BÁO cáo THỰC tập CÔNG NGHỆ SINH học dược chọn lọc giống vi sinh vật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA DƯỢC - BỘ MƠN VI SINH – KÍ SINH BÁO CÁO THỰC TẬP CƠNG NGHỆ SINH HỌC DƯỢC Tiểu nhóm 02 – Nhóm 15 – Chiều thứ Tiêu Đức Lợi Lưu Gia Linh Nguyễn Thanh Gia Hân Nguyễn Thị Ngọc Hiệp TP HỒ CHÍ MINH – 2021 Bài Chọn lọc giống vi sinh vật 1.1 Tóm tắt lý thuyết 1.1.1 Phân lập giống vi sinh vật chủng - Bước trình chọn lọc giống si sinh vật chủng phân lập chủng từ nơi sinh cư tự nhiên theo kiểu săn lùng theo kiểu định hướng - Sau sử dụng mơi trường phân lập mơi trường ni cấy để phân lập chủng có đặc tính mong muốn 1.1.2 Phát dịng vi sinh vật có đặc tính mong muốn STT Loại đột biến Dấu hiệu phát đột biến Chủng vi sinh vật có sinh amylase ngoại bào thủy phân tinh bột môi trường Amylase ngoại bào nên tinh bột tạo màu tím với thuốc thử lugol Xung quanh khóm có vịng sáng Chủng vi sinh vật có sinh protease ngoại bào thủy phân gelatin môi trường Protease ngoại bào nên gelatin không bị tủa tráng lên môi trường TCA Xung quanh khóm có vịng sáng Khả ức chế tăng trưởng vi Kháng sinh sinh vật khác cách tạo vùng ức chế xung quanh lỗ cấy 1.1.3 Phương pháp bảo quản giống a Phương pháp giữ giống thạch cách cấy truyền - Cấy truyền định kỳ vi sinh vật sang môi trường (thời gian cấy truyền từ tuần đến tháng) - Ưu điểm: đơn giản, dễ làm - Nhược điểm: tốn nhiều cơng sức, dẫn đến thối hóa chủng b Giữ giống lớp dầu khoáng - Giữ giống – 5℃ cho lên bề mặt lớp dầu trơ vaselin, parafin,… giữ môi trường không bị khô - Ưu điểm: giữ chủng lâu đến nhiều năm c Giữ giống cát - Chỉ áp dụng cho việc bảo quản bào tử Cát trùng đổ vào bào tử nuôi cấy chin cho bào tử bám vào cát - Thời gian bảo quản lâu d Đông lạnh đông khô - Đông lạnh: làm lạnh ống chứa môi trường chwuas vi sinh vật -80 ℃ với chất bảo quản chống đơng thích hợp (glycerine, sữa,…) Thời gian giữ lâu khoảng tháng – 10 năm Đông khô: thêm chất bảo quản (sữa gầy, đường) vào môi trường chứa vi sinh vật đem đông lạnh thăng hóa nước nhiệt độ thấp (dưới nhiệt độ đơng đặc mẫu) Thời gian bảo quản lâu, khả phục hồi cao mà ảnh hưởng đến hoạt tính 1.2 Kết bàn luận 1.2.1 Phát vi sinh vật sinh enzym amylase protease a Hình ảnh đĩa phân lập phát khả sinh enzyme Phân lập môi trường tinh bột Cấp pha lỗng: Phân lập mơi trường tinh bột tráng dung dịch lugol Cấp pha loãng: Phân lập mơi trường gelatin Cấp pha lỗng: Phân lập mơi trường gelatin tráng TCA 50% Cấp pha lỗng: b Kết phân lập phát khả sinh enzym ngoại bào Bảng Kết phân lập phát khả sinh enzym ngoại bào Chủng Mô tả khuẩn lạc Amylase Protease Mặt lồi, mép