BÁO cáo THỰC tập CÔNG NGHỆ SINH học dược TINH CHẾ ENZYM AMYLASE BẰNG ALGINAT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH KHOA DƯỢC BỘ MƠN VI SINH - KÍ SINH BÁO CÁO THỰC TẬP CƠNG NGHỆ SINH HỌC DƯỢC Nhóm: 11 - Chiều thứ - Tiểu nhóm: 03 Lê Minh Tuấn Tô Thành Trung Phan Văn Quốc Việt Thành phố Hồ Chí Minh 2021 TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH KHOA DƯỢC BỘ MƠN VI SINH - KÍ SINH BÁO CÁO THỰC TẬP CƠNG NGHỆ SINH HỌC DƯỢC Nhóm: 11 - Chiều thứ - Tiểu nhóm: 03 Lê Minh Tuấn Phan Văn Quốc Việt Tơ Thành Trung Thành phố Hồ Chí Minh 2021 MỤC LỤC BÀI CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT 1.1 Tóm tắt lý thuyết 1.2 Kết 1.3 1.4 Nhóm 11 - Chiều thứ - Tiểu nhóm 03 1.5 BÀI CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT 1.1 1.6 Tóm tắt lý thuyết Vi sinh vật sử dụng rộng rãi q trình cơng nghệ ưu dễ nuôi cấy qui mô lớn, tăng trưởng nhanh, sử dụng chất rẻ tiền khả cho nhiều sản phẩm đa dạng Phân lập tuyển chọn giống vi sinh vật từ nguồn gen tự nhiên cải tạo từ việc gây đột biến nhằm tạo giống có hoạt tính, có đặc tính mong muốn khả cạnh tranh cao Bên cạnh việc chọn lọc giống khơng có ý nghĩa chủng khơng bảo quản để sống sót ổn định tính trạng thu 1.1.1 Phân lập giống vi sinh vật chủng từ tự nhiên hay gây đột biến phát dịng vi sinh vật có đặc tính mong muốn 1.7 Phân lập vi sinh vật từ tự nhiên 1.8 Để chọn lọc giống vi sinh vật thích hợp, bước phân lập chúng theo kiểu “săn lùng” từ nguồn tự nhiên mô, xác động vật, thực vật, đất, chất thải, nước thải khu trú định hướng vào nơi sinh sống tự nhiên vi sinh vật lớp bùn trầm tích ao hồ, lò mổ, giếng dầu, 1.9 Nguyên tắc phương pháp • Trước hết chọn kiểm tra sơ địa điểm lấy mẫu để thu mẫu vi sinh vật có đặc tính mong muốn Lấy mẫu (ví dụ thực tập mẫu lấy từ đất), thêm 10 ml PBS, vortex, để lắng pha loãng dịch huyền phù vi sinh vật cấp số 10 đến ống số • Hút 100 pl huyền phù vi sinh vật cấp độ cuối (4, 5, 6), trải lên mơi trường thích hợp ủ nhiệt độ thích hợp (37 °C 24 vi khuẩn, nhiệt độ phòng ngày vi nấm, xạ khuẩn) 1.10 Nhóm 11 - Chiều thứ - Tiểu nhóm 03 1.11 Hình 1.1 Hình minh họa nguyên tắc phân lập vi sinh vật từ mẫu đất 1.12 Các phương pháp đột biến 1.13 Các tác nhân gây đột biến chia thành ba nhóm: - Những tác nhân vật lý: Tia cực tím, tia X (rơnghen), tia Y bắn phá hạt nơtron hay electron - Những tác nhân hoá học: Các hợp chất chứa nitơ như: Nitrozomethylguanidin, methyldicloroetylamin, nitrit, hydroxylamin hay ethylametansunfonat - Những tác nhân sinh học: Gây đột biến Transposon Thông qua tiếp hợp, plasmid mang Transposon (yếu tố Tn) đến tế bào cần gây đột biến chuyển đến vị trí khác nhiễm sắc thể hay plasmid làm gián đoạn gen dẫn đến đột biến 1.14 Để phân lập tăng sinh thể đột biến đạt số cách thông dụng sau - Nuôi cấy môi trường thạch dinh dưỡng chứa chất ức chế kháng sinh, chất độc hay thực khuẩn, thể đột biến kháng chất ức chế mọc - Nuôi cấy môi trường thiếu chất tăng