(TIỂU LUẬN) báo cáo THỰC tập CÔNG NGHỆ SINH học dược TINH CHẾ ENZYM AMYLASE BẰNG ALGINAT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH KHOA DƯỢC BỘ MƠN VI SINH – KÍ SINH BÁO CÁO THỰC TẬP CƠNG NGHỆ SINH HỌC DƯỢC Nhóm: 11 - Chiều thứ - Tiểu nhóm: 03 Lê Minh Tuấn Tô Thành Trung Phan Văn Quốc Việt Thành phố Hồ Chí Minh - 2021 TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH KHOA DƯỢC BỘ MƠN VI SINH – KÍ SINH BÁO CÁO THỰC TẬP CƠNG NGHỆ SINH HỌC DƯỢC Nhóm: 11 - Chiều thứ - Tiểu nhóm: 03 Lê Minh Tuấn Tô Thành Trung Phan Văn Quốc Việt Thành phố Hồ Chí Minh - 2021 MỤC LỤC BÀI CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT………………………………………… …… 1.1 Tóm tắt lý thuyết………………………………………………………………… … 1.2 Kết quả…………………………………………………………….………….……… 1.3 Bàn luận………………………………………………………… …………… ……9 BÀI TINH CHẾ ENZYM AMYLASE BẰNG ALGINAT………………………… ….12 2.1 Tóm tắt lý thuyết…………………………………………………………………….12 2.2 Kết quả……………………………………………………………………………… 16 2.3 Bàn luận…………………………………………………………………………… 18 BÀI CỐ ĐỊNH CGTase LÊN ALGINAT……………………………………………… 19 3.1 Tóm tắt lý thuyết…………………………………………………………………….19 3.2 Kết quả……………………………………………………………………………… 20 3.3 Bàn luận…………………………………………………………………………… 24 BÀI TINH CHẾ LYSOZYM BẰNG SẮC KÝ ÁI LỰC……………………………… 27 4.1 Tóm tắt lý thuyết…………………………………………………………………….27 4.2 Kết quả……………………………………………………………………………… 30 4.3 Bàn luận…………………………………………………………………………… 32 i Nhóm 11 - Chiều thứ - Tiểu nhóm 03 ii Nhóm 11 - Chiều thứ - Tiểu nhóm 03 BÀI 1.1 CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT Tóm tắt lý thuyết Vi sinh vật sử dụng rộng rãi q trình cơng nghệ ưu dễ nuôi cấy qui mô lớn, tăng trưởng nhanh, sử dụng chất rẻ tiền khả cho nhiều sản phẩm đa dạng Phân lập tuyển chọn giống vi sinh vật từ nguồn gen tự nhiên cải tạo từ việc gây đột biến nhằm tạo giống có hoạt tính, có đặc tính mong muốn khả cạnh tranh cao Bên cạnh việc chọn lọc giống khơng có ý nghĩa chủng khơng bảo quản để sống sót ổn định tính trạng thu 1.1.1 Phân lập giống vi sinh vật chủng từ tự nhiên hay gây đột biến phát dịng vi sinh vật có đặc tính mong muốn Phân lập vi sinh vật từ tự nhiên Để chọn lọc giống vi sinh vật thích hợp, bước phân lập chúng theo kiểu “săn lùng” từ nguồn tự nhiên mô, xác động vật, thực vật, đất, chất thải, nước thải khu trú định hướng vào nơi sinh sống tự nhiên vi sinh vật lớp bùn trầm tích ao hồ, lò mổ, giếng dầu,… Nguyên tắc phương pháp Trước hết chọn kiểm tra sơ địa điểm lấy mẫu để thu mẫu vi sinh vật có đặc tính mong muốn Lấy mẫu (ví dụ thực tập mẫu lấy từ đất), thêm 10 ml PBS, vortex, để lắng pha loãng dịch huyền phù vi sinh vật cấp số 10 đến ống số Hút 100 µl huyền phù vi sinh vật cấp độ cuối (4, 5, 6), trải lên môi trường thích hợp ủ nhiệt độ thích hợp (37 ˚C 24 vi khuẩn, nhiệt độ phòng ngày vi nấm, xạ khuẩn) Nhóm 11 - Chiều thứ - Tiểu nhóm 03 Hình 1.1 Hình minh họa nguyên tắc phân lập vi sinh vật từ mẫu đất Các phương pháp đột biến Các tác nhân gây đột biến chia thành ba nhóm: - Những tác nhân vật lý: Tia cực tím, tia X (rơnghen), tia Y bắn phá hạt nơtron hay electron - Những tác nhân hoá học: Các hợp chất chứa nitơ như: Nitrozomethylguanidin, methyldicloroetylamin, nitrit, hydroxylamin hay ethylametansunfonat - Những tác nhân sinh học: Gây đột biến Transposon Thông qua tiếp hợp, plasmid mang Transposon (yếu tố Tn) đến tế bào cần gây đột biến chuyển đến vị trí khác nhiễm sắc thể hay plasmid làm gián đoạn gen dẫn đến đột biến Để phân lập tăng sinh thể đột biến đạt số cách thông dụng sau - Nuôi cấy môi trường thạch dinh dưỡng chứa chất ức chế kháng sinh, chất độc hay thực khuẩn, thể đột biến kháng chất ức chế mọc - Nuôi cấy môi trường thiếu chất tăng trưởng chứa kháng sinh Penicillin hay chất khác để tiêu diệt tế bào tăng trưởng, thể đột biến khuyết dưỡng không mọc môi trường tối thiểu nên sống sót Sau trải lên mơi trường hồn chỉnh mơi trường có đầy đủ chất dinh dưỡng nên thể đột biến mọc - Thêm môi trường ni cấy chất kháng chuyển hóa, có cấu trúc giống với chất chuyển hóa thơng thường nên chất kháng chuyển hóa tham gia vào q trình trao đổi chất, khơng có chức sinh học nên làm tế bào bình thường koong thực đầy đủ chức sống dẫn tới tác dụng ức chế chết tế bào Các thể đột biến khả sử dụng chất đột biến khả điều hòa nên sản xuất vượt mức chất chuyển hóa bình thường nên khơng sử dụng chất kháng chuyển hóa dẫn tới tăng trưởng bình thường Nhóm 11 - Chiều thứ - Tiểu nhóm 03 Phát dịng vi sinh vật có đặc tính mong muốn Bảng 1.1 Bảng trình bày số loại đặc tính vi sinh vật phương pháp sàng lọc STT Loại hoạt tính Amylase ngoại bào Protease ngoại bào Kháng sinh Không di động Không tạo nha bào Khuẩn lạc xù xì Dinh dưỡng Lên men đường Kháng thuốc 10 Kháng virus 11 Nhạy cảm với nhiệt độ bình thường 12 Mất sắc tố Nhóm 11 - Chiều thứ - Tiểu nhóm 03 Phương pháp “sàng lọc” cho phép nhanh chóng xác định khả sinh enzym phù hợp với yêu cầu sản xuất qui mô lớn công nghiệp hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, virus kháng ung thư chủng phân lập Để xác định khả sinh enzym, phương pháp áp dụng trải vi khuẩn lên mơi trường có chứa chất cảm ứng sử dụng thị thích hợp để phát Phương pháp chủ yếu sử dụng việc tìm chủng sản xuất chất kháng sinh thường dùng hai kiểu kỹ thuật: Lấy mẫu thử để khảo sát tác dụng với nhiều chủng kiểm định Lấy nhiều mẫu thử để khảo sát tác dụng với chủng kiểm định Đối với thực tập sử dụng chủng Bacillus khảo sát tác dụng với chủng thử nghiệm Staphylococcus E.coli 1.1.2 Kỹ thuật bảo quản giống vi sinh vật Phương pháp cấy truyền vi sinh vật: (thời gian cấy truyền tuần - tháng) - Cấy truyền môi trường dịch thể Cấy truyền môi trường thạch  Ưu điểm: đơn giản, dễ làm  Nhược điểm: tốn công sức, môi trường thời gian: không ổn định Phương pháp giữ giống mơi trường thạch lớp dầu khống: vaselin, parafin, (giữ chủng 1- nhiều năm) - Đơn giản, hiệu cao - Môi trường không bị nước - Vi sinh vật bảo quản lâu so với cấy truyền vi sinh vật Giữ giống vi sinh vật môi trường đất, cát hạt - Bảo quản vi sinh vật tạo bào tử - Thời gian bảo quản 1- nhiều năm Phương pháp đông lạnh - Phương pháp đơn giản - Vi sinh vật giữ lâu tháng - 10 năm 3.2.2 Hoạt tính enzym Đường chuẩn CD Bảng 3.1 N ∆O Hình 3.1 đường chuẩn β-CD 23 Hoạt tính enzym Bảng 3.2 Hoạt tính enzym Mẫu Enzym ban đầu Enzym cố định theo hấp phụ Enzym cố định theo bắt giữ  Hiệu suất cố định protein tỉ lệ hoạt tính enzym theo phương pháp bắt giữ hấp phụ Hiệu suất cố định Tỉ lệ hoạt tính Nhận xét hiệu suất cố định và tỉ lệ hoạt tính riêng enzym Hiệu suất cố định protein hai phương pháp có chênh lệch Phương pháp bắt giữ có hiệu suất cố định protein cao so với phương pháp hấp phụ, gấp 1,2 lần Tỉ lệ hoạt tính riêng theo phương pháp bắt giữ cao phương pháp hấp phụ, gấp lần Vậy cố định enzyme phương pháp bắt giữ cho hiệu suất cố định tỉ lệ hoạt tính enzyme cao so với phương pháp hấp phụ 3.3 Bàn luận Hiệu suất cố định protein phương pháp bắt giữ đạt cao (87,03%), phương pháp cố định enzym khơng thuận nghịch, enzym khơng thể thoát khỏi chất mang gel alginat sau cố định Còn phương pháp hấp phụ, dựa tương tác bề mặt gel enzym liên kết hydro, lực Van der Waals, cầu nối ion, tương tác kỵ nước nên enzym quay trở lại môi trường, cố định thuận nghịch, hiệu suất cố định đạt 72,64% Tuy nhiên hiệu suất cố định enzym 24 theo phương pháp bắt giữ tương đối cao cho thấy trình cố định hiệu Điều giải thích thơng qua việc enzym CGTase hấp phụ lên lỗ trống bề mặt enzym, đồng thời tương tác với gel alginat chủ yếu đa số lực liên kết bền mạnh chẳng hạn lực liên kết ion, điều diễn nhờ nhóm chức diện bên cấu trúc enzym gel, chứng tỏ enzym gel có mức độ tương thích tương đối cao Khi nhìn vào thơng số hoạt tính enzym cố định theo phương pháp hấp phụ bắt giữ, Nhóm nhận thấy hoạt tính chung riêng enzym theo phương pháp bắt giữ cao so với phương pháp hấp phụ Theo lí thuyết, phương pháp bắt giữ, không thay đổi cấu trúc enzym cản trở mặt không gian nên enzym cố định phương pháp bắt giữ khó tiếp xúc với chất, enzym nằm bề mặt hạt gel dễ dàng gặp chất Từ thấy q trình tạo hạt gel phương pháp bắt giữ, kích thước lỗ hạt gel đủ để phân tử chất qua lỗ bề mặt hạt gel vào bên trong, tương tác với enzym tạo thành sản phẩm Nhờ tỉ lệ hoạt tính enzyme theo phương pháp bắt giữ cao xấp xỉ 64,77% so với enzym ban đầu không cố định Thêm vào đó, phương pháp bắt giữ cố định enzym