BÁO cáo THÍ NGHIỆM hóa SINH xác ĐỊNH HOẠT TÍNH AMYLASE

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHUD – Ngành CNSH  BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH GVHD: Trần Thị Tuyết Nhung Nhóm C3-N05 Thành viên: Nguyễn Thị Minh Thư - 62101182 Lưu Thảo Linh - 62101132 Đỗ Thị Mỹ Duyên - 62101106 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 0 Bài số ĐIỂM Tên bài: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH AMYLASE THEO WOHGEMUTH & KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH AMYLASE Ngày TN: 25/10/2022 I XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH AMYLASE: Nguyên tắc: Enzyme Amylase enzyme thủy phân tinh bột Nó phân cắt amilose amilopectin tinh bột thành dextrin loại đường maltose, glucose… Phương pháp Wohgemuth dựa vào việc tìm nồng độ enzyme thấp để thủy phân tinh bột đến s ản phẩm không màu với Iod Đơn vị Wohgemuth lượng enzyme cần thiết để thủy phân 1mg tinh bột sau 30 phút 37oC có 𝐶𝑙 − làm chất hoạt hóa Thực hiện: a) Chuẩn bị dịch chiết Amylase Cho 10g malt xay vào bình định mức, định mức nước cất Ngâm 30 phút, lắc 0 Lọc qua giấy lọc thu dịch suốt chứa enzyme amylase b) Tiến hành Lấy 10 ống nghiệm đánh số thứ tự Cho vào ống 1mL dd NaCl 0,5% Hút 1mL từ ống [1] cho vào ống [2], lắc kỹ Lặp lại ống [10] hút 1mL giữ lại Cho vào ống [1] 1mL dịch chiết, lắc kỹ Cho vào tủ điều nhiệt 37C 30 phút, lắc Sau lấy khỏi tủ thêm ống 1mL H2 SO4 + giọt I2 /KI, lắc Cho vào ống nghiệm 1mL dd tinh bột 0,5%, lắc Kết quả: a Kết thí nghiệm: Thứ tự ống nghiệm Độ pha loãng Nồng độ enzyme Màu 10 16 32 64 128 256 512 1024 n/2 n/4 n/8 n/16 n/32 Vàng Vàng Vàng Vàng Đỏ nâu nâu 0 n/64 n/128 n/256 n/512 Tím Tím Xanh tím Xanh n/1024 Xanh Hình thể 10 ống thí nghiệm ( ống đến 10 tính từ trái sang phải) ➔ Qua kết ta thấy ống nghiệm (ống có màu vàng) có nồng độ enzyme nhỏ xảy thuỷ phân hồn tồn tinh bột b Kết tính toán: ➢ Lượng enzyme cho vào ống [1]: n= 𝑚 × 𝑉1 𝑉2 = 10.17 × 103 ×1 100 = 101,7 (mg) ➢ Một đơn vị Wohgemuth (W): W= 𝑛 𝐹×5 = 101.7 8×5 = 2,543 (mg) ➢ Số đơn vị Wohgemuth có mL dịch chiết enzyme (Nw) 𝑛 2×5 𝑁𝑊 = 𝑉 = 101.7 100 × = 0,2034 (mg⁄mL) 0 Bàn luận: - Cho ống 1mL dd NaCl 0,5% để tạo môi trường cho enzyme phân giải muối NaCl muối acid mạnh nên phân ly hoàn toàn nước tạo thành ion 𝐶𝑙 − - Dịch chiết từ malt chứa nhiều α - amylase Các ống nghiệm có độ pha loãng dung 𝑛 dịch tăng theo 2𝑛 lần nồng độ enzyme giảm 2𝑛 lần (n số thứ tự ống nghiệm) nên ống nghiệm có độ thủy phân tinh bột cao (thủy phân hoàn toàn thành maltose) nên dung dịch có màu vàng Iod, ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ ống nghiệm Và ống nghiệm ống nghiệm có nồng độ enzyme thấp thủy phân hoàn toàn tinh bột Nồng độ enzyme ống nghiệm thủy phân tinh bột thành Achrodextrin phản ứng với Iod tạo thành màu vàng nâu, ống nghiệm tinh bột bị thủy phân thành Eritodextrin phản ứng với Iod cho màu đỏ nâu, tinh bột ống nghiệm bị thủy phân thành Amylodextrin phản ứng với Iod cho màu tím Ở ống nghiệm có màu xanh tím chứng tỏ enzyme α-amylase chưa thủy phân hết lượng tinh bột có mẫu Cịn ống nghiệm 10 nồng độ enzyme khơng cịn nên tinh