trưởng chứa kháng sinh Penicillin hay chất khác để tiêu diệt tế bào tăng trưởng, thể đột biến khuyết dưỡng không mọc môi trường tối thiểu nên sống sót Sau trải lên mơi trường hồn chỉnh mơi trường có đầy đủ chất dinh dưỡng nên thể đột biến mọc 1.15 giống Thêm với chất môi trường nuôi cấy chất kháng chuyển hóa, có cấu trúc chuyển q trình hóa trao thơng thường nên chất kháng chuyển hóa tham gia vào đổi thường chất, khơng có chức sinh học nên làm tếức bào bình koong chết tế thực bào đầy đủdẫn chức sống dẫn tới tác dụng chế Các biến thể đột khả biến khả sử dụng chất đột không điều sử dụng hịa nên sản xuất vượt mức chất chuyển hóa bình thường nên chất kháng chuyển hóa tới tăng trưởng bình thường Nhóm 11 - Chiều thứ - Tiểu nhóm 03 1.16 Phát dịng vi sinh vật có đặc tính mong muốn 1.17 Bảng 1.1 Bảng trình bày số loại đặc tính vi sinh vật phương pháp sàng lọc 1.18 1.19 Loại hoạt 1.20 Bản chất thay STT đổi tính 1.22 1.23 Amylase ngoại bào 1.26 1.27 Protease ngoại bào 1.25 1.24 Tạo amylase ngoại bào 1.28 Tạo protease ngoại bào 1.30 1.31 Kháng sinh 1.32 Tạo kháng sinh 1.34 1.35 Không di 1.36 Mất tiêm mao tiêm mao không hoạt 1.40 Mất động thay dổi bề mặt nhầy 1.44 Mất thay đổi lớp bên lipopolysaccharide 1.48 Mất nhiều enzym sinh tổng hợp 1.52 Mất enzym phân giải loại đường 1.56 Thay đổi khả thẩm thấu, ngăn cản xâm nhập vào tế bào loại thuốc, phá hủy thuốc 1.60 Mất điểm tiếp nhân virus động 1.38 1.39 Không tạo nha bào 1.42 1.43 Khuẩn lạc xù xì 1.46 1.47 Dinh dưỡng 1.50 1.51 Lên men đường 1.54 1.55 Kháng thuốc 1.58 10 1.62 11 1.59 Kháng virus 1.63 Nhạy cảm 1.64 Thay đổi protein với nhiệt độ bình thường thiết yếu làm tăng nhạy cảm với nhiệt độ.các enzym có 1.68 Mất khả tham gia tổng hợp sắc tố 1.66 1.67 Mất sắc tố 12 1.70 1.21 Dấu phát Thủy phân tinh bột môi trường nên tinh bột khơng tạo màu tím với lugol Xung quanh khóm khuẩn có vịng sáng 1.29 Thủy phân gelatine mơi trường nên gelatine không bị tủa tráng lên môi trường TCA Xung quanh khóm khuẩn có1.33 vịng sáng Có khả ức chế tăng trưởng vi sinh vật khác cách tạo vùng ức chế xung qunah cấy lạc mọc dính vào 1.37 lỗKhuẩn 1.41 Khuẩn lạc bé, xù xì 1.45 Khuẩn lạc nhiều hạt nhỏ, không 1.49 Không mọc môi trường tổng hợp tối thiểu 1.53 Không tạo biến đổi màu môi trường đặc trưng với chất thị màu 1.57 Mọc mơi trường có thuốc nồng độ mà bình thường gây ức chế phát triển vi sinh vật 1.61 Phát triển môi trường nuôi cấy có mặt virus nồng độ cao 1.65 Phát triển có nhiệt độ thấp có thể, khơng phát triển nhiệt độ bình 1.69 thường Có màu khác màu Nhóm 11 - Chiều thứ - Tiểu nhóm 03 1.71 Phương pháp “sàng lọc” cho phép nhanh chóng xác định khả sinh enzym phù hợp với yêu cầu sản xuất qui mô lớn cơng nghiệp hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, virus kháng ung thư chủng phân lập Để xác định khả sinh enzym, phương pháp áp dụng trải vi khuẩn lên mơi trường có chứa chất cảm ứng sử dụng thị thích hợp để phát Phương pháp chủ yếu sử dụng việc tìm chủng sản xuất chất kháng sinh thường dùng hai kiểu kỹ thuật: • Lấy mẫu thử để khảo sát tác dụng với nhiều chủng kiểm định • Lấy nhiều mẫu thử để khảo sát tác dụng với chủng kiểm định 1.72 Đối với thực tập sử dụng chủng Bacillus khảo sát tác dụng với chủng thử nghiệm Staphylococcus E coli 1.1.2 Kỹ thuật bảo quản giống vi sinh vật 1.73 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật: (thời gian cấy truyền tuần - tháng) - Cấy truyền môi trường dịch thể - Cấy truyền môi trường thạch > Ưu điểm: đơn giản, dễ làm > Nhược điểm: tốn công sức, môi trường thời gian: không ổn định 1.74 Phương pháp giữ giống môi trường thạch lớp dầu khoáng: vaselin, parafin, 1.75 (giữ chủng 1- nhiều năm) - Đơn giản, hiệu cao - Môi trường không bị nước - Vi sinh vật bảo quản lâu so với cấy truyền vi sinh vật 1.76 Giữ giống vi sinh vật môi trường đất, cát hạt - Bảo quản vi sinh vật tạo bào tử - Thời gian bảo quản 1- nhiều năm 1.77 Phương pháp đông lạnh - Phương pháp đơn giản - Vi sinh vật giữ lâu tháng - 10 năm Nhóm 11 - Chiều thứ - Tiểu nhóm 03 1.78 Phương pháp đơng khơ vi sinh vật phương pháp đông khô trực tiếp - Làm cho tế bào nước theo phương pháp thăng hoa áp suất thấp - Làm giảm làm ngừng trình phân chia vi sinh vật - Vi sinh vật không bị biến đổi đặc tính di truyền - Thời gian lưu giữ lâu tới vài chục năm - Được dùng nhiều sản xuất 1.2 Kết 1.2.1 Phát vi sinh vật sinh enzym amylase protease 1.79 • Hình ảnh đĩa phân lập phát khả sinh enzym 1.80 1.81 -4 lỗng 10 1.82 1.83 Hình 1.1 Mơi trường phát mức pha Môi trường phát mức pha Mơi trường phát mức pha lỗng 10-5 lỗng 10-6 Khuẩn lạc phân lập mơi trường thạch tinh bột tương ứng cấp độ pha lỗng Nhóm 11 - Chiều thứ - Tiểu nhóm 03 1.84 1.85 Mơi trường phát mức pha Môi trường phát mức pha Môi trường phát mức pha loãng 10-5 loãng 10-6 -4 lỗng 10 1.86 1.87 Hình 1.2 Khuẩn lạc phân lập môi trường thạch gelatin tưong ứng cấp độ pha lỗng 1.88 • Đĩa phân lập Amylase ngoại bào thạch tinh bột Protease ngoại bào thạch 1.89 gelatin 1.90 Phát Amylase ngoại bào 1.92 1.91 1.93 Hình 1.3 Đĩa thạch tinh bột màu tím than sau tráng bề mặt với dung dịch1.94 Lugol dùng để Amylase ngoại bào phát 1.95 Phát Protease ngoại bào 1.96 1.97 Hình 1.4 Đĩa thạch gelatin bị đục sau tráng bề mặt với TCA 50% dùng để phát Protease 1.98 ngoại bào 1.2.2 1.99 1.100 Phát vi sinh vật có khả sinh kháng sinh Mặt trước Hình 1.1 Mặt sau Kiểm tra khả sinh kháng sinh chủng Bacillus B1, B2, B3, B4 kí hiệu tương ứng đĩa 1, 2, 3, đĩa thạch trải Staphylococcus 1.399 => Chọn nồng độ 0,4796 mg/ml giá trị nằm khoảng tuyến tính đồ thị Tuy nhiên lượng mẫu hút từ dịch gộp theo phương pháp bắt giữ ban đầu thực tập 800 IIÌ nhiều gấp 16 lần lượng mẫu hút từ enzym ban đầu (50 pl) => nồng độ enzym không cố định theo bắt giữ 0,4796 16 = 0,0299 (mg/ml) 1.400 1.401 Lượng protein có ml enzym : 1.402 Pro mg protein/ml bắt giữ n X * 0,0299 = 0,1499 (mg/ml) 1.403 Lượng protein