báo cáo thực hành thí nghiệm hóa sinh học

và định lượng các hợp chất đó...- Tăng cường kỹ năng nghiên cứu và làm thực nghiệm của sinh viên chuyên ngành Công nghệ sinh học.- Giúp sinh viên hiểu biết được một số tính chất của prot

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦY LỢI

KHOA HÓA VÀ MÔI TRƯỜNG

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

THÍ NGHIỆM HÓA SINH HỌC

- Tăng cường kỹ năng nghiên cứu và làm thực nghiệm của sinh viên chuyên ngành Công nghệ sinh học.

- Giúp sinh viên hiểu biết được một số tính chất của protein, một số phương pháp dùng để định tính protein

Thông tin kiến thức cơ bản

- Qua các bài thực hành, sinh viên phải nắm được các nội dung cơ bản của môn học Hóa Sinh Học

+ Hiểu và nắm được nguyên lý hoạt động của các loại máy móc, thiết bị và các dụng cụ cần thiết sử dụng trong phòng thí nghiệm hóa sinh: máy ly tâm, máy đo pH, , cân điện tử, cân phân tích, pipet mant, ống đong, cốc đong địnhmức, bình định mức, bếp từ, bể ổn nhiệt

+ Hiểu và nắm được vai trò, nguyên tắc và cách sử dụng, bảo quản các loại hóa chất dùng trong phòng thí nghiệm hóa sinh: axit, kiềm, muối, hợp chất hữu cơ bay hơi

- Thông qua thực hiện các nội dung cụ thể, sinh viên phải có kỹ năng thực hiện:

+ Sử dụng và thực hiện thành thạo các thao tác sử dụng các loại máy móc, thiết bị và các dụng cụ cần thiết dùng trong phòng thí nghiệm hóa sinh: máy

ly tâm, máy đo pH, , cân điện tử, cân phân tích, pipet mant, ống đong, cốc đong định mức, bình định mức, bếp từ, bể ổn nhiệt

+ Thực hiện được các tính toán chính xác khối lượng các hóa chất cần thiết

để pha dung dịch chuẩn và dung dịch đệm thường được sử dụng trong thí nghiệm hóa sinh

+ Thực hiện được các thí nghiệm chứng minh tính chất, định tính các hợp chất: Protein; axit amin; Saccarit; Lipid; Vitamin

- Thực hiện được các thí nghiệm định tính các hợp chất: Protein; Saccarit

Cơ sở lý thuyết

- Phản ứng màu nihidrin: Các amino acid khi phản ứng với

ninhidrin ở nhiệt độ cao cho sản phẩm có màu xanh tím (hấp thụ cực đại ở bước sóng 570 nm) Đây là phản ứng chung cho tất cả các amino acid ở vị tríalpha Ngoài các α-amino acid, các peptide, protein, muối amoni,

aminosaccharide và amoniac cũng cho phản ứng này

- Phản ứng biure: Đây là phản ứng đặc trưng của liên kết peptide.

Trong môi trường kiềm, các hợp chất có chứa từ hai liên kết peptide trở lên

có thể phản ứng với CuSO4 tạo thành phức chất màu xanh tím, tím, tím đỏhoặc màu tùy phụ thuộc vào số lượng liên kết peptide nhiều hay ít

- Phản ứng kết tủa thuận nghịch protein bằng muối trung tính (NH4)2SO4: Các muối này vừa làm trung hòa điện (do các ion tác dụng

tương hỗ với các nhóm điện tích trái dấu), vừa loại bỏ lớp vỏ hidrat của phần

tử keo Các protein khác nhau có thể bị kết tủa với nồng độ muối khác nhau,

vì vậy có thể dùng muối để tách riêng các protein ra khỏi các hỗ hợp củachúng Ví dụ, dùng muối (NH4)2SO4 có độ bão hòa khác nhau để tách riêngalbumin và globulin trong lòng trắng trứng

- Kết tủa bằng muối kim loại nặng: Những muối kim loại nặng

(Cu2+, Fe , Pb ) tác dụng với protein tạo thành kết tủa không tan Nhưng3+ 2+nếu dư thừa muối, kết tủa lại tan ra do những phần tử keo hấp thụ ion kimloại nặng, trở lên tích điện Ion có giá trị càng cao kết tủa càng dễ hòa tan trởlại

2 Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị

- Nguyên liệu dùng cho bài thí nghiệm :

