Báo cáo thực hành Hoá Sinh nhóm 5 Đại học y hp CHƯƠNG PROTID BÀI 1 ACID AMIN Thí nghiệm 1 Phản ứng Ninhydrin tìm acid amin Hiện tượng + Ống 1 có màu xanh tím đậm + Ống 2 có màu vàng + Ống 3 có màu xan[.]
Đại học y hp CHƯƠNG: PROTID BÀI 1: ACID AMIN Thí nghiệm : Phản ứng Ninhydrin tìm acid amin Hiện tượng: + Ống 1: có màu xanh tím đậm + Ống 2: có màu vàng + Ống 3: có màu xanh tím nhạt Giải thích: + Ống 1: Glycin α acid amin nên tham gia phản ứng ninhydrin tạo phức màu xanh tím + Ống 2: Prolin tham gia phản ứng với ninhydrin tạo phức màu vàng + Ống 3: Protein cấu tạo nhiều acid amin tham gia phản ứng với ninhydrin tạo phức màu xanh tím nhạt nồng độ acid amin có protein thấp Ứng dụng: Tìm axit amin dung dịch Thí nghiệm : Phản ứng Adamkievic tìm tryptophan Hiện tượng: + Ống : lúc đầu có lớp màu hồng nhạt ngăn lớp chất lỏng + Ống : suốt , khơng đổi màu Giải thích: + Ống 1: Trong protein có tryptophan nên tác dụng với acid glyocilic (có lẫn acid acetic) tạo sản phẩm ngưng kết màu hồng dung dịch lỏng (Không lên màu nồng độ tryptophan protein thấp tay nghề, thao tác người làm lắc nhỏ axit) + Ống 2: khơng tượng dung dịch khơng phải tryptophan Ứng dụng: Nhận biết tryptophan Thí nghiệm 3: Phản ứng Xantoprotein tìm acid amin dạng vịng Hiện tượng: + Ống 1: tạo phức hợp màu da cam + Ống 2: không tạo phức hợp màu da cam Giải thích: + Ống1: Dưới tác dụng HNO3,nhân thơm acid amin (tyrosine có protein) bị gắn nitro tạo thành dẫn xuất nitro màu vàng, môi trường NaOH tạo thành dạng muối Natri màu da cam + Ống 2: Glycin acid amin đơn giản khơng có nhân thơm môi trường NaOH không tạo phức màu da cam Ứng dụng: Tìm acid amin dạng vịng Thí nghiệm 4: Phản ứng tạo PbS phát acid amin chứa lưu huỳnh Hiện tượng : Dung dịch ống nghiệm có màu đen xám kết tủa Giải thích : Trong môi trường kiềm đun sôi, cystin cystein phản ứng với muối chì tạo thành PbS ( Nếu dung dịch màu nâu thời gian cách thủy chưa đủ lâu, nhiệt độ nồi không đủ sôi người lấy không đủ lượng dung dịch protein ) Ứng dụng : Phát acid amin chứa lưu huỳnh Bài 2: PROTEIN Phản ứng Biure Hiện tượng: - Ống 1: tạo phức màu tím - Ống 2: khơng tạo phức tím Giải thích: - Ống 1: Protein có liên kết peptit, liên kết kết hợp với Cu2+ Biure tạo nên phức hợp màu tím - Ống 2: Glycin acid amin khơng có liên kết peptit, khơng tạo phức màu tím Ứng dụng: Xác định có mặt liên kết peptit 2.Phương pháp tủa 2.1: Tủa protein cách đun sôi Hiện tượng: + Ống 1: Dung dịch suốt, không tủa + Ống 2: Kết tủa trắng đục + Ống 3: Dung dịch suốt, không tủa + Ống 4: Kết tủa trắng đục + Ống 5: Dung dịch suốt, khơng tủa Giải thích: + Ống 1: Protein 1% thẩm tích đun sơi làm lớp áo nước mà khơng làm lớp điện tích nên không tạo tủa + Ống 2: Acid acetic 1% acid yếu, đưa pH môi trường pHi nên làm lớp điện tích, kết hợp đun sơi làm lớp áo nước nên tạo tủa + Ống 3: Acid acetic 10% acid mạnh, Protein tích điện dương, đun sôi làm lớp áo nước, nên không tạo tủa + Ống 4: Acid axetic 10% đun sôi làm lớp áo nước, kết hợp với NaCl làm lớp điện tích nên tạo tủa + Ống 5: NaOH kiềm mạnh kết hợp với đun sôi làm lớp