Mục tiêu bài thí nghiệm
Bài thí nghiệm được thực hiện nhằm mục tiêu xác định khả năng thủy phân thủy phân tinh bột thành các dextrin ngắn
Khảo sát được hoạt độ của enzyme 𝛼-amylase có trong malt
Nắm được các bước tiến hành thí nghiệm xác định hoạt độ enzyme 𝛼-amylase.
Tổng quan về enzyme alpha amylase
Enzyme alpha amylase có số EC: EC 3.2.1.1 Đây là một enzyme có khả năng thủy phân ngẫu nhiên liên kết 𝛼-1,4 glycosidic trong tinh bột để tạo thành các đoạn dextrin ngắn
Vai trò của enzyme amylase:
+ Alpha amylase có tác dụng xúc tác quá trình thủy phân của tinh bột có trong các hạt thành các đoạn dextrin ngắn giúp cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết cho việc nảy mầm
+ Xúc tác cho quá trình tiêu hóa và hấp thu tinh bột ở ruột non dễ dàng hơn + Đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp, nhất là ngành công nghệ thực phẩm Sử dụng nhiều nhất trong sản xuất rượu bia, mạch nha và bánh mì Enzyme 𝛼-amylase phổ biến, rộng rãi trong các sinh vật sống Có trong hệ thống tiêu hóa của con người và nhiều động vật có vú khác Đối với thực vật, 𝛼-amylase có trong các loại hạt nói chung và đại mạch nói riêng Thông thường những hạt đại mạch chưa nảy mầm không có hoặc có rất ít hoạt độ amylase, tuy nhiên trong suốt quá trình nảy mầm của hạt hoạt độ amylase tăng đáng kể.
Nguyên tắc
Sự thủy phân tinh bột của 𝛼 – amylase có thể được tóm gọn thông qua phương trình phản ứng sau:
Tinh bột α−amylase → Dextrin phân tử lượng thấp Bài thí nghiệm được tiến hành bằng phương pháp Wohlgemuth dựa trên nguyên tắc tìm nồng độ enzyme thấp nhất để có thể thủy phân tinh bột thành dextrin Đơn vị Wohlgemuth là lượng enzyme cần thiết để thủy phân hoàn toàn 1mg tinh bột đến dextrin sau 30 phút ở 37 o C có Cl - làm chất hoạt hóa Dùng Iodine 0,3% để kiểm
2 tra sự có mặt của tinh bột, nếu trong mẫu thí nghiệm vẫn còn xuất hiện phức chất màu tím xanh chứng tỏ enzyme alpha-amylase vẫn chưa thủy phân hết lượng tinh bột có trong mẫu.
Dụng cụ & thiết bị thí nghiệm
Dụng cụ
Ống nghiệm – 21 ống Phễu thủy tinh
Pippet 1mL Cối chày sứ
Thiết bị
Máy lắc ổn định nhiệt Jeio Tech
Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị dung dịch
Dung dịch Thể tích Cách pha
Cân 0.5g NaCl trong becher 50mL sau đó hòa tan NaCl với nước cất, cho dung dịch trên vào bình định mức 100mL, tráng đều becher 3 lần và định mức dung dịch đến 100mL
Cân 0.5g tinh bột trong becher và cho 100mL nước vào, khuấy đều sau đó đun cách thủy trong 15 phút, trong quá trình đun luôn dùng đũa thủy tinh khuấy đều dung dịch cho đến khi dung dịch trong Để dung dịch nguội rồi cho vào bình định mức định mức đến 100mL
Cân 3g KI trong becher 100mL sau đó hòa tan với 50 mL nước, khuấy đều cho KI tan hết sau đó cân 0.3g I2 và cho vào dung dịch KI (do I2 không tan trong nước), khuấy đều để I2 tan hoàn toàn, chuyển dung dung dịch vào bình định mức, tráng becher và định mức với nước cất cho đủ 100mL
Tiến hành thí nghiệm
a) Chuẩn bị dịch chiết amylase b) Thí nghiệm khảo sát hoạt độ enzyme amylase
Sơ đồ 1.2 Sơ đồ quy trình khảo sát hoạt độ enzyme amylase
Nghiền (cả vỏ) Định mức lên 100ml
Nước cất Bình định mức
Sơ đồ 1.1 Sơ đồ quy trình chuẩn bị dịch chiết enzyme amylase
‾ Lấy 21 ống nghiệm đánh số thứ tự để chia thành hai dãy ống nghiệm
Một dãy đánh số từ 1 đến 10 có thời gian thủy phân 30 phút
Một dãy đánh số từ 1’ đến 10’ có thời gian thủy phân 20 phút
‾ Hút 10mL dung dịch NaCl 0,5% vào mỗi ống nghiệm
‾ Cho 1mL dung dịch chứa amylase vào ống nghiệm (1) và (1’), lắc kỹ
‾ Hút 1mL dung dịch từ ống nghiệm (1) (hay (1’)) vào ống nghiệm (2) (hay (2’)), lắc kỹ
Tiếp tục tiến hành lần lượt cho đến ống nghiệm (10) (hay (10’))
‾ Hút bỏ 1mL dung dịch trong ống nghiệm (10) và (10’)
‾ Trong mỗi ống nghiệm cho vào 1mL hồ tinh bột 0,5%
(Tiến hành tương tự với dãy 1’ đến 10’)
‾ Chuyển các dãy ống nghiệm vào máy lắc ở 37 0 C trong đó:
‾ Sau khi lấy ống nghiệm ra, cột các ống nghiệm thành từng cụm theo số chẵn, dùng giấy bạc để bịt miệng ống nghiệm và đem đi đun cách thủy trong 10 phút
‾ Bổ sung vào mỗi ống nghiệm 2 giọt Iodine trong KI, lắc đều
‾ Đối với ống kiểm chứng (ống nghiệm thứ 11) cho 3mL nước cất và 3 giọt thuốc thử Iodine
‾ So sánh màu của các ống nghiệm trong cùng một dãy Xác định ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ nhất để thủy phân hoàn toàn tinh bột.
Kết quả và tính toán
Khảo sát hoạt độ enzyme amylase với thời gian 30 phút ở 37 o C
Bảng 1.1 Bảng kết quả màu sắc của dãy ống nghiệm có thời gian thủy phân 30 phút
Chú thích: vàng (V), nâu (N), đỏ (Đ), xanh (X), tím (T) Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Độ pha loãng 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024
Hình 1.1 Dãy ống nghiệm khảo sát hoạt độ amylase trong 30 phút ở 37 o C
Khảo sát hoạt độ enzyme amylase với thời gian 20 phút ở 37 o C
Bảng 1.2 Bảng kết quả màu sắc ống nghiệm có thời gian thủy phân 20 phút Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Độ pha loãng 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024
Chú thích: vàng (V), nâu (N), đỏ (Đ), xanh (X), tím (T)
Hình 1.2 Dãy ống nghiệm khảo sát hoạt độ amylase trong 20 phút ở 37 o C
Tính toán
Lượng enzyme cho vào ống nghiệm 1: n = m × V 1
80 = 125 (mg) Một đơn vị Wohlgemuth (W):
Gọi W1, W2 lần lượt là một đơn vị Wohlgemuth ở 20 phút và 30 phút
8 × 5 = 3,125 Một đơn vị Wohlgemuth có trong 1mL dịch chiết enzyme (NW):
Gọi N W1 , N W2 lần lượt là một đơn vị Wohlgemuth có trong 1mL dịch chiết enzyme ở 20 phút và 30 phút
V1 : Thể tích dịch chiết enzyme cho vào ống nghiệm 1 (1mL)
V2 : Thể tích dịch chiết enzyme (100mL) m : Lượng mẫu cân vật phẩm chứa enzyme (mg)
F : Độ pha loãng của ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ nhất thủy phân hoàn toàn tinh bột (ống nghiệm có màu trùng với ống nghiệm 11)
(ống nghiệm số 3 là ống nghiệm có màu trùng với ống nghiệm số 11).
Nhận xét
Cho mỗi ống 1mL dd NaCl 0,5% để tạo môi trường cho enzyme phân giải vì muối NaCl là muối acid mạnh nên phân ly hoàn toàn trong nước tạo thành ion Cl - Cl - là chất hoạt hóa để làm tăng hoạt độ của enzyme alpha amylase
Các ống nghiệm có màu vàng vì tinh bột trong ống nghiệm đã được thủy phân thành dextrin hoàn toàn Do đó dung dịch trong ống nghiệm không tạo phức với Iodine
Vì vậy dung dịch trong ống nghiệm có màu vàng của dung dịch iodine
Các ống nghiệm cho màu xanh vì tinh bột trong ống nghiệm không thủy phân hoặc thủy phân rất ít Do đó dung dịch chứa tinh bột trong ống nghiệm tạo phức với iodine làm cho dung dịch có màu xanh
Các ống nghiệm cho nàu nâu vì tinh bột trong ống nghiệm chưa được thủy phân hoàn toàn, một phần tinh bột được thủy phân thành Dextrin Vì vậy, dung dịch có màu nâu
Các ống nghiệm cho màu đỏ vì tinh bột trong ống nghiệm chưa được thủy phân hoàn toàn Lượng tinh bột bị thủy phân ít hơn so với những ống có màu nâu Vì vậy dung dịch có màu đỏ Ống nghiệm có màu xanh càng đậm chứng tỏ lượng tinh bột bị thủy phân càng ít và lượng enzyme càng loãng
Thời gian cũng ảnh hưởng đến quá trình thủy phân của enzyme Thời gian càng tăng thì tinh bột thủy phân càng nhiều So sánh ống nghiệm số 6 của hai quá trình ta thấy:
+ Ống nghiệm 6 (20 phút) có màu nâu đỏ chứng tỏ rằng lượng tinh bột bên trong tinh bột vẫn còn nên có phản ứng tạo phức với I2
+ Ống nghiệm 6 (30 phút) có màu vàng nâu chứng tỏ rằng lượng tinh bột bên trong chưa được thủy phân hoàn toàn nên có phản ứng tạo phức với I2 và màu vàng là màu của I2 trong KI nhưng có thể do bên trong nó còn amylopectin nên có màu vàng đậm hơn các ống còn lại Vì amylopectin phản ứng với I2 tạo màu đỏ cam nhưng với một lượng ít nên màu đỏ cam không thể hiện rõ nên chúng ta chỉ thấy màu vàng đậm hơn
Thao tác của phương pháp Wohlgemuth dễ thực hiện và kết quả dễ quan sát nhưng phương pháp này cũng dễ sai do thao tác chiết dịch không đúng hoặc lấy mẫu sai hoặc do hoặc nhầm lẫn trong lúc pha loãng dung dịch qua các ống nghiệm.