hiệu nhiều so với theo phương pháp hấp phụ nên hoạt tính riêng enzym theo phương pháp bắt giữ nhìn chung cao (do nhiều enzym cố định dẫn tới tạo nhiều sản phẩm hơn) Còn phương pháp hấp phụ, theo lí thuyết enzym nằm bề mặt hạt gel, khả chất tới tương tác với enzym cao nhiều so với phương pháp bắt giữ, enzym hấp phụ với bề mặt gel liên kết yếu nên thường không làm thay đổi cấu trúc phân tử enzym nên hoạt tính cao Nhưng thực tế thực nghiệm hoạt tính chung riêng enzym theo phương pháp hấp phụ thấp nhiều so với phương pháp bắt giữ Điều giải thích thơng qua hai lí Lí thứ Nhóm trình bày trên, enzym tương tác với bề mặt gel đa số lực liên kết bền mạnh nên có thay đổi nhỏ cấu trúc enzym, dẫn tới giảm hoạt tính enzym nên tạo sản phẩm hơn, tỉ lệ hoạt tính so với enzym ban đầu thấp nhiều so với phương pháp bắt giữ, bù lại hiệu suất cố định lượng enzym cố định hiệu xấp xỉ so với phương pháp Lí thứ hai hiệu suất cố định cao thấp nhiều so với phương pháp bắt giữ 25 nên hoạt tính riêng thấp lượng enzym cố định thấp so với phương pháp bắt giữ (35,2581 mg cố định theo hấp phụ so với 42,2452 mg cố định theo bắt giữ) Kết luận: Trong hai phương pháp cố định phương pháp bắt giữ chiếm hiệu cao nhiều so với phương pháp hấp phụ Tuy nhiên, hiệu việc cố định enzym hoạt tính enzym đạt cịn phụ thuộc vào thành phần tính chất gel, tương tác gel, chất enzym Để đạt hiệu suất phản ứng cao nhất, cần lựa chọn phương pháp cố định chất mang phù hợp cho enzym, chất phản ứng thực 26 BÀI TINH CHẾ LYSOZYM BẰNG SẮC KÝ ÁI LỰC 4.1 Tóm tắt lý thuyết 4.1.1 Sắc ký lực kim loại cố định (IMAC) Là phương pháp sắc ký đa dạng mạnh mẽ để tinh chế phân tử cụ thể nhóm phân tử từ hỗn hợp phức tạp Nó dựa tương tác sinh học đặc hiệu cao hai phân tử, chẳng hạn tương tác enzym chất, thụ thể phối tử, kháng thể kháng nguyên Những tương tác này, thường thuận nghịch, sử dụng để tinh chế cách đặt phân tử tương tác, gọi phối tử lực, lên chất rắn để tạo pha tĩnh phân tử đích pha động 4.1.2 Một số ví dụ Sắc ký lực ion kim loại (IMAC) Nguyên tắc IMAC dựa tương tác ion kim loại pha tĩnh sắc ký với chuỗi bên acid có chứa nguyên tố nitơ oxy có cặp electron Các ion kim loại gắn vào pha tĩnh thông qua tạo phức với chất chelat phù hợp Người ta nhận thấy kim loại chuyển tiếp Cu2 +, Ni2 + Zn2 + lực cao với chuỗi bên chứa nitơ sử dụng IMAC để tạo liên kết với vòng imidazole gốc histidine peptid protein Các ion có lực với đoạn peptid có nhiều histidine (polyHistidine), đặc biệt 6-10 histidine Sự giải hấp đại phân tử liên kết thực cách sử dụng ion có nồng độ cao hơn, chẳng hạn imidazole nồng độ > 100mM dung dịch đệm rửa giải, giúp giải phóng phân tử liên kết chúng cạnh tranh với protein cho vị trí liên kết kim loại 27 Hình 4.1 Hình minh họa nguyên tắc sắc kí lực ion kim