BÁO cáo THỰC tập CHUYÊN NGÀNH SINH học ĐỘNG vật CHỦ đề ĐÁNH GIÁ sự TƯƠNG hợp SINH học của vật LIỆU TRÊN mô HÌNH ĐỘNG vật

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO THỰC TẬP CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC ĐỘNG VẬT CHỦ ĐỀ ĐÁNH GIÁ SỰ TƯƠNG HỢP SINH HỌC CỦA VẬT LIỆU TRÊN MƠ HÌNH ĐỘNG VẬT Nhóm I-2 Thành viên nhóm: Tạ Gia Bảo – 18150075 Lê Thị Kiều Duyên – 18150099 Trương Triệu Mỹ Duyên – 18150104 Trương Gia Hưng – 18150147 TP Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 08 năm 2021 MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tính tương hợp vật liệu ghép 1.2 Sự thải loại cấy ghép 1.3 Đánh giá tính tương hợp sinh học vật liệu PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 2.2 Phương pháp tiến hành 2.2.1 Bố trí thí nghiệm 2.2.2 Phương pháp cấy ghép vật liệu 2.2.3 Phương pháp xác định số lượng bạch cầu tổng PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết 3.2 Biện luận PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận 4.2 Kiến nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO BẢNG THUẬT NGỮ CHUYÊN NGÀNH MỞ ĐẦU Việc tạo vật liệu thay phục vụ cho nhu cầu y học trình đánh giá tương thích hay khơng loại vật liệu thể động vật trước đưa vào sử dụng bệnh nhân quy trình quan trọng Vì vậy, chủ đề “Đánh giá tương hợp sinh học vật liệu mơ hình động vật” đưa vào chương trình giảng dạy điều thực cần thiết Mục tiêu học giúp cho sinh viên hiểu tầm quan trọng việc tạo mô hình động vật để đánh giá độ tương hợp vật liệu Từ đưa kết đến kết luận cuối nghiên cứu PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tính tương hợp vật liệu ghép Vật liệu có tính tương hợp sinh học không gây độc, không gây dị ứng, không làm thay đổi cấu trúc protein, không tạo phản ứng miễn dịch, không gây ung thư hay đột biến, không gây sốc phản vệ sau cấy ghép vật liệu vào thể thời gian dài Việc tương hợp sinh học xảy tiêu chí quan trọng dẫn đến thành cơng cấy ghép lâm sàng [5] Qua nghiên cứu nhận thấy vật liệu sau ghép vào thể xảy phản ứng hóa học cách tối thiểu mang lại hiệu [9] Do việc đáp ứng sinh học vật liệu phụ thuộc ba yếu tố: thành phần cấu trúc vật liệu, đặc điểm vật liệu, chức vật liệu [1] 1.2 Sự thải loại cấy ghép Cấy ghép đưa vật liệu có chức sinh lý bình thường vào thể người bệnh thay cho mô, quan nội tạng bị tổn thương đưa lên mơ hình động vật dùng nghiên cứu [1] Dựa vào nguồn gốc vật ghép chia thành syngeneic, allogeneic xenogeneic [2] Sự thải ghép xảy khác mặt di truyền gene mã hoá cho cho phân tử major histocompatibility complex (MHC), antibody (Ab) antigene (Ag), gene khác người với người với loài khác [8] 2 Khi đưa vật ghép vào thể sống chúng nhận diện vật ghép Ag lạ hình thành màng bao quanh, qua thời gian nhận diện vật ghép an toàn hợp với thể, xảy bất thường thải loại [6] Cơ huy động lượng lớn antigene presenting cell, T helper cell, cytotoxic T cell, B cell, macrophage, monocyte,…đến công vật ghép Tuỳ thuộc vào thời gian thải loại phát sinh, mức độ loại tế bào miễn dịch người ta chia thành hyperacute rejectionacute rejection chronic rejection [4, 7, 10] 1.3 Đánh giá tính tương hợp sinh học vật liệu Vật liệu sinh học thiết kế phải có khả tăng cường chức tế bào sau ghép kích thích phát triển mô tự thân Nếu không đạt yêu cầu thử nghiệm tiên vật liệu khơng đánh giá tính tương hợp sinh học Các cách đánh giá tính tương hợp sinh học qua mơ hình động vật: thử nghiệm khơng chức (vật liệu ghép mô mềm thông qua tiểu phẫu), thử nghiệm ex vivo (vật liệu thu từ thể qua thử nghiệm vật liệu đưa lại thể động vật), thử nghiệm chức (ghép vật liệu có chức năng) [3] PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Dụng cụ: buồng đếm hồng cầu (1); lamelle; đèn cồn; khay mổ (1); kẹp gắp (2); kéo (2); bercher 50mL; đĩa petri (1); kim khâu sinh học; bơng gịn thấm; eppendorf 