Báo cáo thí nghiệm hóa sinh thực phẩm

Nguyên tắc thí nghiệm Phương pháp Wohlgemuth dựa vào nguyên tắc tìm nồng độ enzyme thấp nhất để có thể thủy phân tinh bột tha nh dextrin Đơn vị Wohlgemouth là lượng enzyme cần thiết để t

BÁO CÁO CUỐI KÌ

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH

THỰC PHẨM

MÃ SỐ LỚP: PFCB412750_22_2_11CLCGVHD: ThS ĐỖ THÙY KHÁNH LINHTHỰC HIỆN: NHÓM 01 LỚP 21116CL3BHỌC KỲ 2 - NĂM HỌC 2022-2023

Tp Thủ Đức, tháng 03 năm 2023

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCMKHOA ĐÀO TẠO CHẤT LƯỢNG CAONGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA THỰC HÀNH THÍ NGHIỆM

HỌC KỲ II, NĂM HỌC 2022-2023

1 Mã môn học: PFCB412750_22_2_11CLC

2 Giảng viên hướng dẫn: Th.S Đỗ Thùy Khánh Linh

3 Tên đề tài: Báo Cáo Thí Nghiệm Hóa Sinh Thực Phẩm

4 Danh sách nhóm viết báo cáo cuối kì:

TỶ LỆ HOÀN THÀNH

để từ đó hiểu rõ được bản chất của thí nghiệm và rút ra được những mặt còn hạn chế

để khắc phục cho những môn chuyên ngành về sau Trong quá trình thực hành thí nghiệm với vốn kiến thức còn hạn hẹp, hiểu biết chưa sâu nên không tránh khỏi những sai sót trong bài báo cáo, mong cô có thể bỏ qua và chúng em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của cô để kiến thức của mình được hoàn thiện hơn và đồng thời cũng giúp chúng em hiểu biết được rõ hơn vấn đề của bản thân đang mắc phải để có thể kịp thời khắc phục và hoàn thành tốt hơn nữa Những lời nhận xét chỉ bảo của cô

sẽ là hành trang để đời sau này của tụi em, tụi em trân trọng cảm ơn cô!

BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 1: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ALPHA AMYLASE

II Tổng quan về enzyme alpha amylase và nguyên tắc thí nghiệm 1

2 Tiến hành khảo sát hoạt độ enzyme amylase 3

2 Hoạt độ enzyme amylase ở 20 phút ( mẫu đối chứng) 5

5

BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 4: KHẢO SÁT ĐỘNG HỌC VÀ XÁC ĐỊNH

3 Những lỗi sai khi gặp phải trong quá trình thực hành 36

6

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: kết quả khảo sát hoạt độ enzyme alpha amylase (30 phút)

Bảng 1.2: kết quả khảo sát hoạt độ enzyme alpha amylase (20 phút lần 1)

Bảng 1.3: kết quả khảo sát hoạt độ enzyme alpha amylase (20 phút lần 2)

Bảng 1.4: kết quả khảo sát hoạt độ enzyme alpha amylase (20 phút lần 3)

Bảng 2.1: Kết quả thể tích NaOH để chuẩn độ bình thí nghiệm

Bảng 2.2: Kết quả thể tích NaOH để chuẩn độ bình kiểm chứng

Bảng 4.3: kết quả khảo sát động học ở 400C enzyme urease

Bảng 4.4: kết quả khảo sát động học ở 300C enzyme urease

7

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc của alpha amylase

Hình 1.2: kết quả 10 ống nghiệm khảo sát hoạt độ enzyme alpha amylase so với ống 11 (30 phút)

Hình 1.3: kết quả 10 ống nghiệm khảo sát hoạt độ enzyme alpha amylase so với ống 11 (20 phút lần 1)

Hình 1.4: kết quả 10 ống nghiệm khảo sát hoạt độ enzyme alpha amylase so với ống 11 (20 phút lần 2)

Hình 1.5: kết quả 10 ống nghiệm khảo sát hoạt độ enzyme alpha amylase so với ống 11 (20 phút lần 3)

Hình 2.1 : Bình thí nghiệm sau khi lắc trong máy lắc 24h

Hình 2.2: Bình kiểm chứng sau khi lắc trong máy lắc 24h

Hình 4.1 : Phản ứng thủy phân urea xúc tác bằng urease

Hình 4.2 : Phản ứng tạo acid carbonic xúc tác bằng HCHO ngừng phản ứng thủy phân

Hình 4.3 Biểu đồ khảo sát động học urease ở 300C theo Michaelis-Menten Hình 4.4: Đường biểu diễn phương trình Lineweaver-Burk

