Báo cáo thí nghiệm hóa sinh thực phẩm

Nguyên tắc thí nghiệm Phương pháp Wohlgemuth dựa vào nguyên tắc tìm nồng độ enzyme thấp nhất để có thể thủy phân tinh bột tha nh dextrin Đơn vị Wohlgemouth là lượng enzyme cần thiết để t

Trang 1

BÁO CÁO CUỐI KÌ

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH

Trang 2

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM KHOA ĐÀO TẠO CHẤT LƯỢNG CAO

NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Trang 3

DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA THỰC HÀNH THÍ NGHIỆM HỌC KỲ II, NĂM HỌC 2022-2023

1 Mã môn học: PFCB412750_22_2_11CLC 2 Giảng viên hướng dẫn: Th.S Đỗ Thùy Khánh Linh 3 Tên đề tài: Báo Cáo Thí Nghiệm Hóa Sinh Thực Phẩm 4 Danh sách nhóm viết báo cáo cuối kì:

Trang 4

3 Giáo viên chấm điểm

LỜI CẢM ƠN

Lời nói đầu tiên, chúng em xin gửi lời cảm ơn trân trọng nhất đến giảng viên Ths Đỗ Thùy Khánh Linh và các anh trợ giảng đã hỗ trợ cho tụi em về mặt kiến thức lý thuyết lẫn thực hành Môn học thí nghiệm này tuy chỉ học trong vòng 3 tuần nhưng đã giúp tụi em hiểu rõ hơn về những quy tắc trong phòng thí nghiệm, các thao tác khi thực hành để từ đó hiểu rõ được bản chất của thí nghiệm và rút ra được những mặt còn hạn chế để khắc phục cho những môn chuyên ngành về sau Trong quá trình thực hành thí nghiệm với vốn kiến thức còn hạn hẹp, hiểu biết chưa sâu nên không tránh khỏi những sai sót trong bài báo cáo, mong cô có thể bỏ qua và chúng em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của cô để kiến thức của mình được hoàn thiện hơn và đồng thời cũng giúp chúng em hiểu biết được rõ hơn vấn đề của bản thân đang mắc phải để có thể kịp thời khắc phục và hoàn thành tốt hơn nữa Những lời nhận xét chỉ bảo của cô sẽ là hành trang để đời sau này của tụi em, tụi em trân trọng cảm ơn cô!

Trang 5

BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 1: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ALPHA AMYLASE

II Tổng quan về enzyme alpha amylase và nguyên tắc thí nghiệm 1

2 Tiến hành khảo sát hoạt độ enzyme amylase 3

2 Hoạt độ enzyme amylase ở 20 phút ( mẫu đối chứng) 5

Trang 6

5

BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 4: KHẢO SÁT ĐỘNG HỌC VÀ XÁC ĐỊNH

3 Những lỗi sai khi gặp phải trong quá trình thực hành 36

Trang 7

6 DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: kết quả khảo sát hoạt độ enzyme alpha amylase (30 phút) Bảng 1.2: kết quả khảo sát hoạt độ enzyme alpha amylase (20 phút lần 1) Bảng 1.3: kết quả khảo sát hoạt độ enzyme alpha amylase (20 phút lần 2) Bảng 1.4: kết quả khảo sát hoạt độ enzyme alpha amylase (20 phút lần 3) Bảng 2.1: Kết quả thể tích NaOH để chuẩn độ bình thí nghiệm

Bảng 2.2: Kết quả thể tích NaOH để chuẩn độ bình kiểm chứng Bảng 4.3: kết quả khảo sát động học ở 400C enzyme urease Bảng 4.4: kết quả khảo sát động học ở 300C enzyme urease

Trang 8

7 DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc của alpha amylase

Hình 1.2: kết quả 10 ống nghiệm khảo sát hoạt độ enzyme alpha amylase so với

Hình 2.1 : Bình thí nghiệm sau khi lắc trong máy lắc 24h Hình 2.2: Bình kiểm chứng sau khi lắc trong máy lắc 24h Hình 4.1 : Phản ứng thủy phân urea xúc tác bằng urease

