Báo Cáo Thực Hành Hoá Sinh Học.pdf

lOMoARcPSD|38557106 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG BÁO CÁO THỰC HÀNH HOÁ SINH HỌC Giảng viên : ThS Nguyễn Thị Bích Hằng Lớp : 22CNSH Nhóm :3 Thành viên nhóm : Trần Thanh Hiếu Phạm Thị Diễm Lý Như Uyên Lê Hồ Quỳnh Như Trương Ngọc Sao Khuê Đà Nẵng, tháng 12 năm 2023 Downloaded by LIEU TAI (tailieuso.14@gmail.com) lOMoARcPSD|38557106 MỤC LỤC BÀI THỰC HÀNH 1: .2 BÀI THỰC HÀNH 2: .6 BÀI THỰC HÀNH 3: 14 1 Downloaded by LIEU TAI (tailieuso.14@gmail.com) lOMoARcPSD|38557106 BÀI THỰC HÀNH 1: ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN THEO PHƯƠNG PHÁP BIURE Ngày thí nghiệm: 27/10/2023 I Nội dung thí nghiệm: 1 Nguyên tắc: Trong môi trường kiềm, protein kết hợp với Cu2+ tạo thành phức chất có màu xanh tím có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 540nm Cường độ màu của phản ứng tỉ tệ với số lượng liên kết peptit (- CO – NH -) 2 Nguyên liệu và hóa chất:  Albumin 1%  Dung dịch protein (lòng trắng trứng)  Thuốc thử Biure: Cân 1,5g CuSO4.5H2O và 6g muối Seignet NaKC4H4O6 4H2O  cho vào bình định mức 1 lít, cho thêm 30g NaOH 30%, 2g KI và dẫn nước đến vạch  ngấn Dung dịch giữ trong lọ sẫm màu, đậy bằng nút cao su  Chuẩn bị mẫu nghiên cứu: Dùng 4ml lòng trắng trứng gà cho vào bình định mức 50ml, dùng NaCl 0,9% dẫn đến vạch định mức  Nước cất 3 Thiết bị và dụng cụ:  Ống nghiệm  Máy đo quang phổ  Pipette 5ml  Micropipet  Giá để ống nghiệm  Bình tia đựng cồn  Bình định mức II Cách tiến hành:  Pha loãng mẫu: dùng 4ml lòng trắng trứng gà cho vào bình định mức 50ml, dùng NaCl 0,9% dẫn đến vạch mức  Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch mẫu nghiên cứu và 4ml thuốc thử biure, lắc đều, để yên trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, dung dịch có màu xanh, so màu ở bước sóng 540nm, xác định mật độ quang học của dung dịch nghiên cứu  Lập đồ thị chuẩn: lấy 6 ống nghiệm, đánh số từ 1-6, sau đó cho vào từng ống nghiệm các chất tham gia phản ứng 2 Downloaded by LIEU TAI (tailieuso.14@gmail.com) lOMoARcPSD|38557106  Lắc đều, để yên các ống nghiệm trong 30 phút ở nhiệt độ phòng So màu dung dịch trong các ống ở bước sóng 540nm, ghi mật độ quang tương ứng với các ống, xây dựng đồ thị chuẩn III Kết quả và thảo luận: Kết quả thí nghiệm TT Albumin 1% (ml) Nước cất (ml) Thuốc thử Biure (ml) Lượng protein (mg) 1 0,0 1,0 4 0 2 0,2 0,8 4 2 4 3 0,4 0,6 4 6 8 4 0,6 0,4 4 10 5 0,8 0,2 4 6 1,0 0,0 4 TT Albumin 1% (ml) Nước cất (ml) Thuốc thử Biure (ml) Mẫu thử 7 0 0,5 4 0,5 8 0 0 4 1 9 0 0,5 4 0,5 10 0 0 4 1 Hình: Mẫu ống nghiệm đo hàm lượng protein 3 Downloaded by LIEU TAI (tailieuso.14@gmail.com) lOMoARcPSD|38557106  Sau 30 phút, đem các dung dịch đi so màu bằng máy so màu ở bước sóng 540nm, thu được kết quả như bảng dưới: STT ống nghiệm OD (mật độ quang) Lượng protein (mg) 1 0 0 2 2 3 0,0961 4 4 0,1951 6 5 0,2863 8 6 0,3902 10 7 0,4811 0,5 8 0,2428 1 9 0,5061 0,5 10 0,2646 1 0,5074  Minh chứng hình ảnh số liệu: 4 Downloaded by LIEU TAI (tailieuso.14@gmail.com) lOMoARcPSD|38557106  Xây dựng sơ đồ đường chuẩn dựa trên số liệu thu được trong bảng trên: 0.6 0.5 f(x) = 0.0482714285714286 