Nguyên nhân sai số & Biện pháp khắc phục
Nguyên nhân sai số
Trong quá trình tiến hành thí nghiệm có thể nhóm chúng em đã gặp phải một số sai sót dẫn đến màu của dung dịch chưa chuẩn, nguyên nhân có thể do:
‾ Tính toán thời gian chưa thật sự chính xác
‾ Chưa phối hợp nhịp nhàng, các thao tác chưa chuẩn
‾ Dụng cụ thí nghiệm chưa được vệ sinh kỹ
‾ Lượng dung dịch được lấy có thể có sự chênh lệch nhỏ dẫn đến sai số
‾ Nhầm lẫn trong quá trình pha loãng mẫu qua các ống nghiệm
‾ Chuẩn bị dịch chiết enzyme sai
Biện pháp khắc phục
‾ Vệ sinh thật sạch các dụng cụ thí nghiệm
‾ Tiến hành thí nghiệm nhanh chóng, cẩn thận, chính xác
‾ Luyện tập lấy hóa chất chuẩn và chính xác
‾ Cẩn thận trong quá trình pha loãng mẫu
BÁO CÁO THÍ NGHIỆM BÀI 2: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ LIPASE
1 Mục tiêu bài thí nghiệm
Xác định hoạt độ lipase có trong mẫu
Hiểu và giải thích được các hiện tượng xảy ra trong quá trình thí nghiệm
Nắm rõ các thao tác trong thí nghiệm
Tổng quan về enzyme lipase
Lipase (Triacylglycerol Acylhydrolase) có EC 3.1.1.3 thuộc lớp hydrolase, là enzyme hoạt động trong các mô lưu trữ lipid trong hạt trong quá trình nảy mầm
Lipase có thể tham gia xúc tác cho phản ứng thủy phân triacylglycerol lưu trữ thành acid béo, được chuyển thành đường, acid amin và chuỗi carbon cần thiết để hỗ trợ sự phát triển của phôi
Lipase được phân bố rộng rãi ở vi sinh vật, động vật và thực vật
Lipase vi sinh vật được một số tác giả thu nhận được từ Pseudomonas, Bacillus sp LBN 4, … Ở động vật, lipase được thu nhận chủ yếu từ tụy tạng của trâu, bò, cừu, lợn và một số loại cá
Thực vật có thể là nguồn cung cấp lipase quan trọng nhờ vào giá thành thấp, có tính đặc hiệu, dễ dàng được chấp nhận, …
Dưới tác động của enzyme lipase, lipid bị thủy phân và giải phóng acid béo Hàm lượng acid được chuẩn độ bằng dung dịch kiềm (NaOH) Hoạt độ của enzyme là lượng kiềm cần để trung hòa acid mới được hình thành
Hình 2.1 Phản ứng thủy phân của lipid xúc tác bởi enzyme Lipase
Dụng cụ thí nghiệm
Chuẩn bị dung dịch
Dung dịch Thể tích Cách pha Đệm acetate pH = 4,7 50mL
Chế 50mL dung dịch đệm acetate pH = 4,7 vào becher 50mL
(Để pha dung dịch đệm acetate có pH = 7 cần tiến hành trộn CH3COOH 0,1N cùng với CH3COONa 0,1N theo tỷ lệ 1:1)
Cồn 96 0 200mL Dùng ống 100mL đong để đong 2 lần cồn 96 0
Chế khoảng 10mL dung dịch Toluen vào becher 50mL (Tiến hành trong tủ hút)
Chế 100mL dung dịch ether ethylic vào becher 100mL (Không nên chế quá sớm do dung môi có thể bay hơi, hoặc chế vào becher và dùng giấy bạc bọc lại)
Dầu đậu nành tinh khiết 10mL Chế 10mL dầu đậu nành vào becher 50ml
Cân 0,4g NaOH trong becher 50mL sau đó hòa tan với nước cất, chuyển dung dịch vào bình định mức 100mL, tráng đều becher và định mức với nước cất cho đủ 100mL dung dịch
Cân 5g đậu nành trên becher 50mL sau đó chuyển vào cối xay đã được làm mát trong tủ lạnh, xay hạt đậu nành thành bột mịn (Quá trình xay cần nhấn nút xay từ từ, đợt, không nên xay liên tục do lực ma sát lớn làm tăng nhiệt độ bên trong sẽ làm mất hoạt tính của enzyme lipase)
Rửa sạch cối xay và lau khô, cho 5g đậu nành và tiến hành tương tự cho những bình còn lại
‾ Cho vào sáu erlen chứa đậu nành đã xay mịn 10mL nước cất, lắc đều trong 15 phút ở 30 o C
‾ Lấy ra 3 bình đánh số (1), (2) và (3) để đun cách thủy 10 phút để làm mất hoạt tính enzyme trước khi cho cơ chất vào
‾ Thêm 1mL dầu đậu nành vào 6 erlen để làm cơ chất, 5mL đệm acetate và nhỏ ba giọt toluen vào (cần tiến hành nhanh chóng, chính xác) sau đó cho vào máy lắc chỉnh nhiệt độ ở 30 o C trong 24 giờ để phản ứng xảy ra hoàn toàn
‾ Khi hết thời gian phản ứng, lấy 6 erlen ra và cho vào mỗi bình 25ml cồn 96 o và 15mL ether, lắc đều và để yên 2 phút
‾ Chuẩn độ dung dịch trong erlen bằng NaOH 0,1N