1,5mL; micropipette; đầu tip; kim tiêm; pipette pha loãng hồng cầu; dao lam Hóa chất: dung dịch ly giải hồng cầu; thuốc gây mê (0,11ml); thuốc sát trùng Povidine (Pharmedic) Thiết bị: kính hiển vi quang học (Euromex – Hà Lan) Mẫu vật: chuột nhắt trắng (Mus musculus var Albino) trọng lượng 44g 2.2 Phương pháp tiến hành 2.2.1 Bố trí thí nghiệm 3 Ngày thứ (đếm bạch cầu tổng): chuẩn bị dụng cụ theo danh sách vật liệu liệt kê Sau đó, đếm ghi nhận lượng bạch cầu tổng để theo dõi phản ứng viêm Ngày thứ (ghép vật liệu): Cân ghi nhận trọng lượng chuột trước cấy ghép vật liệu Sau đó, tiến hành thao tác chuột để ghép vật liệu theo yêu cầu nhóm Cuối cùng, chăm sóc chuột theo quy định quan sát Ngày thứ 10 (đếm bạch cầu tổng quan sát đại thể): xác định lượng bạch cầu tổng cân trọng lượng chuột sau thí nghiệm quan sát đại thể để phân tích kết thơng qua số Tiếp theo, giải phẩu thu vùng da cấy ghép vật liệu quan sát hình dạng phản ứng viêm xung quanh mô Bảng 2.1 Các lô thí nghiệm Nhóm Cách thực Nhóm thí nghiệm (1,2) Cấy màng tim bị khử tế bào Nhóm đối chứng âm (3) Cắt da lưng chuột khâu lại Nhóm đối chứng dương (4) Cấy màng tim bị chưa khử tế bào 2.2.2 Phương pháp cấy ghép vật liệu Chuẩn bị hố chất: pha lỗng Povidine nước cất vào đĩa petri; tính tốn lượng thuốc mê cần tiêm cho chuột theo công thức (0,1ml tương ứng với 40g trọng lượng chuột), chuột 44g cần tiêm xác 0,11ml Thao tác giải phẫu cấy ghép vật liệu chuột: tiêm thuốc gây mê vào bắp đùi chuột, sau tiến hành cạo vùng lơng da vị trí cấy ghép bơi dung dịch Povidine để sát khuẩn (sử dụng bơng gịn thấm dung dịch) Tiếp tục tiến hành cắt đường 0,5cm vị trí cần cấy ghép cấy vật liệu theo yêu cầu (lưu ý thao tác thực xung quanh đèn cồn) Cuối cùng, khâu vết mổ sau cấy ghép sát khuẩn dung dịch Povidine lần nữa, chờ chuột tỉnh hẳn thả lại vào chuồng để chăm sóc quan sát phân tích kết 2.2.3 Phương pháp xác định số lượng bạch cầu tổng 4 Chuẩn bị hóa chất dụng cụ: sử dụng becher 50ml chứa dung dịch ly giải hồng cầu; lau buồng đếm hồng cầu lamelle; chuẩn bị kính hiển vi Thao tác xác định lượng bạch cầu tổng chuột: sử dụng kim tiêm để lấy máu tĩnh mạch đuôi chuột dùng pipette pha lỗng hồng cầu hút đến vạch 0.5 sau chuyển sang hút dung dịch ly giải hồng cầu vạch 11, trộn phút cho vào eppendorf Hút thêm dung dịch ly giải cho vào eppendorf để tiếp tục pha lỗng, sau dùng micropipette hút 20ml dung dịch pha loãng để nạp vào buồng đếm có lamelle (bỏ giọt đầu) chuyển lên kính hiển vi quan sát đếm Tiến hành đếm lớn góc buồng đếm (mỗi lớn có 16 nhỏ), đếm theo nguyên tắc “cạnh bên trái” theo chiều từ trái sang phải theo hướng ziczac (lưu ý cần đếm nhanh nhiệt từ bóng đèn kính hiển vi dễ làm vỡ tế bào) Ghi nhận số liệu để tính tốn phân tích kết Cơng thức tính tổng số lượng bạch cầu: N=(A/4) x D x 10 (tế bào/mL) (trong N số bạch cầu đếm; A tổng số bạch cầu đếm ơ; D độ pha lỗng =11/0,5=22) PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết Hình 3.1 Số lượng bạch cầu trước sau thí nghiệm bốn nhóm Hình 3.2 Vùng da ghép vật liệu bốn nhóm Quan sát biểu đồ (Hình 3.1) ta nhận thấy chứng âm thí nghiệm lượng bạch cầu tổng sau thí nghiệm giảm so với lượng bạch cầu tổng ban đầu, chứng dương thí nghiệm lượng bạch cầu tổng tăng so với lượng bạch cầu tổng ban đầu Cả bốn thí nghiệm có lượng bạch cầu tổng thuộc phạm vi bình thường chuột (4500-11500 tb/mm ) [1] (Chú thích hình 3.2: TN1: nhóm thí nghiệm 1; TN2: nhóm thí nghiệm 2; (+) chứng dương; (-) chứng âm.) Quan sát đại thể dựa vào (Hình 3.2) nhận thấy thí nghiệm chứng âm mảnh da vị trí cấy ghép có tượng tụ máu; thí nghiệm chứng dương vị trí cấy ghép có lớp màng bao quanh vật liệu; thí nghiệm vị trí cấy ghép có tượng tụ máu viêm; thí nghiệm vị trí cấy ghép bị bao lớp màng dày màu xanh, tụ máu nhiều to tượng viêm 3.2 Thảo luận Chứng âm: xuất hiện tượng tụ máu với số lượng bạch cầu tổng