tổng trong E.coli) Đệm chạy H 1X 2.5 ml Dịch C1 Dịch B Dịch B1
Hình 4.1. Hình minh họa quá trình tinh chế enzym Amylase tái tổ hợp trong E.coli bằng
Đường chuẩn BSA Bảng 4.1. Ống nghiệm Nồng độ BSA (mg/ml) OD OD (hiệu chỉnh đường nền bằng ống 0) Hình 4.1. Đồ thị
đường chuẩn BSA
Mẫu chứng OD595 nm Mẫu A595 (=OD595 chứng – OD595 thử Thể tích (ml) Nồng độ (mg/ml) Độ pha lỗng Lượợ̣ng (mg) Mẫu D1 A595 0,1758 (=OD595 đệm thơi – OD595 thử) Thể tích 0,4 (ml) Nồng độ 0,1209 (mg/ml) Độ pha 1 lỗng Lượng 0,0484 (mg) * Cộng tổng các mẫu C từ C0 đến C15
**Mẫu gộp D: là tổng lượng protein trong các ống D1 đến D8
trong dung dịch B, B1, C, D so với ban đầu : 1,144+0,8522+0,114 +0,6994 =
0,92 => 3,0600 H=92%
Vậy nên tồn bộ q trình khơng gây thất thốt lớn và lượng enzym sau khi tinh chế đạt được hiệu suất ở mức trung bình, khơng q thấp.
Để giải thích cho lời nhận xét phía trên, Nhóm 3 đã so sánh lượng protein trong các mẫu B, B1, C, D thì có nhận xét là lượng protein trong mẫu B và B1 chiếm một lượng tương đối lớn so với mẫu C và D, điều này chứng tỏ trong dịch A ban đầu chứa khá nhiều protein tạp khơng gắn lên cột do khơng có đi His-tag, mặt khác dịch C (theo lí thuyết sẽ chứa protein tạp có đi His-tag) thu được sau khi rửa giải bằng Đệm rửa H 1X thì chiếm lượng nhỏ hơn so với lượng protein đích có trong mẫu D
=> Từ đây có thể thấy rằng tổng lượng protein tạp trong E.coli (gồm B, B1, C) mặc dù chiếm tỉ lệ khá cao trong dịch A ban đầu (xấp xỉ 69%) nhưng không ảnh hưởng nhiều đến việc tinh chế do có ít protein gắn lên pha tĩnh và cạnh tranh với protein đích cần tinh chế, giúp protein đích gắn dễ dàng và đặc hiệu hơn với pha tĩnh và q trình rửa giải protein đích khơng bị ảnh hưởng bởi các protein tạp khác, đặc biệt là tạp trong mẫu dịch C. Do đó hiệu suất tinh chế đạt được khơng quá thấp (22,86%) và vẫn đảm bảo được mức độ tinh chế tinh khiết cao. Mặt khác, điều này cũng giải thích lí do tại sao tổng lượng protein hứng ra từ B, B1, C, D khơng bị thất thốt nhiều bắt nguồn từ việc sắc kí ái lực chỉ phù hợp với những protein có nhóm chức năng đặc hiệu, mà vì ít có protein gắn lên pha tĩnh như đã trình bày ở trên nên đa số sẽ được rửa giải hoàn toàn ra khỏi cột => Lượng protein được hứng ra chiếm tỉ lệ cao.
Tuy nhiên trong quá trình tinh chế cũng xảy ra những sai số làm sai lệch đến kết quả và việc nhận định. Đầu tiên khi nhìn vào thơng số thu được trong các phân đoạn tinh chế protein (Bảng…) thì lượng thể tích có sự sai lệch, chẳng hạn như dịch B phải là 1 ml thay vì 0,8 ml; dịch B1 phải là 2,5 ml thay vì 2,4 ml; dịch D1 tới D8 phải là 0,5 ml thay vì 0,4 ml. Điều này có thể được giải thích khi hứng dịch chảy từ cột thì khi dịch vừa ngang mặt thống của pha tĩnh trong cột, Nhóm 3 đã tiếp tục cho thêm một lượng
thể tích đệm rửa giải vừa đủ mà khơng đợi hứng hết dịch trong cột (để tránh làm khơ cột). Chính vì thế trong cột sắc kí vẫn cịn tồn một ít dịch và khơng được hứng hết, khiến cho lượng dịch thu được cuối cùng khơng đạt đủ thể tích mong muốn và dẫn tới hao hụt. Vấn đề này cũng dẫn tới việc trong quá trình tiến hành thu dịch D, một lượng nhỏ dịch vẫn còn đọng lại của lần hứng trước bị dồn vào chung với lần hứng sau dẫn tới làm cô đặc lượng protein, lượng dịch cho vào cột vẫn được duy trì cố định là 0,5 ml làm cho lượng protein trong dịch D2 tới D4 cao bất thường.
Sai sót thứ hai mà Nhóm đúc kết được là sai sót về thao tác. Khi chuẩn bị mẫu đem đo hoặc trong quá trình hút chuyển dịch giữa các eppendorf thì qn khơng trộn kĩ dịch bên trong làm nồng độ dịch không đồng nhất dẫn tới sai số. Khi cho thuốc thử Bradford vào thì khơng trộn đều hoặc khơng đợi ổn định mà đem đi đo ngay làm kết quả đo quang cũng có sự sai lệch nhất định.
Sai sót thứ ba là về dụng cụ, hóa chất mà cụ thể là trong q trình tinh chế có giai đoạn lắc kiểm tra cịn sự hiện diện của protein hay khơng bằng cách quan sát sự xuất hiện của bọt bền sau khi lắc, do dụng cụ như eppendorf, đầu típ cịn dính xà phịng do những lần vệ sinh của nhóm trước khơng sạch nên mặc dù đã hứng rất nhiều lần nhưng trong eppendorf vẫn cịn bọt dẫn tới việc Nhóm 3 cứ tiếp tục hứng và dẫn tới việc rửa giải không hiệu quả.