Do sự thay đổi màu khó quan sát do đó không dùng phenolphthalein 1% làm chỉ thị, thay vào đó vừa tiến hành chuẩn độ vừa đo pH, khi pH = 7 thì dừng lại
‾ Đọc thể tích NaOH dùng để chuẩn độ
Lắc đều (15 phút) Đun cách thủy
(10 phút) Đọc thể tích NaOH
Sơ đồ 2.1 Quy trình tiến hành thí nghiệm khảo sát hoạt độ enzyme lipase
6 Kết quả và tính toán
Bảng 2.1 Kết quả chuẩn độ của ba bình kiểm chứng
Thể tích NaOH dùng để chuẩn độ (mL)
2,25 1,96 2,7 pH ban đầu của dung dịch 6,45 6,65 6,45 pH lúc sau của dung dịch 7,01 7,01 7,00
Bảng 2.2 Kết quả chuẩn độ của ba bình thí nghiệm
Thể tích NaOH dùng để chuẩn độ (mL)
18,55 16,5 17,3 pH ban đầu của dung dịch 5,58 5,67 5,57 pH lúc sau của dung dịch 7,01 7,07 7,02
Hình 2.2 Sáu bình erlen chứa bột đậu nành sau khi cho phản ứng hoàn toàn (sau 24 giờ) ở 30 0 C
Hình 2.3 Bình kiểm chứng sau khi chuẩn độ bằng NaOH
Hình 2.4 Bình thí nghiệm sau khi chuẩn độ bằng NaOH
Hoạt độ của enzyme lipase (X) được biểu thị bằng số mL NaOH 0.1N dùng để chuẩn độ lượng acid tự do sinh ra bởi enzyme Lipase trích được từ 10g hạt đậu nành
X = (a – b) × 10 × k/m Trong đó: a: số mL NaOH để chuẩn độ trong bình thí nghiệm b: số mL NaOH để chuẩn độ trong bình kiểm chứng k: hệ số điều chỉnh nồng độ NaOH 0.1N m: khối lượng hạt sử dụng
Khối lượng NaOH cân được để pha 100mL dung dịch NaOH 0,1N để chuẩn độ sáu bình: 0,4041 (g)
Nồng độ NaOH tính được từ khối lượng cân được:
Do hệ số đương lượng bằng 1 nên nồng độ đương lượng thực tế của NaOH
Hệ số hiệu chỉnh: k = C N (thực tế)
0,1 = 1,01 Thể tích NaOH trung bình khi chuẩn độ ba bình kiểm chứng:
3 ) = 2,3033 (mL) Thể tích NaOH trung bình khi chuẩn độ ba bình thí nghiệm:
3 ) = 17,45 (mL) Thay các giá trị vào công thức trên, ta thu được hoạt độ lipase:
So sánh số mL NaOH dùng để chuẩn độ đối với ba bình thí nghiệm và ba bình kiểm chứng nhóm chúng em nhận thấy thể tích NaOH cần dùng để chuẩn độ các bình thí nghiệm nhiều hơn so với các bình kiểm chứng Nguyên nhân là do ở ba bình kiểm chứng đã được đun cách thủy trong 10 phút để làm bất hoạt enzyme lipase trước khi cho cơ chất vào, vì vậy chất béo có trong đậu nành không bị thủy phân để sinh ra acid béo, để pH = 7 lượng NaOH cần dùng sẽ ít hơn Đối với các bình thí nghiệm, enzyme không
16 bị bất hoạt, chất béo trong đậu nành bị thủy phân và giải phóng các acid béo, lượng NaOH sẽ nhiều hơn để chuẩn độ dung dịch về pH = 7
Quan sát các kết quả thu nhận được từ những lần chuẩn độ, các kết quả có sự chênh lệch lượng NaOH cần dùng khá đáng kể Đối với ba bình kiểm chứng, sự chênh lệch trung bình rơi vào khoảng 0,5mL Ở ba bình thí nghiệm, độ chênh lệch tăng đáng kể, sự chênh lệch ở ba bình này khoảng 1,37mL
8 Nguyên nhân sai số & Biện pháp khắc phục
Trong quá trình tiến hành thí nghiệm nhóm chúng em đã gặp phải một số sai sót dẫn đến kết quả chuẩn độ chưa chính xác, mức độ sai số khá lớn, nguyên nhân có thể do:
− Enzyme Lipase chưa được trích ly hiệu quả hoặc do đậu nành để trong thời gian dài Enzyme bị có thể bị mất một phần hoạt tính do quá trình xay xảy ra sự ma sát làm tăng nhiệt độ và do trong quá trình lắc ở 30 0 C trong 24h, nhiệt độ có thể tăng > 30 0 C
− Phản ứng thủy phân không xảy ra hoàn toàn
− Sai số trong quá trình cân mẫu và lấy hóa chất
− Dụng cụ chưa vệ sinh sạch sẽ, dễ bị nhiễm tạp chất
− Các thao tác thí nghiệm chưa thuần thục, chính xác
− Lấy hóa chất và mẫu chính xác, hạn chế tối đa sai số trong quá trình cân
− Sử dụng mẫu đậu nành mới
− Vệ sinh dụng cụ thí nghiệm sạch sẽ
− Thao tác thí nghiệm chính xác, cẩn thận
BÁO CÁO THÍ NGHIỆM BÀI 3: KHẢO SÁT HOẠT ĐỘ INVERTASE
1 Mục tiêu bài thí nghiệm
Bài thí nghiệm được thực hiện nhằm mục tiêu xác định hoạt độ của enzyme invertase có trong men bánh mì
Biết được cách pha chế các loại hóa chất cần sử dụng trong thí nghiệm
Nắm rõ các quy tắc, các bước tiến hành khi thực hiện thí nghiệm.