Hình 4.5 Biểu đồ khảo sát động học urease ở 400C theo Michaelis-Menten Hình 4.6 : trước chuẩn độ

Hình 4.7: sau chuẩn độ

Hình 4.8: dung dịch sau khi chuẩn độ ở 400C

1

BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 1:

XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ALPHA AMYLASE THEO

PHƯƠNG PHÁP WOHLGEMUTH

I Mục tiêu bài thí nghiệm

Biết cách pha dịch chiết enzyme alpha amylase

Hiểu được nguyên tắc của phương pháp Wohlgemuth

Biết cách xác định hoạt độ enzyme bằng phương pháp Wohlgemuth

II Tổng quan về enzyme alpha amylase và nguyên tắc thí nghiệm

1 Tổng quan về enzyme alpha amylase

Enzyme alpha amylase (EC 3.2.1.1) còn có tên gọi khác là 1,4-alpha-D-glucan glucanhydrolase Đây la một enzyme thuộc nhóm enzyme thủy phân và có khả năng thủy phân ngẫu nhiên liên kết α-1,4 glycosidic trong tinh bột để tạo tha nh các đoạn dextrin mạch ngắn hoặc có thể thủy phân ra glucose và maltose Quá trình nghiên cứu

và ứng dụng của enzyme này rất quan trọng, nhất la tác động của enzyme lên tinh bột Bởi tinh bột là thành phần quan trọng trong chế độ ăn uống của con người, là sản phẩm lưu trữ chính của nhiều loại cây trồng có giá trị kinh tế cao như gạo, lúa mỳ, ngô, khoai

mỳ, khoai tây,…

Tinh b t ộ 𝛼 − 𝑎𝑚𝑦𝑙𝑎𝑠𝑒→ Dextrin phân tử lượng thấp

Hình 1.1: Cấu trúc của alpha amylase

2

2 Nguyên tắc thí nghiệm

Phương pháp Wohlgemuth dựa vào nguyên tắc tìm nồng độ enzyme thấp nhất để

có thể thủy phân tinh bột tha nh dextrin

Đơn vị Wohlgemouth là lượng enzyme cần thiết để thủy phân hoàn toàn 1mg tinh bột ở 37oC sau 30 phút có Cl-làm chất hoạt hóa

Dùng Iodine 0,3% để kiểm tra sự có mặt của tinh bột

Xay cả vỏ

3

2 Tiến hành khảo sát hoạt độ enzyme amylase

- Ở ống nghiệm (11): cho vào 3ml nước cất, 2 giọt Iodine trong KI, so sánh màu của 10 ống nghiệm trên để xác định ống có nồng độ enzyme thấp nhất thủy phân hoàn toàn tinh bột thành dextrin

Cho vào mỗi ống nghiệm 1ml dd hồ tinh bột 0,5%(cơ chất), lắc đều Để vào tủ điều nhiệt ở 37

Sau chính xác 30 phút thì lấy ra, đun cách thủy 10 ống nghiệm trong 10

4

● Đối với mẫu đối chứng thì lặp lại 3 lần tương tự các bước trên nhưng thời gian để vào tủ điều nhiệt là 20 phút

● Ý nghĩa của các hóa chất:

- NaCl: là chất dùng để cung cấp ion Cl làm hoạt hóa enzyme.-

- Hồ tinh bột: đóng vai trò là cơ chất

- Đun cách thủy nhằm ức chế enzyme, kết thúc quá trình thủy phân

- Thêm 2 giọt Iodine vào làm chất chỉ thị để nhận biết lượng tinh bột trong mỗi ống đã bị thủy phân

V Kết quả

1 Hoạt độ enzyme amylase ở 30 phút

Hình 2: kết quả 10 ống nghiệm khảo sát hoạt độ enzyme alpha amylase so với ống 11

Bảng 1.1: kết quả khảo sát hoạt độ enzyme alpha amylase (30 phút)

Với: các ký hiệu v, n, x lần lượt la ma u va ng, nâu, xanh đen của dung dịch trong ống nghiệm

- Tính kết quả

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

V1: Thể tích dịch chiết enzyme cho vào ống nghiệm (1) (1ml)