- Hóa chất dùng cho bài thí nghiệm:

- Dụng cụ dùng cho bài thí nghiệm:

2 Bình tam giác 100ml Chiếc 4

3 Bình định mức 100ml Chiếc 1

4 Pipet thủy tinh, 5ml Chiếc 2

5 Pipet thủy tinh, 2ml Chiếc 2

6 Pipet thủy tinh, 1ml Chiếc 2

7 Công tơ hút (bằng thủy

tinh)

- Thiết bị dùng cho bài thí nghiệm:

3 Cách tiến hành:

Thí nghiệm 1: Phản ứng biure

 Phản ứng với ure:

- Cho vào ống nghiệm khô 1 ít tinh thể ure

- Đun trên ngọn lửa yếu để ure nóng chảy, đến khi cứng lại thì ngừng đun

- Để ống nguội, thêm vào 2ml NaOH 10%, lắc cho tan

- Thêm vài giọt CuSO

4 1%, lắc kỹ, quan sát màu

 Phản ứng với protein:

- Cho vào ống nghiệm 3ml dung dịch lòng trắng trứng 1%

- Thêm vào 1ml NaOH 10% và 1-2 giọt dung dịch CuSO4 1%, lắc kỹ

Thí nghiệm 2: Phản ứng với ninhydrin

-Lấy 2 ống nghiệm sạch và khô

-Cho vào mỗi ống 1ml dung dịch ninhydrin

-Thêm vào ống 1: 1ml dung dịch long trắng trứng 1%

ống 2: 1 ml proline 1%

-Quan sát màu trong 2 ống nghiệm

Thí nghiệm 3: kết tủa bằng muối trung tính

-Cho vào ống nghiệm 5ml lòng trắng trứng và 5ml dung dịch

(NH4)2SO4

-Bão hoà, lắc đều , xuất hiện kết tủa globulin

-Để 5 phút và tiếp tục lọc (thấm ướt giấy lọc bằng dung dịch (NH4)2SO4)

-Cho vào dịch lọc 3g tinh thể (NH4)2SO4 (nếu dịch lọc là 4 ml) , lắc , albumin kết tủa, lọc và thu lấy kết quả

-Tiếp tục cho riêng kết tủa globilin và albumin vào các ống nghiệm tương ứng , them vào mỗi ống khoảng 2-3ml nước cất , lắc , quan sát và so sánh kết quả

Thí nghiệm 4: Kết tủa với kim loại nặng

- Lấy 3 ống nghiệm sạch, khô

- Cho vào mỗi ống 2ml dung dịch lòng trắng trứng 5%

- Thêm vào ống I: 1 giọt dung dịch FeCl3 5%

ống II: 1 giọt CuSO4 7%.

- Quan sát kỹ, sau đó cho thêm vào lượng muối kim loại tương ứng vào từng ống

- So sánh sự hòa tan kết tủa ở các ống

4 Kết quả và thảo luận

Thí nghiệm 1: Phản ứng biure

 Phản ứng với ure:

Kết quả thu được : dung dịch có màu tím hồng

Giải thích ý nghĩ: khi đun nóng 2 phân tử ure kết hợp lại tạo thành Biure làm xuất hiện liên kết peptit: – CO – NH phản ứng Biure là phản ứng dặc trưng của lien kết peptit Trong môi trường kiềm, Biure kết hợp với CuSO4 cho phức muối Cu có màu tím hồng.

• Phản ứng với protein:

Kết quả thu được: Thu được dung dịch có màu tím.

Giải thích ý nghĩ: trong dung dịch lòng trắng trứng có những liên kết peptit – CO – NH – nên cũng cho phản ứng biure tạo phức chất muối Cu với poly peptit có màu tím

Thí nghiệm 2: Phản ứng với ninhydrin

Kết quả thu được:

Giải thích ý nghĩ : phản ứng ninhydrin định tính các amino acid

quan trọng Đa số cho sản phẩm màu tím trong khi proline và dẫn xuất hydroxy của nó cho màu vàng

- Sự xuất hiện màu xanh tím là do phản ứng của ninhydrin và amino acid ninhydrin bị khử +NH3+CO2+RCHO ninhydrin bị khử Phức chất màu xanh tím.

Thí nghiệm 3: Kết tủa bằng muối trung tính

Kết quả thu được:

Kết tủa 1 : thu được khi cho Kết tủa 2: thu được khi cho dịch Protein trứng tác dụng với lọc với tinh thể muối , khi lắc muối trung tính và lắc đều lên thì thấy rõ những hạt li ti kết

tủa.