áo nước, Protein tích điện âm nên khơng tạo tủa Ứng dụng: Khảo sát có mặt chất giúp protein tủa 2.2 : Tủa acid hữu Hiện tượng: Dung dịch ống nghiệm có kết tủa đục Giải thích: protein tác dụng acid sulfosalicylic tạo kết tủa không thuận nghịch (protein bị biến tính) Ứng dụng: Phát protein nước tiểu dịch sinh vật 2.3 : Tủa acid vô Hiện tượng: Lần 1: Ống 1: Kết tủa Ống 2: Kết tủa Lần 2: Ống 1: Kết tủa Ống 2: Tan tủa, trở lại Giải thích: Lần 1: Dưới tác dụng acid vô đậm đặc, protein bị kết tủa (tủa theo kiểu biến tính) Lần 2: + Ống 1: Kết tủa tạo thành muối nitro bền nên không tan + Ống 2: Kết tủa tan hết cho thừa acid đậm đặc làm pH giảm xuống Ứng dụng: Phân biệt protein thật giả 2.4 Tủa muối kim loại nặng ( Muối chì ) Hiện tượng: Dung dịch xuất kết tủa vẩn đục màu trắng Giải thích: Kết tủa trắng ion kim loại làm phá vỡ màng nước, trung hồ điện tích Ứng dụng: Sơ cứu ngộ độc kim loại nặng 2.5: Tủa dung môi hữu Hiện tượng : Dung dịch ống nghiệm xuất kết tủa vẩn đục Giải thích : Protein nước ancol ethylic lấy nước protein Khi cho Nacl bão hoà chất điện giải làm trung hoà protein tạo tủa Ứng dụng : Tách chiết enzym 2.6: Xác định điểm đẳng điện albumin trứng Hiện tượng: Dung dịch ống nghiệm màu vàng đậm ống tạo tủa đậm Giải thích: Dung dịch đệm pH= 4,75 cho tủa albumin mạnh gần với pHi albumin Protein bền vững dung dịch có pH=pHi dễ dàng kết tủa ta cho thêm chất khử nước dung dịch tamin Ứng dụng: Dùng để xác định điểm đẳng điện albumin trứng 2.7: Phân đoạn albumin lòng trắng trứng muối amoni sulfat - phương pháp diêm tích ( phản ứng thuận nghịch ) Hiện tượng : + Ống 1: không kết tủa + Ống 2: kết tủa + Ống 3: kết tủa + Ống 4: kết tủa Giải thích : + Ống 1: Fehling khơng phản ứng với nước cất nên khơng có tượng kết tủa + Ống 2: Trong cấu tạo glucose có nhóm chức andehid mang tính khử nên đun với dung dịch Fehling khử Cu(OH)2 thành Cu2O kết tủa + Ống 3: Trong cấu tạo fructose có nhóm chức ceton mang tính khử nên đun với dung dịch Fehling khử Cu(OH)2 thành Cu2O kết tủa + Ống 4: Trong cấu tạo glactose có nhóm chức andehid mang tính khử nên đun với dung dịch Fehling khử Cu(OH)2 thành Cu2O kết tủa Ứng dụng: Tìm đường nước tiểu Phản ứng Selivanoff xác định cetose Hiện tượng: + Ống 1: không tượng + Ống 2: không tượng + Ống 3: màu đỏ đậm + Ống 4: không tượng + Ống 5: màu đỏ nhạt ( Sau 1' đun ống đổi màu đỏ đậm ống 5, sau 2' ống 3,5 đậm lên ống giữ màu đậm ống 5) Giải thích: + Ống 1: dung dịch khơng có fructose nên khơng tham gia phản ứng + Ống 2: dung dịch khơng có fructose nên không tham gia phản ứng + Ống 3: fructose đun nóng với acid tạo thành 5.Hydroxymethylfurfural Chất tác dụng với resorcin tạo sản phẩm màu đỏ + Ống 4: dung dịch khơng có fructose nên khơng tham gia phản ứng + Ống 5: Trong dd selivanoff A có H₂SO₄ với nhiệt độ sơi thủy phân saccarose tạo thành fructose glucose, fructose tham gia phản ứng selivanoff tạo phức hợp màu đỏ ( nhạt ống saccarose phải thời gian để tham gia phản ứng thủy phân nồng độ fructose ống < ống số mol nhỏ ) Ứng dụng: Xác định có mặt Cetose Xác định tính khử Disaccarid Hiện