mẫu dịch gộp theo phương pháp bắt giữ 1.404 m protein không cố định bắt giữ m1 Promg protein/ml bắt giữ x Vgộp > Lượng protein cố định : m pr cố định bắt giữ =m- = 0,1499 X 42 = 6,2948 (mg) m1 = 42,2452 (mg) > Hiệu suất cố định protein: H% = m / mpr ban đầu =42,2452 / 48,54 = 87,03% 1.405 OD595 nm enzym cố định không theo hấp phụ đo lần có giá trị 0,6581 0,6525 => On 1.406 1.407 pr cố định = 0,6581+0,6525 > OD 595 nm tb/enzyme ban đầu 0,6553 1.408 => Từ phương trình bậc đồ thị đường chuẩn BSA ta có hai nghiệm ứng với nồng độ protein 1,8789 mg/ml 0,5449 mg/ml 1.409 => Chọn nồng độ 0,5449 mg/ml giá trị nằm khoảng tuyến tính đồ thị Tuy nhiên lượng mẫu hút từ dịch gộp theo phương pháp bắt giữ ban đầu thực tập 800 IIÌ nhiều gấp 16 lần lượng mẫu hút từ enzym ban đầu (50 pl) => nồng độ enzym = 0,0341 (mg/ml) không cố định theo bắt giữ 0,5449 16 1.410 1.411 Lượng protein có ml enzym : 1.412 Pro mg protein/ml hấp phụ n X = 10 * 0,0341 = 0,3406 (mg/ml) 1.413 Lượng protein mẫu dịch gộp theo phương pháp hấp phụ 1.414 m m protein không cố định hấp phụ mg protein/ml hấp phụ x Vgộp Pro 1.415 > Lượng protein cố định : mpr cố định hấp phụ = m - m2 = 35,2581 (mg) 1.416 72,64% > = 0,3406 X 39 = 13,2819 (mg) Hiệu suất cố định protein: H% = mpr cố định / mpr ban đầu = 35,2581 / 48,54 = 3.2.2 Hoạt tính enzym 1.417 Đường chuẩn CD y = 0,Ũ457x + 0,Ũ327 Đ thị 1.418 đường chuẩn PCD số đường chuẩn CD 1.419 Bảng 3.1 Thông 1.420 Số thứ tự 1.421 1.422 1.423 1.424 1.425 1.426 1.427 Nồng độ CD (mg) 1.428 1.429 1.430 1.431 1.432 1.433 10 1.434 OD550 1.441 AOD550 = ODchứng 1.448 ODthử 1.435 1.436 ,7050 ,5732 1.442 1.443 ,1318 1.437 1.438 ,4632 ,3804 1.444 1.445 ,2418 ,3246 1.439 1.440 0, ,2891 2525 1.446 1.447 0, ,4159 4525 1.449 Hoạt tính enzym 1.452 O D550 1.453 c hứng 1.461 ,8219 1.468 ,8427 1.451 Mầu 1.450 Bảng 3.2 Hoạt tính enzym 1.454 O 1.457 L 1.458 Hoạt 1.456 A D550 ượng CD tính 1.455 t OD chung (rng) 1.462 0, 1.463 1.464 1,0 (U/mL) 1.465 70,63 7434 ,0785 022 96 1.469 0, 1.470 1.471 1,6 1.472 16,49 7330 ,1097 849 44 1.459 H oạt tính riêng (U/mg protein) 1.466 1,4553 1.460 Enzym ban đầu 1.467 Enzym 1.473 0,4678 cố định theo hấp phụ 1.475 1.476 0, 1.477 1.478 4,0 1.479 39,82 1.474 Enzym 1.480 0,9426 cố1.481 định ,8044 5858 ,2186 678 18 theo bắt giữ 1.482 1.483 ^ Hiệu suất cố định protein tỉ lệ hoạt tính enzym theo phương pháp bắt giữ hấp phụ 1.484 1.485 Phương pháp bắt giữ 1.486 Phương pháp hấp phụ 1.487 Hiệu suất cố định 1.492 Tỉ lệ hoạt tính 1.497 1.488 42 ,2452 x 0,9426 1.490 35,2581 x 0,4678 1.498 1.493 x 100 1.495 Nhận xét hiệu suất cố định và tỉ lệ hoạt tính riêng enzym 1.499 Hiệu suất cố định protein hai phương pháp có chênh lệch Phương pháp bắt giữ có x 100 hiệu suất cố định protein cao so với phương pháp hấp phụ, gấp 1,2 lần 1.500 Tỉ lệ hoạt tính riêng theo phương pháp bắt giữ cao phương pháp hấp phụ, gấp lần 1.501 Vậy cố định enzyme phương pháp bắt giữ cho hiệu suất cố