Hình 4.2 : Phản ứng tạo acid carbonic xúc tác bằng HCHO ngừng phản ứng thủy phân

Hình 4.3 Biểu đồ khảo sát động học urease ở 300C theo Michaelis-Menten Hình 4.4: Đường biểu diễn phương trình Lineweaver-Burk

Hình 4.5 Biểu đồ khảo sát động học urease ở 400C theo Michaelis-Menten Hình 4.6 : trước chuẩn độ

Hình 4.7: sau chuẩn độ

Hình 4.8: dung dịch sau khi chuẩn độ ở 400C

Trang 9

1

BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 1:

XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ALPHA AMYLASE THEO PHƯƠNG PHÁP WOHLGEMUTH

I Mục tiêu bài thí nghiệm

Biết cách pha dịch chiết enzyme alpha amylase Hiểu được nguyên tắc của phương pháp Wohlgemuth

Biết cách xác định hoạt độ enzyme bằng phương pháp Wohlgemuth II Tổng quan về enzyme alpha amylase và nguyên tắc thí nghiệm

1 Tổng quan về enzyme alpha amylase

Enzyme alpha amylase (EC 3.2.1.1) còn có tên gọi khác là 1,4-alpha-D-glucan glucanhydrolase Đây la một enzyme thuộc nhóm enzyme thủy phân và có khả năng thủy phân ngẫu nhiên liên kết α-1,4 glycosidic trong tinh bột để tạo tha nh các đoạn dextrin mạch ngắn hoặc có thể thủy phân ra glucose và maltose Quá trình nghiên cứu và ứng dụng của enzyme này rất quan trọng, nhất la tác động của enzyme lên tinh bột Bởi tinh bột là thành phần quan trọng trong chế độ ăn uống của con người, là sản phẩm lưu trữ chính của nhiều loại cây trồng có giá trị kinh tế cao như gạo, lúa mỳ, ngô, khoai mỳ, khoai tây,…

Tinh b t ộ 𝛼 − 𝑎𝑚𝑦𝑙𝑎𝑠𝑒→ Dextrin phân tử lượng thấp

Hình 1.1: Cấu trúc của alpha amylase

Trang 10

2 2 Nguyên tắc thí nghiệm

Phương pháp Wohlgemuth dựa vào nguyên tắc tìm nồng độ enzyme thấp nhất để có thể thủy phân tinh bột tha nh dextrin

Đơn vị Wohlgemouth là lượng enzyme cần thiết để thủy phân hoàn toàn 1mg tinh bột ở 37oC sau 30 phút có Cl-làm chất hoạt hóa

Dùng Iodine 0,3% để kiểm tra sự có mặt của tinh bột III Dụng cụ và hóa chất

o 11 ống nghiệm o Pipet 1ml o Tủ điều nhiệt

o NaCl 0,5%: pha 100 ml dung dịch NaCl 0,5 % bằng cách hòa tan 0,5g NaCl vào nước cất, định mức đến 100ml

o Hồ tinh bột 0,5%: pha 100 ml tinh bột 0,5% bằng cách hòa tan 0,5g tinh bột vào 99,5ml nước cất, sau đó đem đi đun cách thủy cho đến khi hòa tan hết

o Bếp điện, nồi

o Iodine 0,3% trong KI 3%: cân 0,3g iodine hòa tan với 99,7 ml nước cất sau đó cho thêm 3g KI va o 100ml dung dịch Iodine 0,3% vừa pha, hòa tan đều và thu được dung dịch cần pha

Trang 11

3 2 Tiến hành khảo sát hoạt độ enzyme amylase

- Ở ống nghiệm (11): cho vào 3ml nước cất, 2 giọt Iodine trong KI, so sánh màu của 10 ống nghiệm trên để xác định ống có nồng độ enzyme thấp nhất thủy phân hoàn toàn tinh bột thành dextrin

Cho vào mỗi ống nghiệm 1ml dd hồ tinh bột 0,5%(cơ chất), lắc đều Để

vào tủ điều nhiệt ở 37

Sau chính xác 30 phút thì lấy ra, đun cách thủy 10 ống nghiệm trong 10

phút

Sau khi đun cách thủy, cho vào mỗi ống nghiệm 2 giọt Iodine trong KI

Quan sát và ghi nhận kết quả

Trang 12

4 ● Đối với mẫu đối chứng thì lặp lại 3 lần tương tự các bước trên nhưng thời gian để vào tủ điều nhiệt là 20 phút