tượng: + Ống : Không tạo tủa + Ống : Không tạo tủa + Ống : Tạo tủa đỏ gạch + Ống : Tạo tủa đỏ gạch Giải thích: + Ống : Fehling khơng phản ứng với nước cất nên khơng có tượng kết tủa (nếu tạo tủa -> ống nghiệm chưa rửa hố chất, dung dịch khơng đảm bảo,…) + Ống : Trong phân tử saccarose khơng cịn nhóm -OH bán acetal nên khơng có tính khử , không tham gia phản ứng với dung dịch Fehling + Ống 3: Trong cơng thức cấu tạo lactose có nhóm chức OH bán acetal có tính khử, khử Cu(OH)2 dung dịch Fehling tạo kết tủa đỏ gạch + Ống 4: Trong cơng thức cấu tạo maltose có nhóm chức OH bán acetal có tính khử, khử Cu(OH)2 dung dịch Fehling tạo kết tủa đỏ gạch Ứng dụng: Tìm đường thuốc, có giá trị kiểm định thuốc Thủy phân Disaccarid , xác định thành phần cấu tạo Hiện tượng: + Ống 1: tạo kết tủa đỏ gạch + Ống 2: khơng kết tủa Giải thích: + Ống 1: Trong dịch thủy, saccarose thủy phân tạo glucose fructose, glucose có nhóm chức andehyd fructose có nhóm chức ceton phản ứng với Fehling tạo nên kết tủa đỏ gạch + Ống 2: Dịch thủy phân saccarose có glucose fructose khơng tạo kết tủa với Selivanoff A B mà làm dịch chuyển màu đỏ Ứng dụng: Chứng minh Dissaccarid cấu tạo phản tử Monosaccarid , saccarose cấu tạo từ glucose fructose Phản ứng thủy phân Polysaccarid acid Hiện tượng: Ban đầu có màu xanh tím đậm dần chuyển sang màu xanh nhạt, đỏ vàng, vàng cuối không làm màu iod Giải thích: Trong mơi trường acid , tác dụng nhiệt độ , liên kết glycosid phân tử Polysaccarid bị thủy phân, làm cho phân tử Polysaccarid bị cắt nhỏ dần tạo dextrin, sản phẩm cuối glucose Ứng dụng: Sản xuất đường BÀI 2: Chuyển hoá glucid 1.Chiết xuất Glycogen từ tổ chức động vật Nguyên tắc : - Glycogen Polysaccarid dự trữ người động vật, tập trung nhiều gần - Sau phá hủy tổ chức chứa nhiều Glycogen kiềm đun sơi nhiệt độ, Glycogen giải phóng, bị tủa ancol nhiệt độ lạnh Lấy tủa rửa tủa cách lọc giấy lọc không gấp nếp, lọc xong rửa tủa lần ancol ethylic 90 độ, lần 3ml Hút ancol pipet thả từ vào giấy lọc theo vòng tròn để vừa rửa tủa kéo tủa xuống đáy giấy Khi ancol chảy hết thu tủa Glycogen giấy lọc Hồ tan tủa nước cất nóng thu dung dịch Glycogen Tiến hành : - Cho vào ống nghiệm to 2g gan tươi nghiền + 3ml KOH 30% Đun sôi cách thủy ( vừa đun vừa lắc ) để tổ chức tan hết Làm lạnh đá Cho 0,2 ml Na2SO4 bão hoà, lắc + 5ml ancol ethylic 96 độ, lắc Để đá phút Ly tâm lọc lấy tủa, vạn bỏ nước rửa tủa Rửa tủa lần ancol ethylic 96 độ Hoà tan tủa trở lại với 3ml nước cất nóng 60 độ Kiểm tra sản phẩm sau chiết suất: - Phản ứng màu với iod : 10 giọt dd Glycogen + giọt H2SO4 5N, lắc , + giọt iod => Dung dịch màu nâu - Thử phản ứng Fehling : 1ml dd thuốc thử Fehling + 10 giọt dd Glycogen, đun sôi cách thủy phút => Glycogen Polysaccarid khơng có tính khử nên không phản ứng với thuốc thử Fehling, màu dung dịch màu thuốc thử Fehling - Thủy phân Glycogen xác định thành phần cấu tạo: 1,5ml dd Glycogen + 1,5ml H2SO4 5N, lắc đều, đun sôi cách thủy 30 phút, trung hoà NaOH 5N + Thử phản ứng Fehling: 1ml dd thuốc thử Fehling + 20 giọt dịch thủy phân Glycogen, lắc đều, đun sôi cách thủy