định tỉ lệ hoạt enzyme cao so với phương pháp hấp phụ 1.502 3.3 Bàn luận tính 1.503 Hiệu suất cố định protein phương pháp bắt giữ đạt cao (87,03%), phương pháp cố định enzym không thuận nghịch, enzym khơng thể khỏi chất mang gel alginat sau cố định Còn phương pháp hấp phụ, dựa tương tác bề mặt gel enzym liên kết hydro, lực Van der Waals, cầu nối ion, tương tác kỵ nước nên enzym quay trở lại mơi trường, cố định thuận nghịch, hiệu suất cố định đạt 72,64% Tuy nhiên hiệu suất cố định enzymtheo phương pháp bắt giữ tương đối cao cho thấy trình cố định hiệu Điều giải thích thơng qua việc enzym CGTase hấp phụ lên lỗ trống bề mặt enzym, đồng thời tương tác với gel alginat chủ yếu đa số lực liên kết bền mạnh chẳng hạn lực liên kết ion, điều diễn nhờ nhóm chức diện bên cấu trúc enzym gel, chứng tỏ enzym gel có mức độ tương thích tương đối cao 1.504 hấp Khi nhìn vào thơng số hoạt tính enzym cố định theo phương pháp phụ bắt giữ, Nhóm nhận thấy hoạt tính chung riêng enzym theo phương pháp bắt giữ cao so với phương pháp hấp phụ Theo lí thuyết, phương pháp bắt giữ, không thay đổi cấu trúc enzym cản trở mặt không gian nên enzym cố định phương pháp bắt giữ khó tiếp xúc với chất, enzym nằm bề mặt hạt gel dễ dàng gặp chất Từ thấy trình tạo hạt gel phương pháp bắt giữ, kích thước lỗ hạt gel đủ để phân tử chất qua lỗ bề mặt hạt gel vào bên trong, tương tác với enzym tạo thành sản phẩm Nhờ tỉ lệ hoạt tính enzyme theo phương pháp bắt giữ cao xấp xỉ 64,77% so với enzym ban đầu khơng cố định Thêm vào đó, phương pháp bắt giữ cố định enzym hiệu nhiều so với theo phương pháp hấp phụ nên hoạt tính riêng enzym theo phương pháp bắt giữ nhìn chung cao (do nhiều enzym cố định dẫn tới tạo nhiều sản phẩm hơn) 1.505 Còn phương pháp hấp phụ, theo lí thuyết enzym nằm bề mặt hạt gel, khả chất tới tương tác với enzym cao nhiều so với phương pháp bắt giữ, enzym hấp phụ với bề mặt gel liên kết yếu nên thường không làm thay đổi cấu trúc phân tử enzym nên hoạt tính cao Nhưng thực tế thực nghiệm hoạt tính chung riêng enzym theo phương pháp hấp phụ thấp nhiều so với phương pháp bắt giữ Điều giải thích thơng qua hai lí Lí thứ Nhóm trình bày trên, enzym tương tác với bề mặt gel đa số lực liên kết bền mạnh nên có thay đổi nhỏ cấu trúc enzym, dẫn tới giảm hoạt tính enzym nên tạo sản phẩm hơn, tỉ lệ hoạt tính so với enzym ban đầu thấp nhiều so với phương pháp bắt giữ, bù lại hiệu suất cố định lượng enzym cố định hiệu xấp xỉ so với phương pháp Lí thứ hai hiệu suất cố định cao thấp nhiều so với phương pháp bắt giữnên hoạt tính riêng thấp hon lượng enzym cố định thấp so với phương pháp bắt giữ (35,2581 mg cố định theo hấp phụ so với 42,2452 mg cố định theo bắt giữ) Kết luận: Trong hai phương pháp cố định phương pháp bắt giữ chiếm hiệu cao nhiều so với phương pháp hấp phụ Tuy nhiên, hiệu việc cố định enzym hoạt tính enzym đạt cịn phụ thuộc vào thành phần tính chất gel, tương tác gel, chất enzym Để đạt hiệu