F: độ pha loãng của ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ nhất thủy phân hoàn toàn tinh bột (ống nghiệm có màu trùng với màu của ống nghiệm 11)

Số đơn vị Wohlgemuth có trong 1 ml dịch chiết enzyme (Nw)

𝑉1× 𝑊=

100

1 × 1.25= 80

2 Hoạt độ enzyme amylase ở 20 phút ( mẫu đối chứng)

Hình 1.3: kết quả 10 ống nghiệm khảo sát hoạt độ enzyme alpha amylase so với ống 11 (20 phút lần 1)

Bảng 1.2: kết quả khảo sát hoạt độ enzyme alpha amylase (20 phút lần 1)

Với: các ký hiệu v, n, x lần lượt la ma u va ng, nâu, xanh đen của dung dịch trong ống nghiệm

V1: Thể tích dịch chiết enzyme cho vào ống nghiệm (1) (1ml)

F: độ pha loãng của ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ nhất thủy phân hoàn toàn tinh bột (ống nghiệm có màu trùng với màu của ống nghiệm 11)

Số đơn vị Wohlgemuth có trong 1 ml dịch chiết enzyme (Nw)

𝑉1× 𝑊=

100

1 × 2.5= 40

Bảng 1.3: kết quả khảo sát hoạt độ enzyme alpha amylase (20 phút lần 2)

Với: các ký hiệu v, n, x lần lượt la ma u va ng, nâu, xanh đen của dung dịch trong ống nghiệm

F: độ pha loãng của ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ nhất thủy phân hoàn toàn tinh bột (ống nghiệm có màu trùng với màu của ống nghiệm 11)

Số đơn vị Wohlgemuth có trong 1 ml dịch chiết enzyme (Nw)

9

Bảng 1.4: kết quả khảo sát hoạt độ enzyme alpha amylase (20 phút lần 3)

Với: các ký hiệu v, n, x lần lượt la ma u va ng, nâu, xanh đen của dung dịch trong ống nghiệm

V1: Thể tích dịch chiết enzyme cho vào ống nghiệm (1) (1ml)

F: độ pha loãng của ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ nhất thủy phân hoàn toàn tinh bột (ống nghiệm có màu trùng với màu của ống nghiệm 11)

Số đơn vị Wohlgemuth có trong 1 ml dịch chiết enzyme (Nw)

- Ống nghiệm thứ 4 và thứ 5 có nồng độ enzyme thấp nhất có thể thủy phân hoàn toàn lượng tinh bột thành dextrin Vì thế mới trùng với màu của ống nghiệm 11

10

- Ống nghiệm thứ 6 và thứ 7 có sự chuyển sang màu nâu và màu đỏ tức là nồng

độ enzyme vẫn còn nhưng chỉ thủy phân được ½ lượng tinh bột

- Ống nghiệm 8 đến ống nghiệm thứ 10 thì nồng độ enzyme bị pha loãng cao nên không còn enzyme hoặc còn rất ít emzyme nên không đủ để thủy phân tinh bột,

vì thế có sự đổi màu sang xanh đen

Với kết quả ở mẫu đối chứng thì do chỉ có 20 phút nên enzyme chưa đủ thời gian để enzyme thủy phân tinh bột vì thế mà những ống có nồng độ enzyme thấp nhất để thủy phân hoàn toàn lượng tinh bột sẽ nằm trong khoảng từ ống nghiệm 1 đến ống nghiệm thứ 3

Có sự sai số là do thao tác của người thực hiện chưa đúng, sử dụng hóa chất không chính xác, do không để ý thời gian của enzyme ( thời gian quá dài hoặc thời gian quá ngắn), hoặc do nhiệt độ và pH không đúng vì nếu nhiệt độ hoặc pH không đúng, nó có thể làm giảm hoạt động của amylase hoặc gây phá hủy hoạt động của amylase,…

11

BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 2: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ LIPASE

I CHUẨN BỊ THÍ NGHIỆM

1 Mục tiêu thí nghiệm

- Xác định được chính xác hoạt độ lipase trong hạt đậu nành

- Biết cách pha dịch chiết lipase, cân đo pha chế các hoá chất trong phòng thí nghiệm như đệm acetate, Phenolphthalein 1%, NaOH 0,1N,…