phút => Dd Glycogen tinh khiết khơng có tính khử, sau thủy phân tạo thành thành phần có tính khử Trong mơi trường acid nhiệt độ liên kết Glycosid phân tử Polysaccarid bị thủy phân làm cho phân tử bị tách nhỏ dần, sản phẩm cuối thu glucose Do dịch thủy phân Glycogen cho phản ứng với thuốc thử Fehling dung dịch có màu đỏ gạch Cu2+ 2.Xác định Acid lactic Hiện tượng: Dung dịch có màu vàng chanh Giải thích: Acid lactic chiết xuất từ tươi, phản ứng acid lactic với phenol sắt tạo lactat sắt màu vàng Ứng dụng: Định lượng acid lactic máu để giá chức gan, khả tưới máu CHƯƠNG: LIPID 1.Nhũ tương hoá dầu lạc Hiện tượng: + Ống 1: Nhũ tương không bền + Ống 2,3,4,5,6: Nhũ tương bền Giải thích: + Ống : sau lắc dầu ăn bị phân tán tạo hạt dầu ăn nhỏ nước Do dầu ăn chất không phân cực mà nước dung môi phân cực nên dầu ăn không tan nước tạo hạt nhũ tương mặt nước + Ống 2,3,4,5: Khi lắc mạnh làm phân tử lipid tách nước bao quanh tạo thành mảng lipid nhỏ lớp nước Do chất nhũ tương hóa vừa có đầu kị nước vừa có đầu ưa nước, đầu kị nước bao lấy đâu kỵ nước lipid, đưa đầu ưa xe nước liên kết chặt chẽ với phân tử nước làm cho phân tử lipid liên kết lại với tạo thành nhũ tương bền + Ống 6: sau lắc thấy dầu ăn hồ tan vào dung dịch alcol tạo dung dịch suốt dầu ăn chất không phân cực nên tan dung môi không phân cực ancol ( chất nhũ tương hoá mạnh ) Để yên 15p tiếp tục quan sát thấy dầu ăn dần lắng xuống đáy ống nghiệm Ứng dụng: Sản xuất mỹ phẩm, vận chuyển lipid máu, nhũ tương hoá lipid, tẩy rửa vết bẩn có chất lipid Thủy phân Leucithin xác định thành phần cấu tạo Acid béo : Là váng mỡ bề mặt dung dịch Cholin: Tinh thể màu nâu periodid cholin có dạng mảnh cắt màu nâu Xác định glycerol : Glycerol đun nóng với chất khử nước KHSO4 bị hai phân tử nước tạo andehyd acrylic, aldehyd acrylic khử Ag2O thành Ag kết tủa màu xám đen, mùi mỡ khét Xác định thành phần acid phosphoric: H3PO4 tác dụng với amoni molypdat môi trường acid nitric tạo thành amoniphospho molydat màu vàng chanh 4.Phản ứng xà phịng hố acid béo Hiện tượng: Xuất bọt xà phịng Giải thích: Triglycerid có dầu lạc kết hợp với kiềm giải phóng glycerol muối kiềm acid béo Sau đun 30’ dung dịch sánh kết q trình xà phịng hố Sau thêm nước cất, lắc lên khơng khí dung dịch tạo điều kiện cho bọt xà phòng xuất Ứng dụng: Sản xuất xà phòng CHƯƠNG: ENZYME BÀI 1: Hoạt động enzyme 1.Hoạt động enzym Amylase Hiện tượng: + Dung dịch lỗ có màu xanh tím, dần chuyển sang vàng đỏ, vàng, cuối không làm màu iod + Phản ứng Fehling: Xuất kết tủa đỏ gạch Giải thích: + Do ban đầu enzym chưa thủy phân tinh bột nên cho iod vào dung dịch có màu xanh tím, sau phút, tinh bột bị enzym thủy phân tạo thành dextrin làm dung dịch khay lỗ chuyển màu đỏ vàng, sau 10 phút tinh bột bị enzym thủy phân hết tạo sản phẩm cuối maltose không làm màu iod + Phản ứng Fehling: Trong môi trường kiềm đun sôi, tinh bột bị enzym thủy phân thành glucose, tham gia vào q trình khử Cu(OH)2 có fehling thành Cu2O kết tủa đỏ gạch Hoạt động enzym vận chuyển nhóm Transaminase Hiện tượng: + Ống : nâu đỏ đậm + Ống 2: nâu đỏ nhạt Giải