Tổng quan về enzyme invertase
Enzyme invertase (ꞵ-fructofuranosidase) có số EC: EC 3.2.1.26 Đây là một enzyme có khả năng thủy phân saccharose thành 2 monomer glucose và fructose
Invertase có mặt trong tế bào chất, không bào và thành tế bào
Vai trò của enzyme invertase:
+ Invertase tách saccharose thành glucose và fructose nhằm cung cấp cho tế bào + Làm nhiên liệu cho quá trình hô hấp
+ Là nguồn cung cấp carbon và năng lượng
+ Invertase hòa tan đóng vai trò là một chất điều chỉnh thành phần đường trong sản phẩm sau thu hoạch Ưu điểm: xuất phát từ ưu điểm của đường nghịch đảo, invertase thủy phân sucrose tạo ra glucose và fructose có:
+ Độ ngọt cao hơn sucrose
+ Có khả năng chống kết tinh
+ Hoạt độ nước thấp, do đó khả năng bảo quản các sản phẩm thực phẩm sử dụng đường nghịch đảo sẽ tốt hơn, thời gian bảo quản dài hơn
Bài thí nghiệm được tiến hành dựa trên tính chất Iodine có trong dung dịch kiểm có khả năng oxi hóa glucose sinh ra bằng cách định phân lượng iodine dư với dung dịch
Na2S2O3 (natri thiolsunfat) Đầu tiên khi khi iodine trong môi trường kiềm chúng sẽ tác dụng với dung dịch kiềm (NaOH)
I2 + 2NaOH NaIO + NaI + H2O (1) NaIO tạo thành từ phản ứng (1) sẽ phản ứng với đường glucose
NaIO + CH2OH-(CHOH)4-CHO NaI + CH2OH-(CHOH)4-COOH (2)
NaIO dư sẽ tác dụng với NaI được sinh ra từ phản ứng (1) và (2) tạo sản phẩm là I2
2NaIO + 2NaI + H2SO4 I2 + Na2SO4 + 2H2O Cuối cùng lượng I2 dư sẽ phản ứng với dung dịch Na2S2O3
Becher 100 – 250mL Phễu thủy tinh
Pippet 5mL – 10mL Buret 25mL
Dung dịch Thể tích Cách pha
Cân 10g đường saccharose trong becher 50mL sau đó hòa tan đường với nước cất, chuyển dung dịch trên vào bình định mức 100mL, tráng đều becher và định mức dung dịch đến 100mL
Cân 1g tinh bột trong becher và cho 100mL nước vào, khuấy đều sau đó đun cách thủy trong 15 phút, trong quá trình đun luôn dùng đũa thủy tinh khuấy đều dung dịch Sau đó để nguội hồ tinh bột và định mức lại cho đủ 100mL
Cân 4g KI trong becher 50mL sau đó hòa tan với nước, khuấy đều cho KI tan hết sau đó cân 1,27g I2 và cho vào dung dịch KI (do I2 không tan trong nước), khuấy đều để
I2 tan hoàn toàn thì nhỏ 3 giọt HCl 37%, chuyển dung dung dịch I2 vào bình định mức, tráng đều becher và định mức với nước cất cho đủ 100mL
Hút một ít nước cất cho vào becher 50mL sau đó dùng pipet hút khoảng 2,77mL H2SO4 96% nhỏ từ từ vào nước, khuấy đều và chuyển dung dịch acid vào bình định mức 100mL định mức với nước cất đến 100mL
Cân 6,2g Na2S2O3.5H2O trong becher 50mL và hòa tan với nước cất, chuyển dung dịch vào bình định mức 250mL, tráng đều becher và định mức nước cất cho đủ 250mL, đổ dung dịch này vào becher 500mL và dùng bình định mức 250mL tiếp tục định mức nước cất cho đủ 250mL và cho vào becher, khuấy đều
Cân 2,4g NaOH trong becher 50mL sau đó hòa tan với nước cất, chuyển dung dịch NaOH vào bình định mức 250mL, tráng đều becher và định mức lên 250mL và cho dung dịch này vào becher 500mL, tiếp tục dùng bình định mức 250mL và 100mL và định mức nước cất lên đến vạch sau đó chuyển tất cả lượng nước cất trên vào becher 500mL có chứa NaOH trước đó, khuấy đều dung dịch
Cân 2g men bánh mì trong becher 50mL, cho nước cất vào khuấy đều vào chuyển vào bình định mức 100mL, tráng sạch becher và định mức nước cất cho đủ 100mL, lắc đều trong vòng 5 phút Sau đó chuyển dung dịch này vào becher 250mL và dùng bình định mức 100mL tiếp tục định mức nước cất lên đến vạch cho bào becher 150mL, khuấy đều dung dịch Dung dịch chứa men sẽ để lắng và lọc qua giấy lọc thu được dịch lọc có chứa enzyme invertase
Lượng dịch lọc (không chứa xác men khô) thu được thực tế là 150mL
Chuyển 50mL dịch enzyme vừa lọc được vào một erlen 100mL và đem đi đun cách thủy trong 10 phút để làm bất hoạt enzyme invertase
Chuẩn bị 9 ống nghiệm (mỗi số ống nghiệm thực hiện lặp lại 3 lần) theo bảng dưới đây:
Bảng 3.1 Thể tích một số dung dịch cần cho vào mỗi ống nghiệm để tiến hành khảo sát hoạt độ invertase
