.coli Khuẩn lạc môi trường Gause xạ khuẩn THÍ NGHIỆM 2: PHÁT HIỆN VI SINH VẬT DỰA VÀO TIÊU BẢN Giới thiệu: _ Tùy theo kích thước, vi sinh vật quan sát mắt thường (quan sát thô đại) phải cần đến thiết bị đặt biệt kính lúp, kính hiển vi,… (quan sát hiển vi) _ Kính hiển vi cơng cụ quan trọng nghiên cứu hình thái nhận diện vi sinh vật Một số kính hiển vi thường gặp:  Kính hiển vi soi nổi: dạng kính lúp có độ phóng đại thay đổi từ 10 lần đến 60 lần, thường dùng quan sát thao tác vật có kích thước tương đối lớn  Kính hiển vi quang học: hệ thống dùng để phóng đại vi sinh vật kích thước nhỏ Độ phóng đại kính từ vài chục lần đến 2000 lần  Kính hiển vi đối pha: sử dụng để quan sát vi sinh vật sống khơng nhuộm màu  Kính hiển vi huỳnh quang: kính trang bị nguồn ánh sáng kích thích có độ dài sóng khác để kích thích tạo huỳnh quang Phần lớn vi sinh vật khơng có khả phát huỳnh quang có yếu Cách thực hiện: Cho giọt nước lên lam Dùng que cấy lấy sinh khối vi sinh vật hòa vào giọt nước Đậy lamen Đặt tiêu lên kính hiển vi sau quan sát Dùng que cấy lấy sinh khối vi sinh vật Đậy lamen Kết quả: Tiêu nấm men: tế bào dạng hình cầu, bên tế bào có màu vàng, số tế bào có nảy chồi Tiêu nấm mốc: quan sát sợi khuẩn ty lớn, hình ống trụ dài, đầu khuẩn ty có bào tử li ti tạo thành chùm màu xanh Tiêu vi khuẩn E.coli: tế bào hình que, màu trắng đục, có di chuyển Tiêu xạ khuản: có sợi khuẩn ty nhỏ đan xen thành chùm Nhận xét, đánh giá: Các tiêu dễ quan sát, hình ảnh quan sát rõ ràng, tiêu Ở tiêu nấm men tế bào nằm riêng lẽ dễ dàng tìm thấy Tế bào nấm men có kích thước lớn gấp 10 lần so với vi khuẩn E.coli Ở tiêu vi khuẩn E.coli thấy rõ tế bào vi khuẩn có mật độ vi khuẩn nhiều trải bề mặt quan sát Ở hai tiêu xạ khuẩn nấm mốc quan sát sợi khuẩn ty thành chùm Kết luận Vi sinh vật có hình dạng kích thước đa dạng THÍ NGHIỆM 3: PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT -XÁC ĐỊNH MẬT ĐỘ TẾ BÀO BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC Nguyên tắc thí nghiệm Định lượng tế bào vi sinh vật sống diện mẫu, định lượng chọn lọc vi sinh vật tùy môi trường điều kiện nuôi cấy Cách thực a Pha lỗng liên tiếp bậc 10 huyền phù có độ đục khác - Chuẩn bị ống eppendorf vô trùng chứa 0.9ml NaCl 0.85% vô trùng đánh số từ -1 đến -7 \ 10-1 - 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 Hút 0.1ml huyền phù tế bào vào ống -1, đậy nắp, lắc kỹ E.coli - Hút 0.1ml huyền phù tế bào ống -1 cho vào ống -2, thực tương tự để có huyền phù tế bào với độ pha loãng 10-3 đến 10-7 0.1 10-1 0.1 10-2 0.1 10-3 0.1 10-4 0.1 0.1 10-5 10-6 10-7 - - b Tạo hộp trải Hút 0.1ml huyền phù có độ pha lỗng 10-5 vào đĩa petri (OD610nm 0.5) Tuần tự với 10-6 10-7 Dùng que gạt thủy tinh trải dịch chứa tế bào lên bề mặt môi trường, để khơ ủ 37oC 24 c Tính mật độ tế bào - Đếm số khuẩn lạc xuất đĩa petri Khuẩn lạc - Tính số tế bào (N) có ml huyền phù độ đục từ số liệu độ pha loãng sau: N = (hỏi lại) Kết quả, tượng Nhóm ống 0.5 Đối với dung dịch có nồng độ 10-5: số khuẩn lạc đếm N = 140 Đối với dung dịch có nồng độ 10-6: số khuẩn lạc đếm N = 154 Đối với dung dịch có nồng độ 10-7: số khuẩn lạc đếm N = 155 Chỉ lấy số khuẩn lạc nồng độ 10-5: N = 140 Mật độ vi sinh vật ống 0.5 (tự thích giá trị n d V nhé) N = 140 vào công thức C= C= N , n ×d ×V 140 =140 ×106 CFU /ml −5 1×10 × 0.1 Biện luận Kết luận thí nghiệm THÍ NGHIỆM 4: PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT - XÁC ĐỊNH MẬT ĐỘ TẾ BÀO BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO ĐỘ ĐỤC Nguyên tắc thí nghiệm Độ đục huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào Trong giới hạn định độ đục mật độ tế bào, xác lập quan hệ tỉ lệ tỷ lệ tuyến tính mật độ tế bào độ đục Do định lượng mật độ tế bào cách gián tiếp thông qua đo độ đục máy đo OD bước sóng từ 550 – 610nm Cách thực a Xây dựng đường tương quan log(N/ml) theo OD610nm OD 0.1 0.2 0.5 0.17 0.276 0.643 Mật độ 52.7 76 140 Đường tương quan tuyến tính OD610nm Log(N/ml) - b Xác định mật độ tế bào theo độ đục Đo OD dung dịch nền: ĐỂ? Đo OD Dung dịch - Đo độ đục huyền phù tế bào E.coli (2ml) có mật độ chưa biết E.coli Đo OD - Nếu trị số OD610nm huyền phù tế bào E.coli đo nằm đường tương quan log(N/ml) độ đục OD610nm  Pha loãng với số lần tương ứng (3 lần) - Từ trị số OD610nm đo nằm đường chuẩn, suy số log(N/ml) dựa vào log(N/ml) độ đục OD610nm Công thức: Kết quả, tượng OD mẫu ĐL trước pha loãng: 1.077 OD mẫu ĐL sau pha lỗng lần: 0.340 Dựa vào phương trình đường chuẩn y=181.93x + 23.527 với y mật độ vi sinh vật (CFU/ml), x OD; thay x= 0.340 vào phương trình đường chuẩn: y=181.93 × 0.340+23.527=85.3832≈ 85.38 ×10 CFU /ml Mật độ vi sinh vật mẫu pha lỗng 85.38 ×106 CFU/ml Suy mật độ vi sinh vật 1ml mẫu trước pha loãng lần 6 85.38 ×10 ×3=256.14 × 10 CFU/ml Biện luận Kết luận thí nghiệm Thêm vào đường chuẩn nè Phương trình đường chuẩn y = 181.93x + 23.527 có R2=0.9979 Trong đó: y ×106 mật độ vi sinh vật 1ml mẫu (CFU/ml) x OD THÍ NGHIỆM 5: KIỂM SỐT TĂNG TRƯỞNG VI SINH VẬT BỞI KHÁNG SINH Nguyên tắc  Kháng sinh:  Nhóm sản phẩm chuyển hóa tạo vi sinh vật có tác dụng ức chế tăng trưởng tiêu diệt vi sinh vật khác  Có độc tính chọn lọc chun biệt  Mức độc tính khác lên vi sinh vật khác  Nhiều vi sinh vật có tính mẫn cảm với kháng sinh nên kiểm sốt kháng sinh  Ngày kháng sinh sử dụng để kiểm soát tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh truyền nhiễm, điều trị bệnh gây sinh vật  Tính mẫn cảm vi sinh vật kháng sinh quan sát thực nghiệm dựa kỹ thuật đĩa kháng sinh vịng vơ khuẩn  Ở thí nghiệm này, sử dụng môi trường dinh dưỡng môt trường LB, dịch vi khuẩn bôi lên môi trường sau đố ủ để phát triển sinh khối Một đĩa giấy vô trùng tẩm kháng sinh liều lượng định đặt lên hộp petri môi trường rắn chứa vi sinh vật mục tiêu  Kháng sinh khuếch