bột không bị thủy phân mà phản ứng với Iod cho màu xanh - Qua kết trên, thấy xác định hoạt tính amylase phương pháp Cphương pháp dễ cho kết sai thao tác chiết dịch không lấy mẫu sai nhầm lẫn lúc pha dung dịch qua ống nghiệm II KHẢO SÁT CÁC YẾU TỔ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA AMYLASE: Ảnh hưởng nhiệt độ: a Nguyên tắc: Nhiệt độ tác nhân vật lý ảnh hưởng đến vận tốc hóa học phản ứng enzyme Trong điều kiện sinh lý định, tăng nhiệt độ vận t ốc phản ứng tăng lên Tuy nhiên nhiệt độ 45oC vận tốc enzyme bắt đầu giảm xuống Đa số enzyme có nhiệt độ tối thích (Topt) vào khoảng 40 – 50oC, nhiệt độ vận tốc phản 0 ứng lớn, số enzyme có Topt khoảng 50 – 60oC Khi nhiệt độ 80oC hầu hết enzyme bị biến tính khơng thuận nghịch b Tiến hành: Dùng ống nghiệm tiến hành sau Lưu ý: cần đưa tinh bột dịch enzyme nhiệt độ cần đạt cho ống enzyme vào ống tinh bột phải giữ cố định nhiệt độ Sau thời gian ủ, cần làm nguội nhanh ống nghiệm 65oC 90oC nhiệt độ phòng, cho dd I2/KI vào I2 thăng hoa nhiệt độ cao Stt ống Tinh bột Stt ống Dd Nhiệt độ cần Thời Dd Kết nhận nghiệm 1% nghiệm Amylase đạt gian ủ I2/KI xét 2ml 1ml 90oC phút giọt Màu xanh 2ml 1ml 65oC phút giọt Màu vàng 2ml 1ml To phòng phút giọt Màu vàng nâu 2ml 1ml 0o C phút giọt Màu tím c Kết quả: Hình thể ống nghiệm (nhiệt độ theo thứ tự bảng tính từ trái sang phải) 0 d Giải thích kết quả: - Ống 1: Ở 90oC, nhiệt độ cao amylase bị biến tính khơng thuận nghịch nên khơng thể thủy phân tinh bột thành dextrin loại đường, tác dụng với I2/KI cho màu xanh - Ống 2: Enzyme amylase thuỷ phân hoàn toàn tinh bột 65oC nên dung dịch tác dụng với I2/KI xuất màu vàng Amylase phân cắt amilose amilopectin tinh bột thành dextrin loại đường, sản phẩm tác dụng với I2/KI giữ nguyên màu vàng Iod → Ở ống nghiệm 2, enzyme amylase malt đại mạch có nhiệt độ tối thích (Topt) 65oC nhiệt độ khảo sát - Ống 3: Ở nhiệt độ phịng, dung dịch ống có màu vàng nâu, nhiên chưa phải nhiệt độ tối thích để phản ứng xảy hồn toàn Ở nhiệt độ tinh bột phân hủy gần hết cịn sản phẩm trung gian đường dextrin dạng achrodextrin nên tác dụng với I2/KI xuất màu vàng nâu - Ống 4: Khi nhiệt độ 0oC enzim amylase hoạt động r ất yếu, tốc độ thuỷ phân tinh bột diễn chậm thực tế ống nghiệm để tủ lạnh chưa đạt đến nhiệt độ 0oC nên tinh bột bị thủy phân hết được, mà có phân hủy thành đường amylodextrin nên cho tác dụng với I2/KI dung dịch có màu tím nhạt dần nhiệt độ phòng e Bàn luận: - Nếu đưa nhiệt độ cao mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme bị giảm Khi enzyme bất hoạt, biến tính khơng thuận nghịch, khơng cịn khả phục hồi hoạt tính - Nhiệt độ tối ưu enzyme phụ thuộc nhiều vào có mặt chất, kim lọai, pH chất bảo vệ Người ta thường sử dụng yếu tố nhiệt độ để điều 0 khiển hoạt động enzyme amylase t ốc độ phản ứng chế biến bảo quản thực phẩm - Sự phân giải tinh bột enzyme amylase lúc đầu qua sản phẩm trung gian sau tạo maltose glucose Các sản phẩm dextrin trung gian có phân tử lượng khác tác dụng với Iod cho màu khác nhau: Tinh bột + Iod → màu xanh Amylodextrin + Iod → màu tím Eritodextrin + Iod → màu đỏ nâu Achrodextrin + Iod → màu