suất phản ứng cao nhất, cần lựa chọn phương pháp cố định chất mang phù hợp cho enzym, chất 3 phản ứng thực 1.506 BÀI TINH CHẾ LYSOZYM BẰNG SẮC KÝ ÁI Lực 4.1 Tóm tắt lý thuyết 4.1.1 Sắc ký lực kim loại cố định (IMAC) 1.507 Là phương pháp sắc ký đa dạng mạnh mẽ để tinh chế phân tử cụ thể nhóm phân tử từ hỗn hợp phức tạp Nó dựa tương tác sinh học đặc hiệu cao hai phân tử, chẳng hạn tương tác enzym chất, thụ thể phối tử, kháng thể kháng nguyên Những tương tác này, thường thuận nghịch, sử dụng để tinh chế cách đặt phân tử tương tác, gọi phối tử lực, lên chất rắn để tạo pha tĩnh phân tử đích pha động 4.1.2 Một số ví dụ 1.508 Sắc ký lực ion kim loại (IMAC) 1.509 Nguyên tắc IMAC dựa tương tác ion kim loại pha tĩnh sắc ký với chuỗi bên acid có chứa nguyên tố nitơ oxy có cặp electron Các ion kim loại gắn vào pha tĩnh thông qua tạo phức với chất chelat phù hợp Người ta nhận thấy kim loại chuyển tiếp Cu2 +, Ni2 + Zn2 + lực cao với chuỗi bên chứa nitơ sử dụng IMAC để tạo liên kết với vòng imidazole gốc histidine peptid protein Các ion có lực với đoạn peptid có nhiều histidine (polyHistidine), đặc biệt 6-10 histidine 1.510 Sự giải hấp đại phân tử liên kết thực cách sử dụng ion có nồng độ cao hơn, chẳng hạn imidazole nồng độ > 100mM dung dịch đệm rửa giải, giúp giải phóng phân tử liên kết chúng cạnh tranh với protein cho vị trí liên kết kim loại 1.511 1.512 Hình 4.1 Hình minh 1.513 họa ngun tắc sắc kí lực ion kim loại 1.514 1.515 GST 1.516 Nhựa có lực với enzym Glutathion-S-Transferase Protein đích thơi Glutathion dạng khử có nồng độ > 20 mM 4.1.3 Ưu nhược điểm phương pháp sắc kí lực > Ưu điểm: - Hiệu quả, tiết kiệm thời gian - Mức độ tinh chế tinh khiết cao - Ứng dụng rộng rãi, dễ định lượng, kết hợp với HPLC chế hóa - Có thể đưa vào quy trình tự động hóa > Nhược điểm - Địi hỏi protein đích phải có nhóm chức mà khơng phải lúc có 4.1.4 Tinh chế enzym amylase tái tổ hợp E.coli 1.517 Các protein tái tổ hợp gắn đuôi His-tag biểu E coli tinh chế sắc kí lực ion kim loại (IMAC) với đồng rửa giải protein vốn có E coli , đặc biệt protein tái tổ hợp thể mức thấp Các chất tạp nhiễm thể lực cao với 1.518 niken hóa trị hai gắn pha tĩnh, chủ yếu diện gốc histidin vị trí liên kết với kim loại có liên quan mặt sinh học diện chất tạp nhiễm Tuy nhiên lực gốc histidin với ion Ni 2+ pha tĩnh phụ thuộc vào diện số lượng gốc histidin có His-tag mà protein tạp protein đích E coli sở hữu 1.519 Sử dụng đệm rửa giải khác thu phân đoạn protein, cụ thể: 1.520 Dịch A: tất protein nội bào E.coli bao gồm protein tạp khơng có His- tag, protein tạp protein đích có His-tag E coli 1.521 Dịch B, B1: Protein tạp không gắn lên cột His-tag 1.522 Dịch C: Protein tạp có His-tag E.coli 1.523 Dịch D: Protein đích E.coli có His-tag 1.524 Sơ đồ q trình tinh chế 1.525 ml dịch A (protein tổng E.coli) Đệm chạy H 1X Đệm rửa H 1X 2.5 ml 0.5 ml Dịch C1 Đệm rửa H 1X (n lần, tối đa 15 lần) 0.5 ml Lắc kiểm tra protein