tán môi trường nồng độ giảm dần theo bình phương cự ly khuếch tán Và cự ly định, nồng độ kháng sinh không đủ để ức chế tăng trưởng vi sinh vật  tạo vịng vơ khuẩn  Kỹ thuật dùng để sàng lọc xác định mức độ nhạy cảm vi khuẩn hay hoạt tính kháng khuẩn loại kháng sinh hợp chất kháng khuẩn Cách thực Kiểm soát tăng trưởng vi khuẩn E.coli kháng sinh Ampicillin (Amp) Kanamycin (Kan) Bôi dịch Đặt đĩa giấy vi khuẩn vơ trùng Amp Kan 5µl 5µl Amp Kan LB rắn Ủ 37oC 24 Amp Kan Kết  Đĩa petri bôi sinh khối E.coli sau ủ có xuất lớp trắng ngà, bóng, đĩa giấy có tẩm kháng sinh lại xuất vùng trịn khơng có trượng bì xảy (khơng xuất lớp sinh khối vi khuẩn):  Đĩa giấy tẩm kháng sinh Amp: có vùng tròn lớn, rõ ràng  Đĩa giấy tẩm kháng sinh Kan: có vùng trịn nhỏ mờ nhạt Giải thích:  Xung quanh đĩa giấy có tẩm kháng sinh có vùng trịn khơng có sinh khối vi khuẩn, vùng gọi vịng vơ khuẩn Do kháng sinh có độc tính ức chế tăng trưởng, làm tiêu diệt vi sinh vật nên vùng quanh đĩa giấy, cự ly định nơi có đủ nồng độ kháng sinh khuếch tán vi khuẩn E.coli tăng trưởng bị tiêu diệt  Tùy vào độ mẫn cảm vi khuẩn kháng sinh mà vi khuẩn khác độc tính kháng sinh vi khuẩn khác Vì vậy:  Đĩa kháng sinh Amp vịng vơ khuẩn lớn hơn, rõ hơn: E.coli nhạy cảm với Amp hơn, nên mức độ thể độc tính Amp E.coli cao, E.coli dễ bị ức chế  Đĩa kháng sinh Kan vịng vơ khuẩn nhỏ, mờ: E.coli không nhạy cảm với Kan nên mức độ thể độc tính Kan E.coli thấp, E.coli bị ức chế bị ức chế nồng độ cao nhiều so với Amp Kết luận  Kháng sinh ức chế tăng trưởng vi sinh vật tùy vào loại vi sinh vật khác mà mức độ ức chế kháng sinh khác  kháng sinh có độc tính chọn lọc chun chun biệt cho loại vi sinh vật  Đối với E.coli kháng sinh Amp thể độc tính mạnh ức chế vi khuẩn tốt so với kháng sinh Kan THÍ NGHIỆM 6: PHÁT HIỆN HOẠT TÍNH ENZYME CATALASE Ở VI SINH VẬT Giới thiệu  Catalase: enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H2O phải phóng oxi phân tử  H2O2:  Được tạo phản ứng oxy hóa khử bắt cặp với oxi phân tử chuỗi hô hấp  Có độc tính tế bào làm phá hủy thành phần tế bào  Hầu hết vi sinh vật cần có Catalase để phân giải H2O2 tránh tụ tế bào  Sử dụng môi trường thạch rắn LB để cấy vi sinh vật phát triển sinh khối Hoạt tính enzyme catalase phát vi sinh vật cách bổ sung vài giọt hydrogen peroxide lên sinh khối vi sinh vật theo dõi sủi bọt O2 phóng thích Cách thực Phát hoạt tính catalase chủng vi sinh vật “E”, ”B”, ”L” B E L E.col E.col H2O2 Kết  Tại vùng sinh khối chủng “B” có nhỏ H2O2: có tượng sủi bọt mạnh, bọt khí to  Tại vùng sinh khối chủng “E” có nhỏ H2O2: có tượng sủi bọt nhẹ, bọt khí li ti  Tại vùng sinh khối chủng “L” có nhỏ H2O2: khơng có tượng sủi bọt Nhận xét  Tại vùng sinh khối chủng “B” “E” có nhỏ H2O2: có hoạt động enzyme catalase nên thủy phân H2O2 tạo thành H2O O2 từ mà có tượng sủi bọt khí  Tại sinh khối chủng “L” có nhỏ H2O2: khơng có enzyme catalase