Dịch enzyme đã đun cách thủy 10 phút (mL) 0 0 5
‾ Để các ống nghiệm ở nhiệt độ phòng trong chính xác 30 phút
‾ Cột các ống nghiệm thành từng cụm 3 ống, dùng giấy bạc để bịt miệng ống nghiệm và đem đi đun cách thủy trong 10 phút
‾ Ở từng ống nghiệm sau khi đun, hút ra 2,5mL dung dịch Iodine 0,1N và 7,5mL NaOH 0,1N Để erlen trong bóng tối 20 phút bằng cách cho vào tủ và đóng cửa
Lưu ý: Thời gian pha NaOH kéo dài 2 phút và nhỏ đều tay
Thời gian nhỏ iodine và NaOH mỗi bình cách nhau 5 phút
‾ Sau khi đủ 20 phút, lấy erlen ra và dùng micropipet nhỏ 1mL dung dịch H2SO4
‾ Cột buret rửa sạch và tráng cột với Na2S2O3 0,05N sau đó cho dung dịch Na2S2O3
0,05 lên đến vạch 0mL, nhỏ 2 giọt Na2S2O3 từ buret vào dung dịch trong erlen để dễ quan sát sự thay đổi màu, sau đó nhỏ 3 giọt hồ tinh bột 1% để làm chất chỉ thị
‾ Định phân dung dịch bằng Na2S2O3 0,05N từ buret cho đến khi dung dịch trong erlen mất màu
‾ Đọc thể tích Na2S2O3 dùng để định phân
6 Kết quả và tính toán
Bảng 3.2 Kết quả định phân
Hoạt độ của enzyme invertase sẽ được biểu thị bằng số mol saccharose bị thủy phân bởi lượng enzyme có trong 1g men bánh mì trong thời gian 1 phút ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, và được tính toán theo công thức:
V1 : Số mL Na2S2O3 dùng để định phân dung dịch ở ống nghiệm 1
V2 : Số mL Na2S2O3 dùng để định phân dung dịch ở ống nghiệm 2
A : Thể tích tổng cộng trong mỗi ống nghiệm (mL)
B : Tổng thể tích dịch trích enzyme có được từ m (g) men bánh mì (mL) a : Thể tích dung dịch đem xác định đường glucose (mL) b : Thể tích dịch trích enzyme cho vào mỗi ống nghiệm (mL) t : Thời gian thủy phân (phút) m : Khối lượng mẫu cân (men bánh mì)
Gọi HI: là hoạt độ enzyme invertase
Thay các giá trị vào công thức trên ta thu được các kết quả dưới đây:
Hình 3.1 Ba bình erlen trước khi định phân với Na 2 S 2 O 3 0,05N
Dung dịch trong erlen sau quá trình định phân với Na2S2O3 0,05N bị mất màu
7 Nhận xét Ống nghiệm số 1: ống nghiệm 1 chỉ chứa nước cất và dịch enzyme, không chứa dung dịch saccharose 10% làm cơ chất, vì vậy khi cho enzyme invertase vào sẽ không tham gia phản ứng thủy phân saccharose tạo glucose Khi đó 5mL iodine 0,1N được thêm vào sẽ không tham gia phản ứng oxi hóa glucose trong môi trường kiềm, toàn bộ lượng iodine sẽ được định phân bằng dung dịch Na2S2O3 0,05N
Như vậy ở bình số 1 cần dùng nhiều thể tích Na2S2O3 0,05N hơn để định phân Ống nghiệm số 2: trong các ống nghiệm số 2 có chứa dịch enzyme và cả dung dịch saccharose 10% làm cơ chất để invertase thủy phân tạo thành glucose Một phần iodine 0,1N sẽ thực hiện phản ứng oxi hóa glucose, iodine dư sẽ được định phân bằng dung dịch Na2S2O3 0,05N Từ đây có thể xác định được lượng glucose được tạo ra
Thể tích dung dịch Na2S2O3 0,05N cần dùng để định phân iodine 0,1N nhỏ hơn Ống nghiệm số 3: mặc dù trong ống nghiệm số 3 có chứa cả dịch enzyme và cơ chất là saccharose 10%, tuy nhiên enzyme invertase có trong dịch lỏng đã bị bất hoạt do đun cách thủy 10 phút Saccharose không bị thủy phân để sinh glucose, vì vậy toàn bộ 5mL iodine 0,1N sẽ được định phân bằng dung dịch Na2S2O3 0,05N
Thể tích dung dịch Na2S2O3 0,05N cần dùng để định phân iodine 0,1N nhiều hơn
Tổng quan về enzyme urease
Urease (Carbamine amidohydrolase) có mã hiệu EC 3.5.1.5, là một enzyme xúc tác quá trình thủy phân urea thành ammonia và khí cacbonic Nó thuộc nhóm enzyme hydrolase (enzyme thủy phân)
Trong thực vật, enzyme urease đóng vai trò quan trọng trong việc xúc tác quá trình thủy phân urea nhằm cung cấp nguồn ni-tơ thiết yếu cho cây Urease có ứng dụng thực tiễn trong nhiều lĩnh vực Trong công nghiệp thực phẩm, urease được ứng dụng trong việc loại bỏ urea còn tồn dư trong rượu vang, đảm bảo độ an toàn và chất lượng cảm quan cho sản phẩm
Ngoài thực vật, enzyme urease cũng được sản xuất bởi nhiều loại vi khuẩn khác nhau (Helicobacter pylori), nấm, tảo và thậm chí một số động vật không có xương sống.