● Ý nghĩa của các hóa chất:

- NaCl: là chất dùng để cung cấp ion Cl làm hoạt hóa enzyme.-

- Hồ tinh bột: đóng vai trò là cơ chất

- Đun cách thủy nhằm ức chế enzyme, kết thúc quá trình thủy phân

- Thêm 2 giọt Iodine vào làm chất chỉ thị để nhận biết lượng tinh bột trong mỗi ống đã bị thủy phân

V Kết quả

1 Hoạt độ enzyme amylase ở 30 phút

Hình 2: kết quả 10 ống nghiệm khảo sát hoạt độ enzyme alpha amylase so với ống 11

Bảng 1.1: kết quả khảo sát hoạt độ enzyme alpha amylase (30 phút)

Với: các ký hiệu v, n, x lần lượt la ma u va ng, nâu, xanh đen của dung dịch trong ống nghiệm

- Tính kết quả

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

Trang 13

F: độ pha loãng của ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ nhất thủy phân hoàn toàn tinh bột (ống nghiệm có màu trùng với màu của ống nghiệm 11)

Số đơn vị Wohlgemuth có trong 1 ml dịch chiết enzyme (Nw)

𝑉1× 𝑊= 100 1 × 1.25= 80 2 Hoạt độ enzyme amylase ở 20 phút ( mẫu đối chứng)

Hình 1.3: kết quả 10 ống nghiệm khảo sát hoạt độ enzyme alpha amylase so với ống 11 (20 phút lần 1)

Trang 14

Bảng 1.2: kết quả khảo sát hoạt độ enzyme alpha amylase (20 phút lần 1)

Với: các ký hiệu v, n, x lần lượt la ma u va ng, nâu, xanh đen của dung dịch trong ống

𝑉1× 𝑊= 100 1 × 2.5= 40

Trang 15

Trang 16

Trang 17

9

Với kết quả dãy từ ống nghiệm được pha loãng với nồng độ giảm dần ta thấy ống nghiệm 1 đến 5 có màu vàng và bắt đầu chuyển dần sang màu nâu ở ống nghiệm thứ 6, sau đó đến ống nghiệm thứ 8 chuyển dần sang ma u xanh đen Điều này có thể giải thích như sau:

- Ống nghiệm thứ 4 và thứ 5 có nồng độ enzyme thấp nhất có thể thủy phân hoàn toàn lượng tinh bột thành dextrin Vì thế mới trùng với màu của ống nghiệm 11

Trang 18

10 - Ống nghiệm thứ 6 và thứ 7 có sự chuyển sang màu nâu và màu đỏ tức là nồng

độ enzyme vẫn còn nhưng chỉ thủy phân được ½ lượng tinh bột

- Ống nghiệm 8 đến ống nghiệm thứ 10 thì nồng độ enzyme bị pha loãng cao nên không còn enzyme hoặc còn rất ít emzyme nên không đủ để thủy phân tinh bột, vì thế có sự đổi màu sang xanh đen

Với kết quả ở mẫu đối chứng thì do chỉ có 20 phút nên enzyme chưa đủ thời gian để enzyme thủy phân tinh bột vì thế mà những ống có nồng độ enzyme thấp nhất để thủy phân hoàn toàn lượng tinh bột sẽ nằm trong khoảng từ ống nghiệm 1 đến ống nghiệm thứ 3

Có sự sai số là do thao tác của người thực hiện chưa đúng, sử dụng hóa chất không chính xác, do không để ý thời gian của enzyme ( thời gian quá dài hoặc thời gian quá ngắn), hoặc do nhiệt độ và pH không đúng vì nếu nhiệt độ hoặc pH không đúng, nó có thể làm giảm hoạt động của amylase hoặc gây phá hủy hoạt động của amylase,…

Trang 19

11

BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 2: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ LIPASE