Giải thích ý nghĩ: kết tủa 1 là globulin và kết tủa 2 thu được là

albumin Trong lòng trắng trứng có globulin và albumin Các protein khác nhau có thể kết tủa ở nồng độ muối khác nhau Vì vậy dùng (NH4)2SO4 để tách riêng globulin và albumin NH và SO tác dụng vào lớp ion âm bên 4+ 42-ngoài, làm bất hoạt các gốc ưa nước của protein, khiến chúng kết tụ lại với nhau để tạo thành kết tủa Vì đường kính phân tử globulin lớn hơn albumin nên NH và SO dễ tác dụng vào lớp ion âm bao quanh globulin hơn Từ 4+ 42-

đó tạo nên kết tủa của globulin trước albumin

Thí nghiệm 4: Kết tủa với kim loại nặng

Kết quả thu được: Khi cho thêm 1 giọt muối vào các ống

nghiệm

+ Ống I tạo thành kết tủa có màu đỏ cam

+ Ống II tạo thành kết tủa có màu xanh nhạt

- Khi cho thêm dung dịch muối để kết tủa tan:

vỡ màng nước bao quanh phân tử protein và trung hòa điện tích Muối kim loại nặng tạo kết tủa và làm biến tính protein do sự phá hủy sâu sắc cấu trúc bậc 2, 3 của phân tử protein Nhưng nếu thừa các ion kim loại nặng kết tủa lại bị tan ra do phân tử keo hấp thụ các ion kim loại nặng và trở thành trạng thái tích điện Ion có hóa trị càng cao kết tủa càng dễ tan trở lại Mặc dù protein tan nhưng bị bến tính hoàn toàn

5 Kết luận

- Ứng dụng trong phương pháp sắc ký trên giấy để phân tích acid amin

Dưới tác động của nhân tố gây kết tủa protein sẽ trở lại trạnh thái ban đầu tạo thành dung dịch keo bền như trước Đó là hiện tượng kết tủa thuận nghịch hay mất khả năng tạo thành dung dịch keo Các nhân tố gây kết tủa thuận nghịch protein là: muối trung tính, kim loại kiềm, kiềm thổ, các dung môi hữu cơ,

Thí nghiệm 4: Kết tủa với kim loại nặng

Những muối kim loại nặng (Cu2+ ,Fe3 +¿ ¿ ,Pb2+¿ ¿ ) tác dụng với protein tạo thành kết tủa không tan Nhưng nếu dư thừa muối, kết tủa lại tan

ra do những phần tử keo hấp thụ ion kim loại nặng, trở lên tích điện Ion có giá trị càng cao kết tủa càng dễ hòa tan trở lại.

Khả năng tạo kết tủa không tan của protein với các muối kim loại nặng được sử dụng trong những trường hợp bị ngộ độc muối của Cu; Pb; Fe; khi cơ thể chưa hấp thu protein thì sữa, trứng thường được dùng để giải độc

6 Tài liệu tham khảo

Trang web tham khảo:

- Bao-Cao-Thuc-Hanh-Hoa-Sinh-Dai-Cuong

trường kiềm Cu bị khử thành Cu , đồng thời nhóm chức andehyde hoặccetone của đường bị oxy hóa thành các muối tương ứng.

Thí nghiệm 2 Phản ứng màu của tinh bột với iod

Phản ứng đặc trưng nhất của tinh bột là tạo thành màu xanh với iod Màu xanh này là do thành phần amylose của tinh bột quyết định Màu có thể bị biến mất khi đun nóng và được phục hồi trở lại khi làm lạnh Tuy nhiên, nếu đun mạnh đến khi dung dịch trắng hoàn toàn thì sẽ không hồi phục được màu xanh dù có làm lạnh dung dịch

Phản ứng màu của tinh bột và iod có độ nhạy cao, vì vậy thường được sử dụng trong phương pháp chuẩn độ iod (làm chất chỉ thị) Ngoài

ra người ta cũng thường dùng phản ứng này để quan sát hạt tinh bột trong mô thực vật