Nguyên tắc thực hiện thí nghiệm
Thí nghiệm khảo sát động học
Chuẩn bị 2 dãy ống nghiệm, mỗi dãy 6 ống Ở từng dãy cho lần lượt các dung dịch vào theo bảng sau:
Bảng 4.1 Thể tích một số dung dịch cần cho vào mỗi ống nghiệm để tiến hành khảo sát động học Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6
Nước cất (mL) 5 4 3 2 1 0 dd urease (mL) 5 5 5 5 5 5 Đặt dãy thứ nhất vào bể ổn nhiệt 40 o C, dãy thứ 2 vào tủ ấm 30 o C trong chính xác
Sau khi kết thúc thời gian thủy phân thì thêm vào mỗi ống nghiệm 5mL formol trung tính, lắc đều trong 2 phút
Chuyển từng ống nghiệm sang erlen 100ml, tráng ống nghiệm với một ít nước cất
Nhỏ 3 giọt phenolphthalein 1%, lắc đều sau đó định phân với NaOH 0,05N (Lặp lại thí nghiệm 3 lần) Đọc thể tích NaOH 0,05N dùng để chuẩn độ.
Thí nghiệm xác định hoạt độ
Thực hiện các ống nghiệm sau:
Bảng 4.2 Thể tích một số dung dịch cần cho vào mỗi ống nghiệm để tiến hành khảo sát hoạt độ enzyme Ống nghiệm 1 2 3
Dd urease đã đun cách thủy (mL) 0 0 5
Sau đó mang tất cả các ống nghiệm đặt ở 40 o C
Sau 20 phút cho vào mỗi ống 5 mL formol trung tính, lắc đều trong 2 phút Đổ lần lượt mỗi ống ra một erlen 100mL Định phân bằng NaOH 0,05N với phenolphtalein 1% làm chỉ thị (Lặp lại thí nghiệm 3 lần) Đọc thể tích NaOH 0,05N dùng để chuẩn độ
6 Kết quả và tính toán
Thí nghiệm khảo sát động học enzyme Urease
Bảng 4.3 Thể tích NaOH (mL) dùng để chuẩn độ sáu bình erlen chứa hỗn hợp dung dịch sau quá trình thủy phân ở 30 o C Ống nghiệm Lần 1 Lần 2 Lần 3
Bảng 4.4 Thể tích NaOH (mL) dùng để chuẩn độ sáu bình erlen chứa hỗn hợp dung dịch sau quá trình thủy phân ở 40 o C Ống nghiệm Thể NaOH 0,05N dùng để chuẩn độ (ml)
Trên cùng một hệ trục tọa độ vẽ 2 đường cong biểu diễn lượng cơ chất bị thủy phân theo nồng độ cơ chất ban đầu ở 2 nhiệt độ ( Y1 và Y2 theo [S])
Vẽ đường thẳng biểu diễn sự biến thiên của 1/V theo 1/[S] ở 2 nhiệt độ thủy phân Trong đó: v = d(S)/dt = Y/20 (v là vận tốc phản ứng thủy phân) Động học của phản ứng enzyme được tính toán dựa theo đồ thị Lineweaver – Burk
Trong đó Vmax : vận tốc thủy phân cực đại
Km : hằng số Michaelis-Menten Các đường thẳng này sẽ cắt trục hoành và trục tung tại các giá trị nghịch đảo của
Bảng 4.5 Kết quả tính toán khảo sát động học ở 30 0 C:
Bình Y= số mol urea bị thủy phân
[S] = nồng độ ure ban đầu (M)
Vận tốc phản ứng thủy phân
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3
Từ những dữ kiện ở bảng số liệu trên ta thu được đồ thị dưới đây:
Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn phương trình động học của enzyme urease ở 30 0 C Theo biểu đồ ta có phương trình động học của enzyme urease: y = 5407,3x + 280016
Từ đây ta tiến hành tính toán:
Vậy khi khảo sát động học của enzyme urease tại nhiệt độ 30 o C ta thu được kết quả là:
Phương trình động học của enzyme urease ở 30°C
Hình 4.4 Dãy erlen khảo sát động học enzyme urease ở 30 0 C sau khi định phân với
NaOH 0,05N Bảng 4.6 Kết quả tính toán khảo sát động học ở 40 0 C
Y= số mol urea bị thủy phân (mol)
[S] = nồng độ ure ban đầu (M)
Vận tốc phản ứng thủy phân
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3
Từ những dữ kiện ở bảng số liệu trên ta thu được đồ thị dưới đây:
Hình 4.5 Đồ thị biểu diễn phương trình động học của enzyme urease ở 40 0 C y = 3773.4x + 154675 R² = 0.9593
Phương trình động học của enzyme urease ở 40°C
Theo biểu đồ ta có phương trình động học của enzyme urease: y = 3773,4x + 154675
Từ đây ta tiến hành tính toán:
Vậy khi khảo sát động học của enzyme urease tại nhiệt độ 30 o C ta thu được kết quả là:
Bảng 4.7 So sánh số mol ure bị thủy phân theo nồng độ ban đầu ở 30 0 C và 40 0 C Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6
Nồng độ ure ban đầu