giảm sai sót việc đếm thao tác sai quy trình thí nghiệm Cịn tụ máu vị trí cấy ghép bị nhiễm trùng Chứng dương: xuất lớp màng bao quanh vật liệu với số lượng bạch cầu tổng tăng không xảy viêm dự định ban đầu Lý thời gian thí nghiệm ngắn không đủ để gây viêm, để thời gian lâu có tượng viêm Thí nghiệm 1: mẫu da viêm với số lượng bạch cầu tổng giảm thí nghiệm ghép màng tim bò khử tế bào lại lớp ECM nên khả gây viêm phía vật liệu gây hoàn toàn thấp, việc xảy viêm thao tác chưa xác Cịn số lượng bạch cầu tổng giảm thao tác đếm bị sai Thí nghiệm 2: tương tự thí nghiệm 1, ta thấy tượng viêm nặng số lượng bạch cầu tổng tăng mạnh thao tác sai sót lúc cấy dẫn đến nhiễm trùng nên số lượng bạch cầu thể chuột tăng lên để phản ứng với q trình nhiễm trùng khơng phải đáp ứng với vật liệu PHẦN 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận: khảo sát tương hợp sinh học màng tim bò khử tế bào thất bại số nhóm thao tác thí nghiệm sai dẫn đến kết cho thấy thể chuột đào thải không dung hợp với vật liệu cấy ghép 6 4.2 Kiến nghị: thời gian thí nghiệm nên kéo dài thêm để có kết xác (thấy rõ dung hợp hay thải loại vật liệu cấy ghép), thao tác cần cẩn thận xác TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Trần Lê Bảo Hà, T.M.Q., Đoàn Nguyên Vũ, Lê Thị Ngọc Hương, Nguyễn Thị Ngọc Mỹ, Vũ Thái Kim Thi, Đinh Thị Huyền Trang, Nguyễn Thị Thu Thảo, Giáo trình thực tập vật liệu sinh học 2014, Nhà xuất Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Trần Văn Hiếu, Miễn dịch học: Chức bất thường hệ miễn dịch 2019: Nhà xuất Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Tiếng Anh: Anderson, J.M., F.J Schoen, and N.P Ziats, In vivo assessment of tissue compatibility, in Biomaterials Science 2020, Elsevier p 869-877 Benzimra, M., G.L Calligaro, and A.R Glanville, Acute rejection Journal of thoracic disease, 2017 9(12): p 5440 Boutrand, J.-P., Biocompatibility and performance of medical devices 2019: Woodhead Publishing Cascalho, M and J.L Platt, Basic mechanisms of humoral rejection Pediatric transplantation, 2005 9(1): p 9-16 Imomjonovich, I.I., S.S Fayzullayevich, and N.J.-S Erkinovich, Immunogenesis of Kidney Transplantation, Maintenance of Vital Signs of Transplanted Kidney Annals of the Romanian Society for Cell Biology, 2021: p 6794-6798 Kulski, J.K., T Shiina, and J.M Dijkstra, Genomic diversity of the major histocompatibility complex in health and disease 2019, Multidisciplinary Digital Publishing Institute Mozafari, M., Handbook of Biomaterials Biocompatibility 2020: Woodhead Publishing 10 Vaillant, A.A.J and M Mohseni, Chronic Transplantation Rejection StatPearls [Internet], 2020 7 BẢNG THUẬT NGỮ CHUYÊN NGÀNH STT Thuật ngữ Giải nghĩa Acute rejection Thải loại cấp tính Allogeneic Ghép dị cá thể Antibody Kháng Thể Antigene Kháng nguyên Antigene presenting cell Tế bào trình diện kháng nguyên chuyên nghiệp B cell Tế bào B Chronic rejection Thải loại mãn tính Cytotoxic T cell Tế bào T gây độc Hyperacute rejection Thải loại siêu cấp 10 Macrophage Đại thực bào 11 Major histocompatibility Phức hợp tương hợp mơ complex 12 Monocyte Bạch cầu đơn nhân 13 Syngeneic Ghép tự thân 14 T helper cell Tế bào T giúp đỡ 15 Xenogeneic Ghép dị loài ... vậy, chủ đề ? ?Đánh giá tương hợp sinh học vật liệu mơ hình động vật? ?? đưa vào chương trình giảng dạy điều thực cần thiết Mục tiêu học giúp cho sinh viên hiểu tầm quan trọng việc tạo mơ hình động vật. .. giá tính tương hợp sinh học Các cách đánh giá tính tương hợp sinh học qua mơ hình động vật: thử nghiệm không chức (vật liệu ghép mô mềm thông qua tiểu phẫu), thử nghiệm ex vivo (vật liệu thu... hình động vật để đánh giá độ tương hợp vật liệu Từ đưa kết đến kết luận cuối nghiên cứu PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tính tương hợp vật liệu ghép Vật liệu có tính tương hợp sinh học khơng gây