cưa, màu Đường kính vịng trắng đục sáng: mm Đường kính mm Mọc mơi trường tinh bột Mặt lồi, mép cưa, màu Đường kính vịng trắng đục sáng: mm Đường kính mm Mọc môi trường gelatin Mặt phẳng, mép trịn, màu Đường kính vịng trắng đục sáng: mm Đường kính mm Mọc mơi trường gelatin 1.2.2 Phát khả sinh kháng sinh E coli S aureus Bảng Kết phát khả sinh kháng sinh Chủng Bacillus Bacillus Bacillus Bacillus E coli 20 mm 19mm 17 mm - S aureus 42 mm 40 mm 38 mm 32 mm 1.2.3 Bàn luận a Phát vi sinh vật sinh amylase protease ngoại bào - Chủng vi sinh vật mẫu đất sau phân lập môi trường thạch tinh bột ủ 37℃ 24 có khả tiết amylase ngoại bào  Amylase ngoại bào thủy phân tinh bột môi trường nên tinh bột khơng bắt màu tím với dung dịch lugol → Xung quanh khóm vi khuẩn tiết amylase có vịng sáng - Chủng vi sinh vật mẫu đất sau phân lập môi trường thạch gelatin ủ 37℃ 24 có khả tiết protease ngoại bào  Protease ngoại bào thủy phân gelatin môi trường nên gelatin không bị đục màu với dung dịch TCA 50% → Xung quanh khóm vi khuẩn tiết protease có vịng sáng b Phát khả sinh kháng sinh - Phát vi sinh vật sinh kháng sinh dựa vào khả ức chế tăng trưởng với vi sinh vật khác  E coli lỗ có lỗ B4 lỗ chứng (khơng có chủng có mơi trường) khơng xuất vòng ức chế xung quanh lỗ, lại lỗ B1B3 có vịng ức chế xung quanh lỗ  S aureus lỗ có lỗ chứng khơng có vịng ức chế xung quanh lỗ, cịn lại lỗ B1-B4 có vịng ức chế xung quanh lỗ → Kết luận: Trong chủng Bacillus  Cả chủng Bacillus sinh kháng sinh ức chế tăng trưởng E coli  Chủng Bacillus 1, 2, sinh kháng sinh ức chế tăng trưởng S aureus Bài Tinh chế enzyme amylase alginat 2.1 Tóm tắt lý thuyết - Enzym amylase enzyme xúc tác cho thủy phân tinh bột thành đường Enzym amylase ứng dụng nhiều lĩnh vực công nghiệp, thực phẩm, y dược… Trong y học, enzyme amylase ứng dụng để trợ tiêu hóa, làm dịch tiêm truyền, chuyển hóa tinh bột thành dextrin, tinh bột tan làm tá dược bào chế để sản xuất số thuốc - Enzym amylase thu nhận từ nhiều nguồn khác như: động vật, vi sinh vật thực vật Enzym amylase dùng y dược cần độ tinh khiết cao nên cần tinh chế từ enzyme thô - Nguyên tắc tinh chế enzyme amylase: dùng alginate để bắt giữ enzyme từ hỗn hợp thơ Sau đó, thêm CaCl2, gel Ca-alginate giúp tách enzyme khỏi dung dịch Cuối cùng, enzyme amylase nhờ dung dịch glucose - Xác định hoạt độ enzyme amylase phương pháp Heinkel thông qua lượng tinh bột bị phân giải dựa sở xác định mức độ giảm cường độ màu hỗn hợp phản ứng với dung dịch Iode 2.2 Kết bàn luận 2.2.1 Hàm lượng protein Bảng 2.1 Hàm lượng protein enzym thô tinh chế Mẫu OD280 Thể tích (ml) Hàm lượng protein (mg) Enzym thô 0,3561 Vthô =10 71,22 Enzym tinh chế 0,8148 Vtinh chế = 37 30,15 2.2.2 Hoạt tính enzym a Đường chuẩn hoạt tính enzym OD560 Bảng 2.2 Thông số đường chuẩn tinh bột Ống U/ml OD ∆OD 0,2 0,4 0,6 0,8 0,0198 0,1822 0,3541 0,5191 0,6442 0,8269 0,1624 0,3343 0,4993 0,6244 0,8071 Vẽ đường chuẩn b Hoạt tính enzyme Bảng Hoạt tính enzym thơ tinh chế Mẫu OD560 chứng OD560 thử Độ pha loãng Hoạt tính tổng Hoạt tính riêng enzym (U) (U/protein) Enzym thơ 0,8296 0,1984 100 783,99 11,01 Enzym tinh chế 0,8630 0,0709 10 364,66 12,09 Tính: Hiệu suất tinh chế Mức tinh chế - Hiệu suất tinh chế: HS = HTCenzyme tinh / HTCenzyme thô = 364,66/783,99 = 0,4651 Vậy HS = 46,51% - Mức tinh chế: HTRenzyme tinh / HTRenzyme thô = 12,09/11,01 = 1,1 c Nhận xét hiệu suất tinh chế mức tinh chế - Quá trình tinh chế enzyme amylase đạt hiệu suất thấp 46,51% - Mức tinh chế thấp, enzyme amylase sau tinh chế có hoạt tính khơng tang khơng nhiều so với enzyme thô 2.2.3 Bàn luận - Về tổng lượng protein: Ban đầu, hàm lượng protein enzyme thô 71,22 (mg) Sau tinh chế, hàm lượng protein enzyme tinh chế 30,15 (mg) Như vậy, sau trình tinh chế, ta loại lượng protein, protein khơng phải enzyme amylase Nhờ mà enzyme sau tinh chế tinh khiết so với enzyme thơ ban đầu - Về hoạt tính chung enzyme: Ban đầu, hoạt tính tổng enzyme thơ là: 783,99 (U) Sau tinh chế, hoạt tính tổng enzyme tinh chế là: 364,66 (U) Do sau trình tinh chế, ta loại lượng enzyme nên hoạt tính tổng enzyme tinh chế giảm so với hoạt tính tổng enzyme thơ - Về hoạt tính riêng enzyme: Hoạt tính riêng enzyme thơ: 11,01 (U/protein) Hoạt tính riêng enzyme tinh chế: 12,09 (U/protein) Hoạt tính riêng enzyme sau tinh chế cao so với enzyme thô ban đầu mức tinh chế thấp Bài 3: Cố định CGTase lên alginat 3.1 Tóm tắt lý thuyết - Cyclodextrin glucanotranferase (CGTase, EC 2.4.1.19) enzym có khả chuyển hóa tinh bột chất tương tự thành hỗn hợp cyclodextrin - Cố định giúp tận dụng tăng cường tính ổn định, hoạt tính CGTase đắt tiền - Dựa vào chất liên kết chất mang enzyme, cố định enzyme bao gồm phương pháp: + Vật lý: hấp phụ, liên kết ion, tương tác kỵ nước, + Liên kết cộng hóa trị: dựa vào lực enzyme chất mang để tạo nên phức hợp enzyme - chất mang có liên kết cộng hóa trị + Bắt giữ enzyme gel: dựa vào hút giữ enzyme vào mạng lưới mà chất sản phẩm qua được, không cho enzyme khuếch tán vào môi trường + Tạo vi nang: enzyme giữ bao vi thể có màng bán thấm dày 200 Å (như cellulose, polysaccharide) - Cố định CGTase lên chất mang alginat Xác định hàm lượng protein cố định thuốc thử Bradford, đo OD 595nm - Hoạt tính CGTase cố