x + 0.000109523809523865 R² = 0.999791004593941 0.4 OD 0.3 0.2 0.1 0 0 2 4 6 8 10 12 LƯỢNG PROTEIN (mg) Phương trình đường chuẩn Albumin là: y = 0,0483x + 0,0001 Trong đó: y là mật độ quang; x là lượng protein Mật độ quang của dung dịch trong mẫu đo được y1 = 0,2428  x= 5,0062 Mật độ quang của dung dịch trong mẫu đo được y2 = 0,5061 Mật độ quang của dung dịch trong mẫu đo được y3 = 0,2646  x= 5,4575 Mật độ quang của dung dịch trong mẫu đo được y4 = 0,5074 Hàm lượng protein trong 1ml mẫu phân tích là : C1 = 100∗x = 100∗5,0062 =125,1550(mg) a 4  Hàm lượng protein trong 100ml dung dịch: 12515,50(mg) C3 = 100∗x = 100∗5,4575 =136,4375(mg) a 4  Hàm lượng protein trong 100ml dung dịch: 136,4375(mg) 5 Downloaded by LIEU TAI (tailieuso.14@gmail.com) lOMoARcPSD|38557106 BÀI THỰC HÀNH 2: ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ THEO PHƯƠNG PHÁP BERTRAND Ngày thí nghiệm: 17/11/2023 I Nội dung thí nghiệm: 1 Nguyên tắc Trong môi trường kiềm các đường khử (glucose, fructose…) dễ dàng khử đồng II thành đồng I theo phản ứng Fehling Kết tủa đồng I oxit có màu đỏ gạch, có khả năng khử với muối Fe3+ thành muối Fe2+ trong môi trường acid: Cu2O +Fe2(SO4)3 + H2SO4 à 2CuSO4 + 2 FeSO4 + H20 Fe2+ sinh ra có tính khử lại tác dụng với KMnO4 là chất oxi hoá nên dùng KMnO4 để chuẩn độ Fe2+ trong môi trường acid: 10FeSO4 + KMnO4 + 8H2SO4 à K2SO4 +2MnSO4 +5Fe2(SO4)3 +8H20 Dựa vào lượng KMnO4 sử dụng ta có thể tính được hàm lượng Cu2O và từ đó tính được lượng đường khử trong dung dịch bằng cách tra bảng tỉ lệ giữa dung dịch KMnO4 và đường khử của Bertrand 2 Chuẩn bị hóa chất  Thuốc thử Fehling + Fehling 1: 10g CuSO4.5H20 trong 250ml nước cất + Fehling 2: 37.5 NaOH trong nước cất, cho 12.5ml muối Kali Natri Tactrat vào Khuấy đều và dẫn nước đến vạch 250ml  Dung dịch Fe2(SO4) trong H2SO4 (250ml): 12,5g Fe2(SO4)3 + 5g H2SO4 à Thêm nước cất đến 250ml  Dung dịch KMNO4 1/30N (500ml): 0.53g KMnO4 à Hoà tan trong 500ml nước cất à Đựng trong bình tối màu và đạy kín  Dung dịch Pb(NO3)2 10%: 100g dung dịch  Dung dich Na2SO4 bão hoà 3 Thiết bị và dụng cụ, mẫu  Mẫu táo, chuối  Bình tam giác  Pipette 10ml  Bình định mức 100ml  Ống bóp cao su  Bình tia nước cất 6 Downloaded by LIEU TAI (tailieuso.14@gmail.com) lOMoARcPSD|38557106  Giấy lọc  Giấy cân  Cân phân tích  Máy chưng cách thuỷ  Ấm đun siêu tốc II Cách tiến hành  Cân lần lượt 5g mẫu chuối và táo trên giấy cân bằng cân phân tích Sau đó nghiền lần lượt mẫu táo và mẫu chuối cho thật nhuyễn với 30ml nước cất 70o, tráng và chuyển 2 hỗn hợp vào 2 bình tam giác  Đun cách thuỷ 70-80°C trong 35 phút Kết tủa protein và các tạp chất bằng 5ml dung dịch chì nitrat Pb(NO3)2 10% Sau đó loại bỏ lượng chì dư bằng 5ml dung dịch Na2HPO4 bão hoà, chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình định mức 100ml để yên hỗn hợp 10 phút và dẫn nước đến vạch Hình 2: Mẫu Táo và Chuối sau khi thêm Pb(NO3)2  Lắc đều và đem lọc qua giấy lọc vào bình khô Dịch lọc dùng làm dung dịch thí nghiệm 7 Downloaded by LIEU TAI (tailieuso.14@gmail.com) lOMoARcPSD|38557106 Hình 3: Lọc mẫu chuối và táo Sau khi có dịch lọc của mẫu táo và chuối:  Lấy 10ml dịch lọc (táo, chuối) cho vào bình tam giác  Thêm vào 10ml dung dịch fehling I và 10ml fehling II vào mỗi bình à Đun sôi 3 phút trên bếp có lưới amiăng 8 Downloaded by LIEU TAI (tailieuso.14@gmail.com) lOMoARcPSD|38557106  Để nguội, lắng kết tủa à Rửa kết tủa bằng nước cất ấm đã được đun sôi, rửa nhiều lần cho đến khi lấy được lượng Cu2O  Hoà tan kết tủa đồng (I) oxit bằng cách cho những lượng nhỏ (5ml) dung dịch sắt (III) sunfat trong môi trường H2SO4 và dùng đũa thuỷ tinh khuấy thật cẩn thận để hoà tan hoàn toàn kết tủa đồng oxit 9 Downloaded by LIEU TAI (tailieuso.14@gmail.com) lOMoARcPSD|38557106  Chuẩn độ dung dịch thu được bằng KMnO4 1/30N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền khoảng 20-30 giây 10 Downloaded by LIEU TAI (tailieuso.14@gmail.com) lOMoARcPSD|38557106  Từ lượng KMnO4 1/30N dùng để chuẩn độ, tra Bảng 2.1 để suy ra lượng đường có trong mẫu phân tích Song song làm thí nghiệm đối chứng bằng cách thay dung dịch đường bằng nước cất Bảng 2.1 Tỉ lệ giữa KMnO4 1/30N và lượng đường khử KMnO4 1/30N Glucose(mg) KMnO4 1/30N Glucose(mg) 11 Downloaded by LIEU TAI (tailieuso.14@gmail.com) lOMoARcPSD|38557106 (ml) 0.2 0.0 18 19.2 1 0.8 19 20.3 2 1.8 20 21.5 3 2.8 21 22.7 4 3.9 22 23.8 5 5.0 23 25.3 6 6.1 24 26.2 7 7.2 25 27.4 8 8.3 26 28.6 9 9.3 27 29.9 10 10.4 28 31.2 11 11.5 29 32.5 12 12.6 30 33.8 13 13.7 31 35.1 14 14.8 32 36.3 15 15.9 33 37.6 16 17.0 34 38.9 17 18.1 35 40.2 III Kết quả và thảo luận 12 Downloaded by LIEU TAI (tailieuso.14@gmail.com) lOMoARcPSD|38557106 Hình 1: Chuẩn độ KMnO4 trong mẫu táo Hình 2: Chuẩn độ KMnO4 trong mẫu chuối Hàm lượng đường khử: 13 Downloaded by LIEU TAI (tailieuso.14@gmail.com) lOMoARcPSD|38557106 X = Trong đó: X: hàm lượng đường khử tính theo % a: số mg glucose tìm được khi tra bảng ứng với số ml KMnO4 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu phân tích trừ đi số ml KMnO4 1/30N dùng để chuẩn độ mẫu không V: thể tích pha loãng mẫu (100ml) V1: thể tích mẫu lấy đem xác định đường khử m: lượng mẫu đem phân tích 1000: hệ số đổi gam thành mg Lượng đường khử trong táo: X1= 23800× 10× 100 = 47.6% 100× 5× 1000 Lượng đường khử trong chuối: X2= 100× 5× 1000 27400× 10× 100 = 54.8% Kết luận: Vậy hàm lượng đường khử trong chuối cao hơn táo 14 Downloaded by LIEU TAI (tailieuso.14@gmail.com) lOMoARcPSD|38557106 BÀI THỰC HÀNH 3: THU NHẬN ENZYME AMYLASE TỪ MẦM LÚA Ngày thí nghiệm: 17/11/2023 I Nội dung thí nghiệm: 1 Nguyên tắc Enzyme có bản chất là protein, đóng vai trò là chất xúc tác sinh học, xúc tác cho các phản ứng sinh hóa xảy ra trong cở thể Enzyme có tính đặc hiệu cao và có hiệu lực xúc tác lớn Enzyme có trong tế bào của các cơ thể sống, nhờ sự hiện diện của enzyme mà các phản ứng sinh hóa trong cơ thể xảy ra rất nhanh, nhạy ở điều kiện sinh lý bình thường của cơ thể sống Khảo sát hoạt tính của Enzim amylase  Amylase là hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật Các enzyme này thuộc nhóm các enzyme thủy phân (hydrolase), chuyên xúc tác sự phân giải các liên kết glycoside trong phân tử polysaccharide với sự tham gia của nước  Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen  Sản phẩm