Số mol ure bị thủy phân ở 30°C (Y 1 ) 0 4,667.10 -5 5,083.10 -5 5,792.10 -5 6,375.10 -5 6,917.10 -5
Số mol ure bị thủy phân ở 40°C (Y 2 ) 0 7,583.10 -5 9,083.10 -5 1,017.10 -4 1,088.10 -4 1,196.10 -6
Hình 4.6 Đồ thị biểu diễn lượng ure bị thủy phân theo nồng độ ure ban đầu ở 30 0 C và
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 Đồ thị biểu diễn lượng ure bị thủy phân theo nồng độ ure ban đầu ở 30°C và 40°C
Thí nghiệm khảo sát hoạt độ enzyme Urease
Bảng 4.8 Thể tích NaOH (mL) dùng để chuẩn độ ba bình erlen chứa hỗn hợp dung dịch sau quá trình thủy phân ở 40 o C Ống nghiệm 1 Ống nghiệm 2 Ống nghiệm 3 Đơn vị
Hoạt độ urease được biểu diễn bằng số mol ure bị thủy phân bởi lượng enzyme urease có trong 1g bột đậu nành trong thời gian 1 phút ở 40 o C
V1 : số mL NaOH 0,05N dùng định phân dung dịch trong ống nghiệm 1
V2 : số mL NaOH 0,05N dùng định phân dung dịch trong ống nghiệm 2 a : Thể tích enzyme cho vào mỗi ống nghiệm
A : Tổng thế tích enzyme có được từ m(g) bột đậu nành
T : thời gian thủy phân (phút) m : khối lượng mẫu cân k : hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0,05 N
Gọi X1, X2, X3 lần lượt là hoạt độ của urease trong lần thí nghiệm thứ nhất, thứ hai và thứ ba Thay các giá trị vào công thức trên ta được:
Hình 4.7 Dãy erlen khảo sát hoạt độ enzyme urease ở 30 0 C
Khảo sát động học enzyme Urease
Nhiệt độ có ảnh hưởng đến tốc độ của phản ứng Theo như kết quả thí nghiệm, ta thấy tốc độ thủy phân Vmax ở nhiệt độ 40 o C nhanh hơn nhiều so với Vmax ở nhiệt độ
30 o C (gấp khoảng 2 lần) Như vậy enzyme urease xúc tác cho quá trình thủy phân của cùng môt cơ chất tại nhiệt độ 40 o C tốt hơn ở nhiệt độ 30 o C
Tóm lại, enzyme urease hoạt động tốt ở 40 0 C, nhiệt độ càng tăng thì enzyme sẽ thủy phân càng nhiều ure để sinh ra ammoniac và carbodioxide Tuy nhiên, đến một nhiệt độ nhất định enzyme sẽ bị bất hoạt, do đó không còn khả năng thủy phân cơ chất
Xác định hoạt độ enzyme Urease
Ống nghiệm số 1: ống nghiệm 1 chỉ chứa nước cất và dịch enzyme urease, không chứa dung dịch ure 2% làm cơ chất, vì vậy ở ống nghiệm này sẽ không có phản ứng thủy phân để sinh ra amoniac và CO2 Do đó khi thêm 5mL formol trung tính vào và định phân bằng NaOH 0,05N với phenolphatlein 1% làm chất chỉ thị thì dung dịch sẽ đổi màu sang màu hồng rất nhanh Ống nghiệm số 2: ống nghiệm 2 chứa dung dịch ure 2% và dịch enzyme urease, vì vậy ở ống nghiệm này sẽ phản ứng thủy phân ure được xúc tác bởi urease sinh ra amoniac và CO2 Do đó khi thêm 5mL formol trung tính vào và định phân bằng NaOH 0,05N với phenolphatlein 1% làm chất chỉ thị thì cần 1 lượng NaOH nhiều hơn ống nghiệm 1 để dung dịch đổi sang màu hồng Ống nghiệm số 3: ống nghiệm 3 chứa ure 2% và dịch enzyme urease đã đun cách thủy, lúc này enzyme urease dưới tác dụng của nhiệt độ cao sẽ bị bất hoạt, vì vậy ở ống nghiệm này sẽ không có phản ứng sinh ra amoniac và CO2 Do đó khi thêm 5mL formol trung tính vào và định phân bằng NaOH 0,05N với phenolphatlein 1% làm chất chỉ thị thì dung dịch sẽ đổi màu sang màu hồng rất nhanh
8 Nguyên nhân sai số & Biện pháp khắc phục
Trong quá trình tiến hành thí nghiệm có thể nhóm chúng em đã gặp phải một số sai sót dẫn đến màu của dung dịch chưa chuẩn, thể tích NaOH 0,05N dùng để định phân có thể có sự sai lệch, nguyên nhân có thể do:
‾ Sai số trong quá trình cân mẫu và lấy hóa chất
‾ Pha hóa chất chưa đúng nồng độ
‾ Nồng độ enzyme cho vào mỗi ống nghiệm khác nhau
‾ Thời gian thủy phân chưa chính xác
‾ Cho dư NaOH khi chuẩn độ
‾ Vệ sinh thật sạch các dụng cụ thí nghiệm và cân trước khi sử dụng
‾ Thao tác thí nghiệm cẩn thận
‾ Lắc đều cốc chứa enzyme trước khi hút và cho vào ống nghiệm
‾ Tính toán thời gian hợp lý, để sai số là nhỏ nhất
‾ Khi đến gần điểm chuẩn độ, thì ta cho từ từ NaOH vào trong ống nghiệm