Thí nghiệm 3 Sự thủy phân tinh bột

Dưới tác dụng của acid hoặc α-amylase, tinh bột bị thủy phân tạo thành các sản phẩm trung gian gọi là dextrin và cuối cùng tạo thành maltose hoặc glucose Có thể phân biệt các dextrin dựa vào sự khác nhaugiữa chúng về khối lượng phân tử, khả năng khử và phản ứng màu với iod Amylodextrin cho màu tím, eritrodextrin cho màu đỏ nâu,

acrodextrin và maltodextrin không cho phản ứng màu với iod Vì vậy có thể dựa vào phản ứng màu với iod hoặc khả năng khử của sản phẩm được tạo thành để phán đoán mức độ thủy phân của tinh bột

2.NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ

Số lượn g

Quy đổi

ra hóa chất chuẩn

Ghi chú

1 Glucose 5% ml 2 0,1 Hóa chất chuẩn tính ra g

2 NaOH 10% ml 2 0,2 Hóa chất chuẩn tính ra g

3 CuSO4 5% ml 5 0,25 Hóa chất chuẩn tính ra g

4 Maltose 1% ml 1 0,01 Hóa chất chuẩn tính ra g

(Lượng cần dùng cho nhóm sinh viên = lượng hóa chất × độ lặp laị ×

hệ số tiêu hao;độ lặp lại: 3, hệ số tiêu hao: 2.0).

Dụng cụ

T Tên dụng cụ Đơn vị tính lượng Số Ghi chú

1 Ống nghiệm 10 mL Chiếc 40

2 Pipet thủy tinh 1 mL Chiếc 3

3 Pipet thủy tinh 2 mL Chiếc 3

4 Công tơ hút Chiếc 4 Bằng thủy tinh hoặc nhựa

5 Giá đỡ ống nghiệm Chiếc 1 Làm bằng nhựa

6 Ống đong 25 mL Chiếc 1

7 Ống đong 50 mL Chiếc 1

8 Bình nón 50 mL Chiếc 3

Thiết bị

Pha các dung dịch có nồng độ tương ứng

-Pha dung dịch tinh bột 0,5%: hòa tan 0,5 g tinh bột trong một ítnước cất, sau đó thêm nước cất đang sôi vào, khuấy đều, tiếp tục đunđến sôi, để nguội, thêm nước cất tới 100 mL

-Thuốc thử Liugon: hòa tan 2,5 g KI trong 20 mL nước cất, thêm 1

g iod, lắc cho tan hết, thêm nước cất tới 100 mL

-Pha dung dịch tinh bột 1%: hòa tan 1 g tinh bột trong một ít nước

cất, sau đó thêm nước cất đang sôi vào, khuấy đều, tiếp tục đun đến sôi,

để nguội, thêm nước cất tới 100 mL

-Pha dung dịch iod 0,001 N: hòa tan 0,02 g KI trong 10 mL nướccất, thêm 0,13 g iod, lắc cho tan hết, thêm nước cất tới 1000 mL

Thao tác thực nghiệm

Thí nghiệm 1 Phản ứng khử của mono- và disaccharide (phản ứng Tromer)

- Phản ứng tromer đối với monosaccaride: Cho vào ống nghiệm 2

mL dung dịch glucose 5%, 2 mL dung dịch NaOH 10%, sau đó thêm từ

từ từng giọt dung dịch CuSO 5% vào đến khi xuất hiện kết tủa xanh4của Cu(OH) Đun đến sôi, quan sát hiện tượng và2 giải thích

Chú ý không cho thừa CuSO vì khi đun sẽ tạo ra kết tủa đồng II 4 oxit CuO có màu đen làm lấn át màu của phản ứng

- Phản ứng tromer đối với disaccharide: ống nghiệm 1 – 1 mL

saccarose 1%; 1 mL dung dịch NaOH 10%, sau đó thêm từ từ từng giọtdung dịch CuSO 5% vào đến khi xuất hiện kết tủa xanh của Cu(OH) 4 2Đun đến sôi, quan sát hiện tượng và giải thích

-Chú ý không cho thừa CuSO vì khi đun sẽ tạo ra kết tủa đồng II oxit 4 CuO có màu đen làm lấn át màu của phản ứng

Thí nghiệm 2 Phản ứng màu của tinh bột với iod

Cho vào ống nghiệm 2-3 mL dung dịch tinh bột, thêm vài giọt thuốc thử Liugon, quan sát màu Đun nóng ống nghiệm đến khi dung dịch vừa mất màu, làm lạnh dung dịch và quan sát Lại đun ống nghiệm, lần này kĩ hơn đến khi dung dịch mất màu hoàn toàn Làm lạnh, quan sát

