595 nm tb/enzyme ban đầ u2 0,
4.1.3. Ưu và nhược điểm của phương pháp sắc kí ái lực >Ưu điểm:
> Ưu điểm:
- Hiệu quả, tiết kiệm thời gian - Mức độ tinh chế tinh khiết cao
- Ứng dụng rộng rãi, dễ định lượng, có thể kết hợp với HPLC chế hóa - Có thể đưa vào quy trình tự động hóa
> Nhược điểm
- Đòi hỏi protein đích phải có nhóm chức năng nào đó mà không phải lúc nào cũng có được
4.1.4. Tinh chế enzym amylase tái tổ hợp trong E.coli
chế bằng sắc kí ái lực ion kim loại (IMAC) với sự đồng rửa giải các protein vốn có của E. coli , đặc biệt
1.518.. niken hóa trị hai gắn trên pha tĩnh, chủ yếu do sự hiện diện của các gốc histidin
hoặc các vị trí
liên kết với kim loại có liên quan về mặt sinh học hiện diện trên các chất tạp nhiễm này. Tuy nhiên ái lực của các gốc histidin này với ion Ni2+ trên pha tĩnh phụ thuộc vào sự hiện diện cũng như số lượng gốc histidin có trong đuôi His-tag mà các protein tạp hoặc protein đích của E. coli sở hữu.
1.519.. Sử dụng các đệm rửa giải khác nhau thu được các phân đoạn protein, cụ thể:
1.520.. Dịch A: tất cả protein nội bào của E.coli bao gồm protein tạp không có đuôi His-
tag, protein
tạp và protein đích đều có đuôi His-tag của E. coli.
1.521.. Dịch B, B1: Protein tạp không gắn lên cột do không có đuôi His-tag 1.522.. Dịch C: Protein tạp có đuôi His-tag của E.coli
1.523.. Dịch D: Protein đích của E.coli có đuôi His-tag 1.524.. Sơ đồ quá trình tinh chế
1.525..1 ml dịch A (protein tổng trong E.coli)
1.526..
1.527.. Hình 4.1. Hình minh họa quá trình tinh chế enzym Amylase tái tổ hợp trong E coli bằng phưong pháp sắc
1.528.. kí ái lực với ion kim loại
Đệm chạy H 1X 2.5 ml Đệm rửa H 1X 0.5 ml Đệm rửa H 1X (n lần, tối đa 15 lần) 0.5 ml Đệm thôi H 1X (n lần, tối đa 12 lần) 0.5 ml Bảo quản cột trong 1ml 24% ethanol Tái cân bằng cột bằng 2.5 ml Đệm chạy H và 1ml 24% ethanol Dịch B Dịch B1
Dịch C1 Lắc kiểm traprotein Dịch Cn
4.2. Kết quả