định đánh giá thông qua lượng cyclodextrin CGTase tạo từ maltodextrin điều kiện xác định dựa vào khả hấp phụ làm màu phenolphtalein cyclodextrin 3.2 Kết bàn luận 3.2.1 Hàm lượng protein a Đường chuẩn BSA Ống nghiệm Nồng độ (mg/ml) OD595 nm ∆OD595 nm BSA Bảng Thông số đường chuẩn BSA 0,2 0,4 0,6 0,8 0,4657 0,7717 0,3060 0,9574 0,4917 1,1027 0,6370 1,2254 0,7597 1,2481 0,7824 10 Hình 3.1 Đường biểu diễn phụ thuộc độ hấp thu nồng độ protein (mg/ml) theo phương pháp Bradford b Hàm lượng protein Bảng Hàm lượng protein enzym thô tinh chế Mẫu OD595 Thể tích Hệ số pha Hàm lượng (ml) loãng protein (mg) Enzym ban đầu Vban đầu = 20 4,0820 => 0,7401 0,7689 595 = 0,7545 Vgộp = 40 1/17 1,1287 => 0,9775 1,0878 595 = 1,0327 Enzym không CĐ theo bắt giữ Enzym CĐ theo bắt giữ 2,9533 Enzym không CĐ theo hấp phụ => Enzym CĐ theo hấp phụ 2.2.4 Hoạt tính enzym a Đường chuẩn CD Số thứ tự Nồng độ CD (mg/ml) OD550 = OCC – OD T 0,8635 0,8672 595 = 0,8654 Vgộp = 40 5/17 3,5435 0,5385 Bảng Thông số đường chuẩn CD 0,2 0,4 0,6 0,0952 0,1559 0,2248 0,8 0,2706 0,2983 11 Vẽ dường chuẩn CD Hình 3.2 Đường biểu diễn phụ thuộc độ hấp thu vào nồng độ CD b Hoạt tính enzym Mẫu Bảng Hoạt tính enzym OD550 chứng OD550 thử ΔOD550nm Hệ số pha loãng Hoạt tính chung (U/ml) Hoạt tính riêng (U/mg protein) Enzym ban đầu 0,7244 0,3496 0,7117 0,3665 => 550chứng => 550thử = 0,7181 = 0,3581 0,3600 30 19,80 4,85 Enzym CĐ theo bắt giữ 0,7438 0,3937 0,7414 0,4484 => 550chứng => 550thử = 0,7426 = 0,4211 0,3215 10/0,6 9,73 3,29 2,95 5,48 0,7663 0,6432 0,7663 0,6595 0,1149 10/0,6 => 550chứng => 550thử = 0,7663 = 0,6514 Tính: Hiệu suất cố định tỉ lệ hoạt tính riêng enzym Enzym CĐ theo hấp phụ - Hiệu suất cố định protein theo phương pháp bắt giữ: 𝐻% = 𝑥 100% = 𝑥 100% = 72,40% - Hiệu suất cố định protein theo phương pháp hấp phụ: 12 𝐻% = 𝑥 100% = 𝑥 100% = 13,19% - Tỉ lệ hoạt tính riêng enzym theo phương pháp bắt giữ: 𝑇𝐿𝐻𝑇 = 𝑥 100% = 𝑥 100% = 67,84% - Tỉ lệ hoạt tính riêng enzym theo phương pháp hấp phụ: 𝑇𝐿𝐻𝑇 = 𝑥 100% = 𝑥 100% = 112,99% c Nhận xét hiệu suất cố định và tỉ lệ hoạt tính riêng enzym - Hiệu suất cố định: phương pháp bắt giữ có hiệu suất cố định cao phương pháp hấp phụ (72,40% so với 13,19% ,gấp 5,49 lần) - Tỉ lệ hoạt tính riêng enzym: phương pháp bắt giữ có tỉ lệ hoạt tính riêng thấp phương pháp hấp phụ (67,84% so với 112,99% ,gấp 1,67 lần) 2.2.5 Bàn luận - Hiệu suất cố định protein phương pháp bắt giữ đạt cao (72,40%), phương pháp cố định enzym không thuận nghịch, enzym khơng thể khỏi chất mang gel alginat sau cố định - Hiệu suất cố định protein phương pháp hấp phụ đạt thấp (13,19%) Do pử phương pháp này, enzyme chất mang dựa tương tác bề mặt gel enzym liên kết hydro, lực Van der Waals, cầu nối ion, tương tác kỵ nước nên enzym quay trở lại mơi trường, cố định thuận nghịch, hiệu suất cố định đạt 13,19% - Đối với phương pháp cố định bắt giữ, không thay đổi cấu trúc enzym giảm sút hoạt tính giải thích cản trở mặt không gian nên enzym cố định phương pháp bắt giữ khó tiếp xúc với chất, enzym nằm bề mặt hạt gel dễ dàng gặp chất Đối với phương pháp hấp phụ, enzym nằm bề mặt hạt gel, nên tỷ lệ hoạt tính riêng enzym đạt cao - Đối với phương pháp cố định theo phương pháp hấp phụ, hoạt tính riêng enzym sau cố định cao so với enzym ban đầu Nguyên nhân lượng enzym cố định thấp mà lượng chất môi trường cao nên enzym tiếp xúc nhiều với chất, khả thể hoạt tính cao so với enzym ban đầu 13 Bài 4: Tinh chế Lysozym sắc ký trao đổi ion 4.1 Tóm tắt lý thuyết  Các phương pháp tinh chế protein dựa tinh chất hóa lý protein điện tích, kích thước phân tử, hòa tan… Đối với phương pháp tinh chế protein sắc ký trao đổi ion dựa tích điện khác trước thay đổi pH. Mỗi protein có giá trị pH mà tổng điện tích âm dương nhau, hay nói cách khác điện tích 0, pH gọi pI (điểm đẳng điện). Khi pH dung dịch lớn pI protein tích điện ngược lại  Nhựa sắc ký trao đổi ion bao gồm chất khơng tan gắn nhóm mang điện tích liên kết cộng hóa trị, nhóm mang điện tích liên kết với đối ion có điện tích trái dấu cách thuận nghịch nhờ tương tác tĩnh điện Có loại nhựa trao đổi ion là: cation, anion  Sắc ký trao đổi ion dựa vào trao đổi thuận nghịch điện tích protein với điện tích trái dấu pha tĩnh sắc ký, tùy theo cân ion pH dung dịch mà protein gắn vào nhựa hay bị đẩy khỏi nhựa  Nguyên tắc tinh chế thực tập: Dựa vào khác biệt pI lysozym (pI=10) so với protein khác lịng trắng trứng(pI ≤ 6), pH nhựa trao đổi cation lysozym có pI > pH tích điện dương bị giữ lại cột cịn protein khác có pI Lysozym khỏi cột cách nâng ph lên 10 tăng nồng độ ion dung dịch đệm lên để cạnh tranh đẩy lysozym 4.2 Kết bàn luận 4.2.1 Kết xác định hàm lượng protein *Thông số đường chuẩn BSA: Nồng độ BSA 0,2 0,4 OD 0,4611 0,7685 0,9917 0,3074 0,5306 OD 0,6 1,1095 0,6484 0,8 1,2599 0,7988 1,3035 0,8424 *Đồ thị đường chuẩn BSA: 14 Ta có phương trình đường chuẩn BSA: y = -0.7188x2 + 1.548x + 0.0109 R² = 0.9966 Thông số mẫu: ODđệm chạy = 0,4597 ODđệm = 0,4254 Bảng Hàm lượng protein phân đoạn Mẫu Mẫu A (n=100) B (n=50) B1 (n=10) C* OD595 0,9121 0,8852 1,0140 0,6484 OD 0,4524 0,4255 0,5543 0,1887 Thể tích 1 2,5 1,5 Lượng 33,84 15,68 11,04 0,18 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 