thích: Cả ống có màu nâu đỏ có phản ứng acid pyruvic tác dụng với dd 2-4 DPH môi trường kiềm (NaOH) tạo thành dung dịch có màu nâu đỏ + Ống :đậm màu có acid pyruvic có từ trình glucose chuyển thành acid pyruvic + Ống 2: nhạt màu enzyme đun sôi bị biến tính chức nên cịn acid pyruvic tác dụng dẫn đến màu nhạt Ứng dụng: Đo hoạt độ enzyme huyết Hoạt động enzym Lipase Hiện tượng: + Ống 1: dung dịch không màu + Ống 2: dung dịch màu hồng Giải thích: Khi cho phenolphtalein 1% vào dd sữa 5% dung dịch khơng đổi màu chứng tỏ dd sữa có mơi trường trung tính Na₂CO₃ bazo nhỏ vào ống nghiệm làm dung dịch chuyển sang màu hồng + Ống 1: Trong dịch tụy có enzym lipase thủy phân triglycerid dd sữa tạo glicerol acid béo Acid béo làm acid hóa mơi trường phản ứng Mơi trường acid trung hịa mơi trường bazo Na₂CO₃ nên làm màu dung dịch + Ống 2: Nước cất không làm màu dung dịch Ứng dụng: Chứng minh vai trò, chức enzyme có nguồn gốc từ tuyến tụy, thủy phân trglycerid 4.Hoạt động catalase Hiện tượng: Tàn đỏ cháy Giải thích: Trong dung dịch nghiền gan có enzyme catalase ( thuộc nhóm enzyo oxi hố khử có ty thể ) Catalase xúc tác phản ứng phân hủy H2O2 ( tạo thành từ q trình oxy hố khử sinh học ) thành H2O giải phóng oxi Oxi trữ ống cung cấp cháy tàn đỏ que hương Ứng dụng: Làm bụi bẩn BÀI 2: Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme 1.Ảnh hưởng nhiệt độ Hiện tượng: + Ống ( Nước đá ) : màu xanh + Ống ( Đun sôi cách thủy ) : màu vàng + Ống ( Nhiệt độ phịng ): khơng đổi màu iod ( vàng nâu ) Giải thích: + Ống 1: Enzyme bị biến tính nhiệt độ nên tinh bột không bị phân giải thành đường tác dụng với iod tạo màu xanh + Ống 2: Enzyme bị biến tính nhiệt độ hoạt động, khả xúc tác chưa tối đa ,tinh bột bị phân giải thành dextrin tác dụng với iod tạo màu vàng + Ống 3: Tinh bột bị enzyme amilaza phân giải hết nên cho thuốc thử iod vào không đổi màu Ứng dụng: Tạo nhiệt độ tối ưu để enzyme phản ứng, bảo quản enzyme Ảnh hưởng pH Hiện tượng: + Ống 1: màu xanh tím + Ống 2: màu vàng nâu + Ống 3: màu xanh tím Giải thích: + Ống 2: pH 6,8 gần pH tối ưu enzyme Amylase nhất, tinh bột bị thuỷ phân hoàn toàn nên tác dụng với iod không làm iod đổi màu + Ống 1,3: Tinh bột chưa thủy phân, enzyme Amylase không hoạt động nên tác dụng với iod tạo màu xanh tím, cho thấy độ pH khơng thích hợp cho hoạt động enzyme Ứng dụng: Tìm pH tối ưu enzyme Ảnh hưởng chất hoạt hoá ức chế Hiện tượng: + Ống 1: màu đỏ vàng ( màu thuốc thử ) + Ống 2: màu đỏ nâu ( màu thuốc thử ) + Ống 3: màu xanh tím Giải thích: + Ống 1: Có màu thuốc thử Tinh bột bị thủy phân thành dextrin enzyme amylase cần thời gian để thủy phân tinh bột nên màu xanh tím bị màu dần Thời gian diễn phản ứng lâu có xảy Vì nước cất khơng phải chất hố chất ức chế + Ống 2: Có màu thuốc thử, khơng xuất màu xanh tím đặc trưng, phản ứng thủy hoạt phân diễn nhanh chứa NaCl làm tăng hoạt độ enzyme Amylase NaCl chất hoạt hố + Ống 3: Tinh bột không bị thủy phân nên cho thuốc thử có màu xanh tím CuSO4 ức chế q trình thủy phân tinh bột enzyme Amylase CuSO4 chất ức chế Ứng dụng: Tìm chất hoạt hoá ức chế enzyme