nên khơng thể thực q trình phân hủy H2O2 để tạo O2 từ khơng có tượng sủi bọt khí Kết luận  Các chủng vi khuẩn “B”, “E” có enzyme catalase hoạt động để phân giải H2O2 tránh gây tổn thương cho tế bào  Chủng vi khuẩn “L” enzyme catalase nên khơng phân giải H2O2 THÍ NGHIỆM 7: PHÁT HIỆN HOẠT TÍNH ENZYME AMYLASE Ở VI SINH VẬT Giới thiệu  Enzyme amylase: xúc tác cho phản ứng phân hủy tinh bột thành đường maltose  Maltose: có tính tan tốt tinh bột, vào tế bào dùng làm nguồn lượng, carbon  Cần amylase để phân cắt tinh bột  Tinh bột polysaccharide có cấu trúc khơng gian phức tạp hấp phụ iod cho màu xanh đen Trong thí nghiệm sử dụng LB – tinh bột làm môt trường dinh dưỡng vi sinh vật cấy lên đĩa petri, đem ủ thấy phát triển Sau nhỏ dung dịch lugol vào  Khi môi trường chứa tinh bột nhuộm dung dịch lugol, có chứa iod, iod bị giữ lại cấu trúc không gian tinh bột làm cho môi trường xuất màu xanh đen  Nếu vi sinh vật có khả phân giải tinh bột cấu trúc bị phá vỡ, quanh sinh khối vi sinh vật khơng có màu xanh đậm Cách thực Phát hoạt tính amylase chủng vi sinh vật “E”, ”B”, ”L” B E L E.c Iod E.c Kết  Tại vùng sinh khối chủng “B” có nhỏ lugol: vùng quanh sinh khối vi sinh vật có màu vàng nâu lugol  Tại vùng sinh khối chủng “E” có nhỏ lugol: dung dịch lugol chuyển sang màu xanh đen môi trường mép sinh khối vi sinh vật chuyển sang màu xanh đen  Tại vùng sinh khối chủng “L” có nhỏ lugol: Nhận xét  Tại vùng sinh khối chủng “B” có nhỏ dung dịch lugol: nhờ có mặt enzyme amylase mà phân tử tinh bột xung quanh sinh khối vi sinh vật phân giải, tinh bột khơng cịn cấu trúc khơng gian ban đầu nên vùng xung quanh gần sinh khối chủng “B” có màu vàng nâu dung dịch lugol  Tại vùng sinh khối chủng “E” có nhỏ dung dịch lugol: khơng có enzyme amylase nên tinh bột vùng sinh khối vi sinh vật không bị phân giải, tinh bột giữ cấu trúc không gian nên cho dung dịch lugol vào chuyển sang màu xanh đậm  Tại vùng sinh khối chủng “L” có nhỏ dung dịch lugol: Kết luận  Chủng “B”: có enzyme ngoại bào amylase xúc tác thủy phân tinh bột thành maltose nên lugol xung quanh sinh khối không chuyển màu vàng nâu sang xanh đen  Chủng “E”: khơng có enzyme ngoại bào amylase nên tinh bột không bị thủy phân nên thấy màu xanh đen tinh bột hấp phụ iod  Chủng “L”: ... loãng 10 -3 đến 10 -7 0 .1 10 -1 0 .1 10-2 0 .1 10-3 0 .1 10-4 0 .1 0 .1 10-5 10 -6 10 -7 - - b Tạo hộp trải Hút 0.1ml huyền phù có độ pha lỗng 10 -5 vào đĩa petri (OD 610 nm 0.5) Tuần tự với 10 -6 10 -7 Dùng... lạc môi trường Hasen nấm men Khuẩn lạc môi trường LB vi khuẩn E.coli Khuẩn lạc môi trường Gause xạ khuẩn THÍ NGHIỆM 2: PHÁT HIỆN VI SINH VẬT DỰA VÀO TIÊU BẢN Giới thiệu: _ Tùy theo kích thước, vi. .. bệnh gây sinh vật  Tính mẫn cảm vi sinh vật kháng sinh quan sát thực nghiệm dựa kỹ thuật đĩa kháng sinh vịng vơ khuẩn  Ở thí nghiệm này, sử dụng môi trường dinh dưỡng môt trường LB, dịch vi khuẩn