vàng nâu Maltose glucose + Iod → màu vàng Iod - Dựa vào thay đổi màu với hồ tinh bột mà xác định phản ứng xảy giai đoạn hay nói cách khác kiểm tra mức độ bị thủy phân tinh bột đánh giá phần phân tử lượng sản phẩm bị thủy phân - Tốc độ phản ứng enzyme lúc tỉ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng Tốc độ phản ứng tăng đến giới hạn nhiệt độ định Vượt nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng enzyme s ẽ giảm làm enzyme vô hoạt Ảnh hưởng pH: a Nguyên tắc: Hoạt tính enzyme phụ thuộc nhiều vào pH môi trường, giảm hay tăng pH dẫn đến giảm hoạt tính enzyme pH thích hợp cho hoạt động enzyme pH tối thích (pHopt) Mỗi enzyme có pH tối thích, ngồi vùng pH tối thích hoạt động enzyme giảm 0 b Tiến hành: Lấy ống nghiệm tiến hành sau (làm thí nghiệm nhiệt độ phòng) Tinh pH đạt Amylase bột 1% (ml) (ml) Na2HPO4 Acid citric Stt 0,2M (ml) 0,1M (ml) Thời gian ủ Dd I2/KI 5,6 0,5 2,0 phút giọt 6,6 0,5 2,0 phút giọt 0,26 7,2 0,5 2,0 phút giọt 0,06 8,0 0,5 2,0 phút giọt 1,34 0,66 1,54 0,46 1,74 1,94 Lắc c Kết quả: Hình thể ống nghiệm (ống nghiệm t đến theo thứ tự từ trái sang phải) 0 - Ống có màu vàng nâu - Ống có màu đỏ nâu - Ống có màu đỏ nâu - Ống có màu tím xanh d Bàn luận: - Ống có pH 5,6 pH tối thích (pHopt) pH khảo sát - Ống 2, phản ứng thuỷ phân amylase xảy không mạnh cho thấy độ pH khơng thích hợp cho hoạt động enzyme Ảnh hưởng chất hoạt hóa chất kìm hãm: a Ngun tắc: Chất hoạt hóa chất có vai trị làm tăng hoạt độ xúc tác enzyme, mạnh ion, anion 𝐶𝑙 − , 𝐵𝑟 − , 𝐼 − làm tăng hoạt độ α - amylase, ion kim loại 𝑀𝑛2+ , 𝑍𝑛2+ … lại thúc đẩy hoạt độ protease Chất kìm hãm chất làm giảm tốc độ phản ứng enzyme Chúng ion, phân tử vô cơ, hữu cơ, protein b Tiến hành: Lấy ống nghiệm r ồi tiến hành sau (làm thí nghiệm nhiệt độ phịng) Stt Nước cất NaCl 1% (ml) (ml) CuSO4 1% (ml) Tinh bột 1% (ml) Amylase (ml) Thời gian Dd I2/KI (giọt) 1,0 0,0 0,0 2,0 0,2 phút 0,6 0,4 0,0 2,0 0,2 phút 3 0,6 0,0 0,4 2,0 0,2 phút 10 0 c Kết quả: Hình thể ống nghiệm (thứ tự ống đến từ trái sang phải) - Ống có màu xanh nâu - Ống có màu đỏ nâu - Ống có màu xanh 11 0 d Bàn luận: - Ống phản ứng thuỷ phân diễn chậm - Ống phản ứng thuỷ phân diễn nhanh ống nghiệm có chứa NaCl có gốc 𝐶𝑙 − làm tăng hoạt độ α - amylase - Ống phản ứng thuỷ phân amylase không diễn có chứa CuSO4 có 𝐶𝑢 2+ chất kìm hãm thúc đẩy hoạt độ protease gắn vào trung tâm hoạt động enzyme, chiếm chỗ chất làm giảm tốc độ phản ứng enzyme 12 0 ... ĐIỂM Tên bài: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH AMYLASE THEO WOHGEMUTH & KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH AMYLASE Ngày TN: 25/10/2022 I XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH AMYLASE: Nguyên tắc: Enzyme Amylase enzyme... enzyme pH thích hợp cho hoạt động enzyme pH tối thích (pHopt) Mỗi enzyme có pH tối thích, ngồi vùng pH tối thích hoạt động enzyme giảm 0 b Tiến hành: Lấy ống nghiệm tiến hành sau (làm thí nghiệm. .. ứng thuỷ phân amylase xảy không mạnh cho thấy độ pH khơng thích hợp cho hoạt động enzyme Ảnh hưởng chất hoạt hóa chất kìm hãm: a Nguyên tắc: Chất hoạt hóa chất có vai trị làm tăng hoạt độ xúc tác