I CHUẨN BỊ THÍ NGHIỆM 1 Mục tiêu thí nghiệm

- Xác định được chính xác hoạt độ lipase trong hạt đậu nành

- Biết cách pha dịch chiết lipase, cân đo pha chế các hoá chất trong phòng thí nghiệm như đệm acetate, Phenolphthalein 1%, NaOH 0,1N,…

- Biết cách vận hành và cách sử dụng của các máy móc trong phòng thí nghiệm - Biết thêm được vai trò sự ứng dụng của enzyme lipase trong thực tế, ở nhiều lĩnh vực: công nghiệp, quản lý môi trường, hoá chất, tẩy rửa,…

2 Nguyên tắc thí nghiệm Tổng quan về enzyme lipase

- Lipase (EC 3.1.1.3) có nguồn gốc đa dạng: thực vật, động vật, vi sinh vật và đặc biệt là có ở vi khuẩn và nấm Là enzyme tan trong nước và xúc tác cho quá trình thuỷ phân triglyceride thành glycerol và các acid béo nhờ hoạt động của nó trên bề mặt phân pha dầu – nước

- Lipase xúc tác phản ứng thuỷ phân sẽ cắt lần lượt các liên kết -ester chứ không cắt cùng lúc 3 liên kết Quá trình phản ứng sẽ thường chậm hơn so với các enzyme khác như protase, amylase,…

- Trong thực vật, lipase hoạt động ở các mô lưu trữ lipid trong quá trình hạt nảy mầm Các lipid này xúc tác quá trình thuỷ phân triacylglycerol lưu trữ thành acid béo, được chuyển thành đường, acid amin và các chuỗi carbon cần thiết để hỗ trợ sự phát triển của phôi

- Lipase có độ pH tôi ưu là 6 – 8, và bị bất hoạt hoàn toàn su 30 phút ở 600C - Cơ chất tốt nhất là lipid

- Chất kìm hãm sẽ làm giảm hoạt tính xúc tác của enzyme và làm ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng, chúng có thể là các ion kim loại, protein, phân tử vô cơ, phân tử hữu cơ,… tuy có bản chất hoá hoc khác nhau nhưng đều có ảnh hưởng không tốt đến sự hoạt động của enzyme lipase

Trang 20

12 Nguyên tắc

Dưới tác dụng của enzyme lipase, lipid bị thuỷ phân và giải phóng acid béo Hàm lượng acid được chuẩn độ bằng kiềm Hoạt độ enzyme là lượng kiềm cần trung hoà acid mới được hình thành Cơ chất tốt nhất đối với lipase chính là lipid của cùng một đối tượng enzyme

- Đệm acetate pH=4,7 (trộn CH3COOH 0,1N và CH3COONa 0,1N theo tỉ lệ 1:1) Giúp ổn định pH trong dung dịch từ đó giúp quá trình chuẩn độ diễn ra dễ dàng hơn

- Cồn 96 , làm enzyme ngưng hoạt động sau khi đem ra khỏi máy lắc do cồn có 0

thể gây biến tính protein

- Toluen, là dung môi hoà tan cơ chất

- Ether ethylic, là dung môi góp phần lôi kéo những thành phần béo còn xót lại trong hạt đậu nành tránh gây sai số

- NaOH 0,1N: cân 0,8g NaOH cho vào 200ml nước cất ta được 200ml dung dịch NaOH 0,1N, là chất chuẩn độ trung hoà acid béo sinh ra

Trang 21

13 - Phenolphthalein 0,1%: 1,0g phenolphthalein pha với 50ml ethanol và 50ml nước cất Phenolphthalein được dùng làm chất chỉ thị, nhận biết NaOH dư khi chuẩn độ

- Dầu đậu nành tinh khiết là cơ chất cho quá trình enzyme lipase thuỷ phân 4 Quy trình thí nghiệm

Ca n 5g hat đạ u na n nghiê n tha nh bọt

mi n

Chuyê n va o erlen, cho them 10 ml nu ơc câ t va lă c đê u trong 15 ph 30 C 0u

Thêm va o 1 ml dâ u đạu na nh (la m co châ t) va 5 ml đẹm acetate vơi va i gio toluene, lă c đê u hô n hơ p ơ 30 C trong 24 gi0 ơ

Khi hê t thơi gian pha n ưng, cho va o mô i b nh 25ml ci ô n 960 va 15m lă c đê u va đê yen trong 2 phu t

Chuâ n đọ bă ng dung di ch NaOH 0,1N vơ i chi thi phenolphthalein nghiẹ m đu ơ c lạp lai 3 lâ n.