thủy phân của amylase coa các thành phần đơn giản như maltose, glucose, dextrin… Enzyme amylase có từ nhiều nguồn gốc: trong nước bọt, trong dịch tiếu hoá của nguòi và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men, vi khuẩn  Tuỳ theo tính chất và khả năng tác dụng, người ta phân biệt: α amylase, β amylase và γ amylase  α-amylase  Không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên, song với tốc độ rất chậm  Có khả năng phân cắt các liên kết 1- 4 glycoside nằm ở phía trong phân tử cơ chất (tinh bột, glycogen) một cách ngẫu nhiên  Sản phẩm của sự thuỷ phân tinh bột nhờ α-amylase là các dextrin có phân tử lượng thấp (không có màu với iod), một ít maltose và rất ít glucose  pH tối thích cho α-amylase mầm lúa là 5,3  Nhiệt độ tối thích là 58 - 60 OC  α-amylase được hoạt hóa bởi Ca2+, Cl- và bị ức chế bởi Cu2+, Ag+, Hg2+ 15 Downloaded by LIEU TAI (tailieuso.14@gmail.com) lOMoARcPSD|38557106  β-amylase Chỉ thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột, cụ thể β-amylase phân giải 100% amylose thành maltose và 54 - 58% amylopectin  Có khả năng phân cắt liên kết α - 1-4 glycoside từ các đầu không khử của các nhánh ngoài cùng, sự phân cắt sẽ dựng lại ở 1 vùng gần nhánh (liên kết 1-6) trong phân tử amylopectin  pH tối thích 4,5  Nhiệt độ tối thích là 50OC  β-amylase được kích thích bởi Na+, Cl- và bị ức chế bởi Cu2+, Hg2+, urea, iodoacetamide, iod, ozon  γ-amylase  Có khả năng xúc tác thủy phân cả liên kết α - 1-4 lẫn α - 1-6 glycoside tuần tự từng gốc glucose  Sản phẩm thủy phân là glucose  pH tối thích là 3,5 - 5,5  Chất kích thích γ-amylase là Ca2+, Na+, Cl- và chất ức chế là Cu2+, Hg2+  Kém bền dưới tác dụng của rượu ethylic, aceton Trong bài thí nghiệm chúng ta dùng phức hệ amylase của mầm lúa để khảo sát sự thủy phân dung dịch hồ tinh bột 2 Chuẩn bị  Tiến hành cho hạt ủ với thời gian là 3 ngày và 5 ngày  Dung dịch Na2HPO4  Dung dịch NAH2PO4  100g CuSO4 2%  100g CaCl2 1%  Dung dịch Iod  pH dung dịch đệm Na2HPO4, NAH2PO4 từ 5.5; 6.0; 6.5; 7.0; 7.5; 8.0 3 Thiết bị và dụng cụ  Cốc đong thủy tinh  Buret  Giấy lọc  Bình tam giác thủy tinh  Bình định mức 100ml II Cách tiến hành: 16 Downloaded by LIEU TAI (tailieuso.14@gmail.com) lOMoARcPSD|38557106  Dùng khoảng 200 hạt lúa nẩy mầm cho vào cối sứ, nghiền nhuyễn với 3-5ml nước cất Tiếp tục nghiền và thêm dần đến hết 50 ml nước cất để hòa tan enzyme Lọc dung dịch bằng giấy lọc Thu dịch lọc có chứa enzyme amylase  Mỗi thí nghiệm chuẩn bị 4 ống nghiệm cùng những hóa chất như bảng dưới, sau khi ủ ổn định nhiệt độ ở bề mặt nước nóng 50℃, tiến hành các bước mà nhỏ dịch enzyme vào 3.1 Khảo sát nồng độ Ống nghiệm 1 2 3 4 17 Downloaded by LIEU TAI (tailieuso.14@gmail.com) lOMoARcPSD|38557106 Nước 0 ml 1 ml 2 ml 3 ml Enzym 3 ml 2ml 1 ml 0 Tinh bột 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 1 giọt 1 giọt 1 giọt 0.5 ml Iod 1 giọt 3.2 Độ pH 18 Downloaded by LIEU TAI (tailieuso.14@gmail.com) Ống nghiệm 1 lOMoARcPSD|38557106 3 4 pH (2ml) 5,6 6,5 Nước cất Enzym 2 ml 2 2 ml I od 1 giọt 6 1 giọt 2 ml 2 ml 1 giọt 1 giọt 3.3 Chất hoạt hóa và kìm hãm 19 Downloaded by LIEU TAI (tailieuso.14@gmail.com)