loại GST Nhựa có lực với enzym Glutathion-S-Transferase Protein đích thơi Glutathion dạng khử có nồng độ > 20 mM 4.1.3 Ưu nhượợ̣c điểm phương pháp sắc kí lực  Ưu điểm: - Hiệu quả, tiết kiệm thời gian - Mức độ tinh chế tinh khiết cao - Ứng dụng rộng rãi, dễ định lượng, kết hợp với HPLC chế hóa - Có thể đưa vào quy trình tự động hóa  Nhượợ̣c điểm - Địi hỏi protein đích phải có nhóm chức mà khơng phải lúc có 4.1.4 Tinh chế enzym amylase tái tổ hợợ̣p E.coli Các protein tái tổ hợp gắn đuôi His-tag biểu E.coli tinh chế sắc kí lực ion kim loại (IMAC) với đồng rửa giải protein vốn có E coli , đặc biệt protein tái tổ hợp thể mức thấp Các chất tạp nhiễm thể lực cao với 28 niken hóa trị hai gắn pha tĩnh, chủ yếu diện gốc histidin vị trí liên kết với kim loại có liên quan mặt sinh học diện chất tạp nhiễm Tuy nhiên lực gốc histidin với ion Ni 2+ pha tĩnh phụ thuộc vào diện số lượng gốc histidin có His-tag mà protein tạp protein đích E.coli sở hữu Sử dụng đệm rửa giải khác thu phân đoạn protein, cụ thể: Dịch A: tất protein nội bào E.coli bao gồm protein tạp khơng có His-tag, protein tạp protein đích có His-tag E.coli Dịch B, B1: Protein tạp không gắn lên cột khơng có His-tag Dịch C: Protein tạp có His-tag E.coli Dịch D: Protein đích E.coli có His-tag Sơ đồ q trình tinh chế ml dịch A (protein tổng E.coli) Đệm chạy H 1X 2.5 ml Dịch C1 Dịch B Dịch B1 Hình 4.1 Hình minh họa trình tinh chế enzym Amylase tái tổ hợp E.coli phương pháp sắc kí lực với ion kim loại 29 4.2 Kết 4.2.1 Kết xác định hàm lượng protein Đường chuẩn BSA Bảng 4.1 Ống n Nồng độ B OD OD (hiệu chỉnh đ ốn Hình 4.1 Đồ thị đường chuẩn BSA 30 Kết tinh chế Bảng 4.2 Hàm lương protein phân đoạn Mẫu chứng OD595 nm Mẫ A59 (=OD595 chứng – OD595 Thể tích (ml) Nồng độ (mg/ml) Độ pha loãng Lượợ̣ng (mg) Mẫu D1 A595 (=OD595 đệm thơi – OD595 thử) Thể tích (ml) Nồng độ (mg/ml) Độ pha loãng Lượng (mg) 0,175 * Cộng tổng mẫu C từ C0 đến C15 **Mẫu gộp D: tổng lượng protein ống D1 đến D8 ,6994  Hiệu suất = 3,0600 x 100% = 22, 86% 0,4 0,120 0,048 31 4.3 Bàn luận Nhận xét hiệu suất tinh chế: Sau tinh chế, enzym Amylase tái tổ hợp E.coli chiếm khoảng 22,86% lượng protein ban đầu Tổng lượng protein hứng 1,144+0,8522+0,114 +0,6994 dung dịch B, B1, C, D so với ban đầu : = 0,92 => 3,0600 H=92%  Vậy nên tồn q trình khơng gây thất lớn lượng enzym sau tinh chế đạt hiệu suất mức trung bình, khơng q thấp Để giải thích cho lời nhận xét phía trên, Nhóm so sánh lượng protein mẫu B, B1, C, D có nhận xét lượng protein mẫu B B1 chiếm lượng tương đối lớn so với mẫu C D, điều chứng tỏ dịch A ban đầu chứa nhiều protein tạp khơng gắn lên cột khơng có His-tag, mặt khác dịch C (theo lí thuyết chứa protein tạp có His-tag) thu sau rửa giải Đệm rửa H 1X chiếm lượng nhỏ so với lượng protein đích