Chuâ n bi mọt bi nh kiê m chưng nhu ng sư du ng di ch chiê t enzyme đu ca ch thu y 10 phu t đê la m mt t nh triâ t hou ơ c khi cho co châ t vaa

Kết quả

(Ghi nhận, tính toán, giải thích)

Trang 22

14 II BÁO CÁO KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

1 Kết quả thí nghiệm

Hình 2.1 : Bình thí nghiệm sau khi lắc trong máy lắc 24h

Hình 2.2: Bình kiểm chứng sau khi lắc trong máy lắc 24h

Trang 23

Bảng 2.1: Kết quả thể tích NaOH để chuẩn độ bình kiểm chứng *Áp dụng công thức để tính hoạt độ enzyme lipase

Hoạt độ của lipase (X) được biểu thị bằng số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ lượng acid tự do sinh ra do lipase trích từ 10g hạt thủy phân trong 24 giờ

X = (a - b)×10×k/m

a: số ml NaOH để chuẩn độ trong bình thí nghiệm b: số ml NaOH để chuẩn độ trong bình kiểm chứng k: hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0,1N (k=1) m: khối lượng hạt sử dụng (m=5g)

Trang 24

16 X = (4,88 1,63) ×10×1/5 = 6,5 –

2 Đánh giá kết quả

Ở bình thí nghiệm, ta thấy thể tích NaOH lệch nhau giữa bình 1, 2 và 3 là tương đối lớn (bình 1 lệch với bình thứ 2 là 0,4 ml, bình 2 lệch với bình 3 là 0,15 ml), điều này xảy ra do nhiều nguyên nhân khác nhau trong quá trình làm thí nghiệm (chuẩn bị mẫu, thao tác thí nghiệm, đo đạc,…)

Ở bình kiểm chứng, ta thấy rằng bình kiểm chứng thứ 2 quá khác biệt so với hai bình còn lại, gây sai số rất lớn (do trong quá trình làm thí nghiệm thao tác bị sai, phải làm lại 1 trong số 3 bình kiểm chứng, nên gây ra sự khác nhau về thời gian đun, nhiệt độ đun, thời gian lắc, kĩ thuật lắc,…) Nhưng chung quy lại, thể tích NaOH dùng ở bình kiểm chứng luôn thấp hơn bình thí nghiệm, vì ở bình kiểm chứng, enzyme đã được đun cách thuỷ để bất hoạt enzyme, enzyme bị mất hoạt tính trước khi cho cơ chất là dầu đậu nành vào, trong khi bình thí thị thì không đun, enzyme vẫn hoạt động thuỷ phân bình thường

Sau khi lặp lại thí nghiệm 3 lần ở bình kiểm chứng và bình thí nghiệm, lấy giá trị trung bình và tính toán được kết quả hoạt độ của enzyme lipase là tương đối thấp (X=6,5), vì vậy có thể nói rằng hiệu suất thuỷ phân lipid của enzyme lấy từ hạt đậu nành sẽ không cho hiệu quả tối ưu

3 Bàn luận

Bàn luận về quá trình thí nghiệm:

- Trong bài thí nghiệm này, khi chuẩn độ lượng acid béo sinh ra do quá trình thuỷ phân lipid bởi enzyme lipase với NaOH thì ta dùng máy pH kế để xác định điểm pH trung hoà (cũng chính là điểm tương đương) Còn nếu theo lý thuyết, ta phải chuẩn độ NaOH đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt (NaOH trung hoà hết lượng acid béo, rồi phản ứng với chất chỉ thị làm dung dịch chuyển màu) nhưng vì dung dịch quá đục (quan sát hình 2.1 và 2.2 ta có thể thấy) làm chúng ta khó quan sát màu khi chuẩn độ, do đó chũng ta sẽ dùng máy đo pH để có kết quả chính xác nhất Trong quá trình cho NaOH chuẩn độ với máy đo pH, ta cần