Đệm H 1X (n lần, tối đa 12 lần) 0.5 ml Bảo quản cột 1ml 24% ethanol Dịch Cn Gộp thành dịch C Dịch B 1.526 1.527 Tái cân cột 2.5 ml Đệm chạy H 1ml 24% ethanol Dịch D1 Dn Dịch B1 Hình 4.1 Hình minh họa trình tinh chế enzym Amylase tái tổ hợp E coli phưong pháp sắc 1.528 kí lực với ion kim loại 4.2 Kết 4.2.1 Kết xác định hàm lượng protein 1.529 Đường chuẩn BSA y = -0,6431x2 + l,5588x - 0,0032 Hình 4.1 Đồ thị Nòng độ BSA (mg/ml) đường chuẩn BSA 1.530 1.532 Ống nghiệm 1.533 1.539 Nồng độ BSA (mg/ml) 1.540 1.548 OD595 nm 1.549 1.550 0, 1.551 00 1.552 1.561 OD595 nm (hiệu chỉnh đường 1.568 ống 0) 1.562 1.531 Bảng 4.1 Thông số đường chuẩn BSA 1.534 1.535 1.536 1.537 1.538 1.541 1.543 0 1.545 1.546 1.547 ,6 ,8 ,0 1.542 1.544 1.553 1.554 0 , 1.555 1.558 1.559 1.560 ,6891 ,8404 ,8967 1.556 1.563 1.564 1.565 1.566 1.567 0,281 ,5115 ,6970 ,8483 ,9046 1.569 Kết tinh chế 1.570 1.571 Mầu chứng595 nm 1.575 OD 1.579 1.580 Bảng 4.2 Hàm lượng protein phân đoạn 1.572 Đệm chạy 1.576 0,4903 1.581 Mầu 1.586 A595 1.587 (=ODs95 chứng — OD595tích thử) 1.592 Thể (ml) 1.597 Nồng độ (mg/ml) 1.602 Độ pha loãng 1.607 Lượng (mg) 1.612 1.573 Đệm rửa 1.577 0,4902 1.574 Đệm 1.578 0,4794 1.582 A 1.583 B 1.584 B1 1.585 C1 1.588 0,4136 1.589 0,2066 1.590 0,4692 1.591 0,1116 1.593 1.594 0,8 1.595 2,4 1.596 1,5 1.598 0,3060 1.603 10 1.599 0,1430 1.604 10 1.600 0,3551 1.605 1.601 0,0760 1.606 1.608 3,0600 1.609 1,144 1.610 0,8522 1.611 0,1140 1.613 1.614 M 1.615 1.616 1.617 1.618 D 1.619 1.620 D 1.621 D 1.622 D 1.623 M ầu D1 D2 D3 D5 ầu gộp 1.624 A5 1.628 1.629 1.630 1.632 1.633 1.635 1.636 1.637 D 1.638 95 0,1758 0,5263 0,539 ,3489 0,280 ,2039 ,1651 ,1367 1.625 (= 1.631 1.634 OD595 1.626 đệm 1.648 1.639 T 1.640 1.641 1.642 1.643 1.644 1.645 1.646 1.647 0,4 0,4 0,4 ,4 0,4 ,4 ,4 ,4 hể tích 1.658 1.649 N 1.650 1.651 1.652 1.653 1.654 1.655 1.656 1.657 (ml) 0,1209 0,4085 ,2521 ,1411 ,1133 ,0933 ồng độ 0,421 0,198 (mg/ml) 1.660 1.661 31.662 31.664 1.668 1.659 Đ 1.663 1.665 1.666 1.667 1 1 ộ pha loãng 1.669 L 1.670 1.671 1.672 1.674 1.675 1.676 1.677 1.678 1.679 0,6 0,0484 0,1634 0,168 ,1008 ,0453 ,0373 994 ượng 0,079 ,0564 1.680 1.673 (mg) Cộng tổng mẫu C từ Co đến C15 2Mầu gộp D: tổng lượngprotein ống D1 đến Ds > Hiệu suất = 0’6994 x 100% = 22, 86% • 3,UbUU 4.3 Bàn luận 1.681 _Nhận xét hiệu suất tinh chế: Sau tinh chế, enzym Amylase tái tổ hợp E.coli chiếm khoảng 22,86% lượng protein ban đầu Tổng lượng protein hứng ™ , 1,144+0,8522 +0,114 +0,6994 _ 1.682 dung dịch B, B1, C, D so với ban đầu : _ -= 0,92 => 1.683 ’ 3,0600 1.684 H=92% 1.685 > Vậy nên tồn q trình khơng gây thất thoát lớn lượng enzym sau tinh chế đạt hiệu suất mức trung bình, khơng q thấp 1.686 Để giải thích cho lời nhận xét phía trên, Nhóm so sánh lượng protein mẫu B, B1, C, D có nhận xét lượng protein mẫu B B1 chiếm lượng tương đối lớn so với mẫu C D, điều chứng tỏ dịch A ban đầu chứa nhiều protein tạp khơng gắn lên cột khơng có