- Biết cách vận hành và cách sử dụng của các máy móc trong phòng thí nghiệm

- Biết thêm được vai trò sự ứng dụng của enzyme lipase trong thực tế, ở nhiều lĩnh vực: công nghiệp, quản lý môi trường, hoá chất, tẩy rửa,…

2 Nguyên tắc thí nghiệm

Tổng quan về enzyme lipase

- Lipase (EC 3.1.1.3) có nguồn gốc đa dạng: thực vật, động vật, vi sinh vật

và đặc biệt là có ở vi khuẩn và nấm Là enzyme tan trong nước và xúc tác cho quá trình thuỷ phân triglyceride thành glycerol và các acid béo nhờ hoạt động của nó trên bề mặt phân pha dầu – nước

- Lipase xúc tác phản ứng thuỷ phân sẽ cắt lần lượt các liên kết -ester chứ không cắt cùng lúc 3 liên kết Quá trình phản ứng sẽ thường chậm hơn so với các enzyme khác như protase, amylase,…

- Trong thực vật, lipase hoạt động ở các mô lưu trữ lipid trong quá trình hạt nảy mầm Các lipid này xúc tác quá trình thuỷ phân triacylglycerol lưu trữ thành acid béo, được chuyển thành đường, acid amin và các chuỗi carbon cần thiết để

hỗ trợ sự phát triển của phôi

- Lipase có độ pH tôi ưu là 6 – 8, và bị bất hoạt hoàn toàn su 30 phút ở 600C

12

Nguyên tắc

Dưới tác dụng của enzyme lipase, lipid bị thuỷ phân và giải phóng acid béo Hàm lượng acid được chuẩn độ bằng kiềm Hoạt độ enzyme là lượng kiềm cần trung hoà acid mới được hình thành Cơ chất tốt nhất đối với lipase chính là lipid của cùng một đối tượng enzyme

- Cồn 96 , làm enzyme ngưng hoạt động sau khi đem ra khỏi máy lắc do cồn có 0

thể gây biến tính protein

- Toluen, là dung môi hoà tan cơ chất

- Ether ethylic, là dung môi góp phần lôi kéo những thành phần béo còn xót lại trong hạt đậu nành tránh gây sai số

- NaOH 0,1N: cân 0,8g NaOH cho vào 200ml nước cất ta được 200ml dung dịch NaOH 0,1N, là chất chuẩn độ trung hoà acid béo sinh ra

mi n

Chuyê n va o erlen, cho them 10 ml nu ơc câ t va lă c đê u trong 15 ph 30 C 0u

Thêm va o 1 ml dâ u đạu na nh (la m co châ t) va 5 ml đẹm acetate vơi va i gio

toluene, lă c đê u hô n hơ p ơ 30 C trong 24 gi0 ơ

Khi hê t thơi gian pha n ưng, cho va o mô i b nh 25ml ci ô n 960 va 15m

lă c đê u va đê yen trong 2 phu t

Chuâ n đọ bă ng dung di ch NaOH 0,1N vơ i chi thi phenolphthalein

nghiẹ m đu ơ c lạp lai 3 lâ n

Chuâ n bi mọt bi nh kiê m chưng nhu ng sư du ng di ch chiê t enzyme đu

ca ch thu y 10 phu t đê la m mt t nh triâ t hou ơ c khi cho co châ t vaa

Kết quả (Ghi nhận, tính toán, giải thích)

14

II BÁO CÁO KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

1 Kết quả thí nghiệm

Hình 2.1 : Bình thí nghiệm sau khi lắc trong máy lắc 24h

Hình 2.2: Bình kiểm chứng sau khi lắc trong máy lắc 24h

Bảng 2.1: Kết quả thể tích NaOH để chuẩn độ bình kiểm chứng

*Áp dụng công thức để tính hoạt độ enzyme lipase

Hoạt độ của lipase (X) được biểu thị bằng số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ lượng acid tự do sinh ra do lipase trích từ 10g hạt thủy phân trong 24 giờ

X = (a - b)×10×k/m

a: số ml NaOH để chuẩn độ trong bình thí nghiệm

b: số ml NaOH để chuẩn độ trong bình kiểm chứng

k: hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0,1N (k=1)

m: khối lượng hạt sử dụng (m=5g)

