(TIỂU LUẬN) báo cáo THÍ NGHIỆM hóa SINH ĐỊNH TÍNH và ĐỊNH LƯỢNG NITƠ ACID AMIN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH Tên sinh viên Phan Trần Đăng Khoa Nguyễn Ngọc Như Linh Nguyễn Kim Tuyết Như Phan Thiện Như Bài số: Tên bài: ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG NITƠ ACID AMIN Ngày thí nghiệm: 30/06/2022 A ĐỊNH TÍNH ACID AMIN BẰNG NINHYDRIN I.Nguyên tắc Điể m Ninhydrin chất oxy hóa nên tạo nên phản ứng khử carboxyl oxy hóa acid amin với H 2O, cho CO2, NH3 aldehyde ngắn carbon so với acid amin gốc ninhydrin bị khử( diceto oxyhydren) Ninhydrin Amino Acid Ninhydrin khử Sau đó, ninhydrin bị khử, tác dụng lại với NH3 tạo thành kết hợp với phân tử ninhydrin thứ hai, tạo thành sản phẩm có màu xanh tím Ninhydrin thứ hai II Ninhydrin khử Phức màu xanh tím Cách tiến hành Dùng hai ống nghiệm cho chất theo thứ tự bảng sau: Ống nghiệm III Kết Ống nghiệm (1): Xuất phức màu xanh tím Ống nghiệm (2): Khơng xảy tượng (1) (2) Dung dịch protein trứng sau cho Ninhydrin ( Ống nghiệm bên trái (1) gia nhiệt, ống nghiệm bên phải (2) không gia nhiệt) IV Bàn luận  Ninhydrin tác dụng với acid amin nhiệt độ cao tạo thành NH3 aldehyde tương ứng acid amin bị dezamin hóa, nhóm carboxyl COOH bị oxy hóa  Ninhydrin bị khử tạo thành ninhydrin khử (diceto oxyhydidren)  Sau ninhydrin bị khử, tác dụng lại với NH3 tạo thành kết hợp với phân tử ninhydrin thứ hai tạo thành dung dịch có màu xanh tím ống nghiệm (1)  Ở ống nghiệm (2) khơng có xúc tác nhiệt độ nên phản ứng không xảy B ĐỊNH LƯỢNG NITƠ ACID AMIN THEO PHƯƠNG PHÁP SORENSEN I.Nguyên tắc Khi cho formaldehyde tác dụng với acid amin tạo thành dẫn xuất methylen acid amin Do nhóm amin bị methylene hóa R─CH─COOH + HCHO NH2 Các hợp chất tạo thành acid mạnh acid amin tự , dễ dàng định phân kiềm qua gián tiếp tính lượng nitơ amin acid amin có nguyên liệu R─CH─COOH + NaOH N=CH2 II Cách tiến hành Chuẩn bị thang màu có pH pH 9,2 Chuẩn bị bình nón có dung tích nhau:  Cho vào bình thứ nhất: 20mL dung dịch có pH giọt Bromthymol Blue 0.04%  Cho vào bình thứ 2: 20mL dung dịch có pH 9,2; giọt Bromthymol Blue 0.04% giọt phenolphtalein 0.5%  Dung dịch bình có màu xanh lục nhạt dung dịch bình có màu tím xanh Dung dịch màu chuẩn sau pha ( Dung dịch pH (bên trái) dung dịch pH 9,2 (bên phải) ) Chuẩn bị dung dịch formol trung tính  Tiến hành tủ Hotte thao tác ống đong Lấy 35 mL formol cho vào erlen giọt phenolphtalein 0.5% Nhỏ từ từ NaOH 0.1N Dung dịch màu hồng nhạt Đậy erlen giấy bạc Tiến hành định phân mẫu Cho ml nước mắm vào bình định mức, dùng nước cất định mức thành 100mL Cho 20mL nước mắm định mức vào erlen Dung dịch màu xanh dương Từng giọt HCl H2SO4 0.05N Dung dịch màu vàng Từng giọt NaOH Cùng màu với bình có dung dịch chuẩn pH Thêm giọt phenolphtaline 0.5%, mL formol trung tính Thực lần lấy giá trị * trung