Cho vào bình nón (dung tích 250 mL) 15 mL hồ tinh bột, 2 mL dung dịch H SO2 4 3M Đặt vào nồi cách thủy đang sôi Chuẩn bị 1 dãy ống nghiệm, cứ sau 10 phút cho vào mỗi cặp ống (1 ống của dãy 1 và 1 ống của dãy 2) vài giọt dung dịch tinh bột đang thủy phân, sau đó cho thêm vào mỗi ống của dãy 1: 1 mL dung dịch iod loãng 0,001N, quan sátmàu Dãy ống nghiệm 2 được trung hòa bằng kiềm và làm phản ứng Tromer (như thí nghiệm 1) So sánh sự khác nhau giữa các ống.

Ống nghiệm sau phản ứng Tromer

-Giải thích:

Lúc đầu xuất hiện kết tủa do:

CuSO + 2NaOH → Cu(OH) + Na4 2 2SO4

dd glucose làm kết tủa Cu(OH) bị tan cho phức đồng glucose, dd xanh 2lam

C6H O 12 6 + Cu(OH) → (C2 6H11O6)2Cu + H O 2

Sau đó khi đun nóng màu xanh của phức nhạt dần và xuất hiện kết tủa đỏgạch

C5H O 11 5CHO + 2Cu(OH) → C2 5H11O5COOH + Cu O + 2H O2 2

Glucose phản ứng làm tan kết tủa Cu(OH) tạo phức màu xanh lam Khi 2đun nóng xảy ra phản ứng của Cu(OH) với nhóm CHO của glucose nên 2tạo kết tủa đỏ gạch của Cu O Dưới tác dụng của các mono- và một số 2disaccharide trong môi trường kiềm Cu bị khử thành Cu , đồng thời 2+ +nhóm chức andehyde hoặc cetone của đường bị oxy hóa thành các muối tương ứng

Thí nghiệm 2: Phản ứng màu của tinh bột với iod

-Hiện tượng: sau khi thêm thuốc thử Liugon , dung dịch chuyển sang màu xanh tím Đun nóng ống nghiệm đến khi dung dịch vừa mất màu, sau khi làm lạnh dung dịch trở lại màu xanh tím Đun lần 2 dung dịch mất màu hoàn toàn, sau khi làm lạnh không đổi màu

Ống nghiệm được làm lạnh sau khi đun nóng lần 1

Ống nghiệm được làm lạnh sau khi đun nóng lần 2

-Giải thích: Tinh bột có chứa amilozo và amilopeptin , tạo thành vòng hình xoắn ốc, khi cho Liugon vào dung dịch, Liugon nằm trong lòng hình xoắn ốc amilozo tạo thành màu xanh Khi tăng nhiệt

độ, liên kết xoắn ốc tách nhau ra, iod thoát khỏi vòng xoắn làm mất màu dung dịch Khi đun nóng lần 2, iod đã bị thăng hoa nên dung dịch bị mất màu hoàn toàn

Thí nghiệm 3: Sự thủy phân tinh bột

-Hiện tượng:

Ống nghiệm của dãy thứ nhất bắt màu màu xanh, nhạt dần theo thời gian thủy phân, đậm màu nhất ở ống 10p và gần như mất màu hoàn toàn ở ống 40p

Ống nghiệm dãy thứ 2 xuất hiện kết tủa màu đỏ, đậm dần theo thời gian thủy phân, đỏ cam ở ống 10p và đỏ gạch ở ống 40p

Dãy ống nghiệm 1: thêm 1mL dung dịch iod loãng 0,001N

Dãy ống nghiệm 2: Trung hoà bằng kiềm và làm phản ứng

Tromer

-Giải thích:

Tinh bột bị thuỷ phân thành các sản phẩm trung gian là dextrin và cuối cùng tạo thành maltose hoặc glucose Ở ống nghiệm 10p bắt màu đậm nhất vì chỉ có 1 phần tinh bột bị thuỷ phân Màu nhạt dần theo thời gian thuỷ phân Ống 40p gần như mất màu hoàn toàn vì tinh bột đã được thuỷ phân gần hết

5.KẾT LUẬN

- Sau khi thực hành bài này, sinh viên có thể hiểu được tính khử của

một số loại đường (đường đơn và đường đôi), phản ứng màu đặc trưng của tinh bột với iod và phản ứng thủy phân tinh bột