có mẫu D => Từ thấy tổng lượng protein tạp E.coli (gồm B, B1, C) chiếm tỉ lệ cao dịch A ban đầu (xấp xỉ 69%) không ảnh hưởng nhiều đến việc tinh chế có protein gắn lên pha tĩnh cạnh tranh với protein đích cần tinh chế, giúp protein đích gắn dễ dàng đặc hiệu với pha tĩnh q trình rửa giải protein đích khơng bị ảnh hưởng protein tạp khác, đặc biệt tạp mẫu dịch C Do hiệu suất tinh chế đạt không thấp (22,86%) đảm bảo mức độ tinh chế tinh khiết cao Mặt khác, điều giải thích lí tổng lượng protein hứng từ B, B1, C, D không bị thất nhiều bắt nguồn từ việc sắc kí lực phù hợp với protein có nhóm chức đặc hiệu, mà có protein gắn lên pha tĩnh trình bày nên đa số rửa giải hoàn toàn khỏi cột => Lượng protein hứng chiếm tỉ lệ cao Tuy nhiên trình tinh chế xảy sai số làm sai lệch đến kết việc nhận định Đầu tiên nhìn vào thơng số thu phân đoạn tinh chế protein (Bảng…) lượng thể tích có sai lệch, chẳng hạn dịch B phải ml thay 0,8 ml; dịch B1 phải 2,5 ml thay 2,4 ml; dịch D1 tới D8 phải 0,5 ml thay 0,4 ml Điều giải thích hứng dịch chảy từ cột dịch vừa ngang mặt thống pha tĩnh cột, Nhóm tiếp tục cho thêm lượng 32 thể tích đệm rửa giải vừa đủ mà không đợi hứng hết dịch cột (để tránh làm khơ cột) Chính cột sắc kí cịn tồn dịch không hứng hết, khiến cho lượng dịch thu cuối khơng đạt đủ thể tích mong muốn dẫn tới hao hụt Vấn đề dẫn tới việc trình tiến hành thu dịch D, lượng nhỏ dịch đọng lại lần hứng trước bị dồn vào chung với lần hứng sau dẫn tới làm cô đặc lượng protein, lượng dịch cho vào cột trì cố định 0,5 ml làm cho lượng protein dịch D2 tới D4 cao bất thường Sai sót thứ hai mà Nhóm đúc kết sai sót thao tác Khi chuẩn bị mẫu đem đo trình hút chuyển dịch eppendorf qn khơng trộn kĩ dịch bên làm nồng độ dịch không đồng dẫn tới sai số Khi cho thuốc thử Bradford vào khơng trộn khơng đợi ổn định mà đem đo làm kết đo quang có sai lệch định Sai sót thứ ba dụng cụ, hóa chất mà cụ thể q trình tinh chế có giai đoạn lắc kiểm tra cịn diện protein hay khơng cách quan sát xuất bọt bền sau lắc, dụng cụ eppendorf, đầu típ cịn dính xà phịng lần vệ sinh nhóm trước không nên hứng nhiều lần eppendorf bọt dẫn tới việc Nhóm tiếp tục hứng dẫn tới việc rửa giải không hiệu 33 ... tinh chế 1,56 lần  Như vậy, sau tinh chế hoạt tính enzym amylase mg protein tăng so với trước tinh chế Quá trình tinh chế amylase alginate đạt hiệu suất cao 21,92%, Sau tinh chế lượng enzym. ..TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH KHOA DƯỢC BỘ MƠN VI SINH – KÍ SINH BÁO CÁO THỰC TẬP CƠNG NGHỆ SINH HỌC DƯỢC Nhóm: 11 - Chiều thứ - Tiểu nhóm: 03 Lê Minh... dịch tinh bột 1% dùng để xác định hoạt độ enzym Amylase 16 Nhóm 11 - Chiều thứ - Tiểu nhóm 03 Hoạt tính enzym Bảng 2.2 Hoạt tính enzym thơ tinh chế Mẫu Enzym thơ Enzym tinh chế Tính: Hiệu suất tinh