16

X = (4,88 1,63) ×10×1/5 = 6,5 –

2 Đánh giá kết quả

Ở bình thí nghiệm, ta thấy thể tích NaOH lệch nhau giữa bình 1, 2

và 3 là tương đối lớn (bình 1 lệch với bình thứ 2 là 0,4 ml, bình 2 lệch với bình 3

là 0,15 ml), điều này xảy ra do nhiều nguyên nhân khác nhau trong quá trình làm thí nghiệm (chuẩn bị mẫu, thao tác thí nghiệm, đo đạc,…)

Ở bình kiểm chứng, ta thấy rằng bình kiểm chứng thứ 2 quá khác biệt so với hai bình còn lại, gây sai số rất lớn (do trong quá trình làm thí nghiệm thao tác bị sai, phải làm lại 1 trong số 3 bình kiểm chứng, nên gây ra sự khác nhau

về thời gian đun, nhiệt độ đun, thời gian lắc, kĩ thuật lắc,…) Nhưng chung quy lại, thể tích NaOH dùng ở bình kiểm chứng luôn thấp hơn bình thí nghiệm, vì ở bình kiểm chứng, enzyme đã được đun cách thuỷ để bất hoạt enzyme, enzyme bị mất hoạt tính trước khi cho cơ chất là dầu đậu nành vào, trong khi bình thí thị thì không đun, enzyme vẫn hoạt động thuỷ phân bình thường

Sau khi lặp lại thí nghiệm 3 lần ở bình kiểm chứng và bình thí nghiệm, lấy giá trị trung bình và tính toán được kết quả hoạt độ của enzyme lipase

là tương đối thấp (X=6,5), vì vậy có thể nói rằng hiệu suất thuỷ phân lipid của enzyme lấy từ hạt đậu nành sẽ không cho hiệu quả tối ưu

3 Bàn luận

Bàn luận về quá trình thí nghiệm:

- Trong bài thí nghiệm này, khi chuẩn độ lượng acid béo sinh ra do quá trình thuỷ phân lipid bởi enzyme lipase với NaOH thì ta dùng máy pH kế để xác định điểm pH trung hoà (cũng chính là điểm tương đương) Còn nếu theo lý thuyết, ta phải chuẩn độ NaOH đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt (NaOH trung hoà hết lượng acid béo, rồi phản ứng với chất chỉ thị làm dung dịch chuyển màu) nhưng vì dung dịch quá đục (quan sát hình 2.1 và 2.2 ta có thể thấy) làm chúng

ta khó quan sát màu khi chuẩn độ, do đó chũng ta sẽ dùng máy đo pH để có kết quả chính xác nhất Trong quá trình cho NaOH chuẩn độ với máy đo pH, ta cần

- Vì enzyme lipase là enzyme có hoạt độ thấp, cần thời gian lâu thì mới có thể thuỷ phân hoàn toàn lượng lipid trong dầu, vì thế sau khi cho cơ chất, đệm acetate cùng vài giọt toluem, ta đem các bình erlen vào máy lắc trong 24h Ổn định nhiệt độ ở 30 để tạo điều kiện tốt nhất cho enzyme tiến hành quá trình thuỷ 0

phân, nếu nhiệt độ quá cao sẽ gây mất hoạt tính của enzyme, lipid không được thuỷ phân hoàn toàn và gây sai số

Những lỗi sai mắc phải khi làm thí nghiệm:

- Enzyme có thể bị mất một phần hoạt tính trong qúa trình xay, do ma sát với lưỡi dao máy xay và tốc độ vòng xoay của máy nhanh khó kiểm soát

- Những sai số trong quá trình cân để pha dịch chiết enzyme lipase, dung dịch hoá chất chưa đạt độ chính xác tuyệt đối

- Khi bất hoạt enzyme, canh thời gian không chính xác 10 phút Vì thiếu cẩn trọng nên phải làm lại 1 bình kiểm chứng nên điều kiện bất hoạt enzyme (nhiệt

độ, thời gian, ) khác với hai bình còn lại gây chênh lệch số liệu lớn

- Trong quá trình chuẩn độ, sai số do đọc kết quả không chính xác nhưng sai

số này không đáng kể

Những điều lưu ý:

- Khi xay hạt đậu nành để tạo dịch chiết enzyme lipase, nên xay thật mịn để tăng hiệu quả trích ly, hơn nữa cần phải chọn hạt đậu nành mới, không bị mốc hay hư hỏng, ít tạp chất, nếu không sẽ làm ảnh hưởng lớn đến kết quả