Mẫu gộp D** OD595 0,7854 0,8601 0,8052 0,7485 0,6195 0,5271 0,4950 0,4808 0,4734 0,4532 OD 0,36 Thể tích 0,5 0,4347 0,3798 0,3231 0,1941 0,1017 0,0696 0,0554 0,048 0,0278 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Lượng 0,1280 0,1610 0,1365 0,1126 0,0629 0,0302 0,0193 0,0146 0,0121 0,0055 0,6827 * C*: 0,5ml dịch C1-5 0,1ml dịch từ C6 đến C15 **Mẫu gộp D: tổng lượng protein ống D1 đến D10 ***n: hệ số pha loãng Hiệu suất: HS = x 100% = x 100% = 2,02% Nhận xét hiệu suất tinh chế  Dịch A chứa toàn lượng protein (gồm lysozym protein tạp) nên có lượng protein lớn  Dịch B, B1, C* lượng protein lysozym  Dịch D lượng lysozym tinh chế Ta thấy: x 100% = x 100% = 81,51% =>Lượng protein tổng (lysozym protein tạp) lấy chưa hết (81,51% so với mẫu A ban đầu) Hiệu suất tinh chế lysozym thấp (2,02%) 15 1.1.1 Bàn luận Thực tế lượng lysozym lòng trắng trứng chiếm tỉ lệ thấp (dưới 5%) Nguyên nhân dẫn đến hiệu suất tinh chế chưa đạt:  Rửa cột nhiều lần với đệm chạy, lần rửa ion H+ đệm chạy cạnh tranh với lysozym để gắn nhựa trao đổi cation, làm phần lysozym bị đẩy ngồi  Thao tác tinh chế chưa cẩn thận: khơng lấy hoàn toàn dịch từ cột (cụ thể rửa cột với đệm chạy, không lấy hết đệm chạy ngoài, nạp mẫu lấy dịch bị lẫn với đệm), thao tác cho mẫu hay đệm vào cột không nhẹ nhàng làm tung nhựa trao đổi sepharose lên  Thao tác bơm hút dịch vào eppendoff chưa xác làm ảnh hưởng đến kết đo OD  Khi pha loãng hay hút mẫu để đo, lắc dịch khơng dẫn đến sai số q trình đo  Chưa hoạt hóa tối đa khả trao đổi ion cột sắc ký  Chất lượng cột sắc ký không tốt  Giai đoạn để yên 10 phút nhằm đảm bảo gắn kết lysozym nhựa sắc ký chưa đảm bảo đủ thời gian  Cột sắc ký không đủ dài nên thời gian lưu chưa đủ, dẫn đến pha tĩnh cột không đủ để bắt giữ hết lysozym 1.3 Sơ đồ trình tinh chế: Dịch A (lysozym protein tạp) Cột sắc ký -Rửa cột với: thể tích nước cất vơ trùng thể tích đệm chạy Để yên 10 phút Dịch B (protein tạp) Đệm chạy Dịch C (protein tạp) Đệm Dịch D (Lysozym) Cân bằng, bảo quản cột 16 17 18 ...1 Bài Chọn lọc giống vi sinh vật 1.1 Tóm tắt lý thuyết 1.1.1 Phân lập giống vi sinh vật chủng - Bước trình chọn lọc giống si sinh vật chủng phân lập chủng từ nơi sinh cư tự nhiên theo... TCA 50% → Xung quanh khóm vi khuẩn tiết protease có vịng sáng b Phát khả sinh kháng sinh - Phát vi sinh vật sinh kháng sinh dựa vào khả ức chế tăng trưởng với vi sinh vật khác  E coli lỗ có lỗ... trưởng vi Kháng sinh sinh vật khác cách tạo vùng ức chế xung quanh lỗ cấy 1.1.3 Phương pháp bảo quản giống a Phương pháp giữ giống thạch cách cấy truyền - Cấy truyền định kỳ vi sinh vật sang môi