His-tag, mặt khác dịch C (theo lí thuyết chứa protein tạp có His-tag) thu sau rửa giải Đệm rửa H 1X chiếm lượng nhỏ so với lượng protein đích có mẫu D 1.687 => Từ thấy tổng lượng protein tạp E.coli (gồm B, B1, C) chiếm tỉ lệ cao dịch A ban đầu (xấp xỉ 69%) không ảnh hưởng nhiều đến việc tinh chế có protein gắn lên pha tĩnh cạnh tranh với protein đích cần tinh chế, giúp protein đích gắn dễ dàng đặc hiệu với pha tĩnh q trình rửa giải protein đích khơng bị ảnh hưởng protein tạp khác, đặc biệt tạp mẫu dịch C Do hiệu suất tinh chế đạt không thấp (22,86%) đảm bảo mức độ tinh chế tinh khiết cao Mặt khác, điều giải thích lí tổng lượng protein hứng từ B, B1, C, D khơng bị thất nhiều bắt nguồn từ việc sắc kí lực phù hợp với protein có nhóm chức đặc hiệu, mà có protein gắn lên pha tĩnh trình bày nên đa số rửa giải hoàn toàn khỏi cột => Lượng protein hứng chiếm tỉ lệ cao 1.688 Tuy nhiên trình tinh chế xảy sai số làm sai lệch đến kết việc nhận định Đầu tiên nhìn vào thơng số thu phân đoạn tinh chế protein (Bảng ) lượng thể tích có sai lệch, chẳng hạn dịch B phải ml thay 0,8 ml; dịch B1 phải 2,5 ml thay 2,4 ml; dịch D1 tới D8 phải 0,5 ml thay 0,4 ml Điều giải thích hứng dịch chảy từ cột dịch vừa ngang mặt thống pha tĩnh cột, Nhóm tiếp tục cho thêm lượngthể tích đệm rửa giải vừa đủ mà không đợi hứng hết dịch cột (để tránh làm khơ cột) Chính cột sắc kí cịn tồn dịch khơng hứng hết, khiến cho lượng dịch thu cuối không đạt đủ thể tích mong muốn dẫn tới hao hụt Vấn đề dẫn tới việc trình tiến hành thu dịch D, lượng nhỏ dịch đọng lại lần hứng trước bị dồn vào chung với lần hứng sau dẫn tới làm cô đặc lượng protein, lượng dịch cho vào cột trì cố định 0,5 ml làm cho lượng protein dịch D2 tới D4 cao bất thường 1.689 Sai sót thứ hai mà Nhóm đúc kết sai sót thao tác Khi chuẩn bị mẫu đem đo trình hút chuyển dịch eppendorf qn khơng trộn kĩ dịch bên làm nồng độ dịch không đồng dẫn tới sai số Khi cho thuốc thử Bradford vào khơng trộn không đợi ổn định mà đem đo làm kết đo quang có sai lệch định 1.690 Sai sót thứ ba dụng cụ, hóa chất mà cụ thể q trình tinh chế có giai đoạn lắc kiểm tra cịn diện protein hay không cách quan sát xuất bọt bền sau lắc, dụng cụ eppendorf, đầu típ cịn dính xà phịng lần vệ sinh nhóm trước khơng nên hứng nhiều lần eppendorf cịn bọt dẫn tới việc Nhóm tiếp tục hứng dẫn tới việc rửa giải không hiệu ...TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH KHOA DƯỢC BỘ MƠN VI SINH - KÍ SINH BÁO CÁO THỰC TẬP CƠNG NGHỆ SINH HỌC DƯỢC Nhóm: 11 - Chiều thứ - Tiểu nhóm: 03 Lê Minh... Mức tinh chế = HTRemzym tinh chế / HTRemzym thô = 15,85 / 10,185 = 1,56 1.323 Nhận xét hiệu suất tinh chế mức tinh chế 1.324 Quá trình tinh chế amylase alginate đạt hiệu suất cao 21,92 %, Sau tinh. .. enzym sau tinh chế = 10,2028 (mg) > Như vậy, trình tinh chế giúp loại lượng protein, các protein khơng phải enzym amylase, Nhờ mẫu dịch enzym amylase sau tinh chế tinh khiết so với mẫu dịch enzym