bình Ứng với màu bình có pH 9,2 Chuẩn độ NaOH 0.05N  Song song tiến hành làm thí nghiệm kiểm chứng , thay dung dịch mẫu cần nghiên cứu nuớc cất III Kết Kết thí nghiệm Sau chuẩn độ với NaOH 0.05N ta thu erlen có màu tím xanh (1) (2) (3) (4) Dung dịch mẫu sau chuẩn độ với NaOH 0.05N (1),(2),(3) ứng với màu pH 9,2 (4) Kết tính tốn Ta có cơng thức tính số gam Nito acid amin có lít nước mắm sau: X= (a – b) x T x 0.0007 xVDM x 1000 (#) 20 x V Trong đó: X: lượng gam Nitơ acid amin có 1L nước mắm a: số mL NaOH 0.05N dùng để chuẩn dung dịch thí nghiệm b: số mL NaOH 0.05N dùng để chuẩn dung dịch kiểm chứng T: hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch NaOH đem dùng so với nồng độ chuẩn VDM: thể tích bình định mức V: số mL nước mắm cho vào bình định mức  Sau chuẩn độ ta có số mL NaOH 0.05N dùng: VNaOH lần = 3.00 mL VNaOH lần = 3.20 mL VNaOH lần = 3.10 mL  Số mL NaOH 0.05N dùng để chuẩn dung dịch kiểm chứng: 0.1 mL  Thể tích bình định mức: 100 mL  Hệ số hiệu chỉnh Thế tất số liệu vào (#) ta thu Xlần 1= ( 3.00- 0.10) x x 0.0007 x 100 x 1000 = 10.15 g/L 20 x Xlần 2= ( 3.20- 0.10) x x 0.0007 x 100 x 1000 = 10.85 g/L 20 x Xlần 3= ( 3.10- 0.10) x x 0.0007 x 100 x 1000 = 10.50 g/L 20 x Xtrung bình = (10.15+10.85+10.50)/3= 10.50 g/L Mặc khác ta có n (số lần làm thí nghiệm) = ; f = n- = ; P= 0.95 => tp,f = 4.3 Sai số ngẫu nhiên: Sx= √ Sai số ngẫu nhiên tuyệt đối: + =+ Vậy số gam nito acid amin có lit nước mắm X= 10.5 + 0.6 g/L IV Bàn luận  Trong Acid amin có nhóm –COOH( tính acid), NH2 ( tính bazo), ta cho tác dụng với formol để nhóm –NH2 tạo thành nhóm –N=CH2 làm tính bazo Do ta chuẩn độ trung hòa NaOH chất thị màu  Các acid amin dung dịch nước trung tính, gặp formol acid amin bị tính kiềm, tính acid nhóm COOH trội lên nên ta định lượng nhóm COOH dung dịch kiềm chuẩn  Khi thêm giọt Bromthymol Blue có trường hợp xảy ra:  Mẫu có màu xanh lục nhạt giống mẫu pH7 -> mơi trường trung tính  Mẫu có màu xanh dương -> môi trường base -> thêm acid mẫu có màu bình pH7  Mẫu có màu vàng -> mơi trường acid -> thêm NaOH mẫu có màu bình pH7  Ở mẫu nước mắm cho giọt Bromthymol Blued vào mẫu có màu vàng ta thêm NaOH để đưa mẫu pH7  Ranh giới chuyển màu rõ ràng nên kết ổn định, thời gian phân tích nhanh, điều kiện đơn giản tốn hóa chất 7 Điểm Bài số: Tên bài: ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C VÀ KHẢO SÁT CÁC ENZYME HÔ HẤP Ngày thí nghiệm: 30/06/2022 A ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C I Nguyên tắc Acid ascorbic (vitamin C) hợp chất chưa no có chứa nhóm endiol Acid ascorbic bị phá hủy nhanh tác dụng chất oxy hóa bền mơi trường acid Phương pháp dựa nguyên tắc acid ascorbic có khả oxy hóa thuận nghịch nhờ phân tử có nhóm endiol –C(OH)=(OH)C Ta xác định acid ascorbic phương pháp chuẩn độ KIO3/KI theo phản ứng sau: KIO3 + 5KI +6HCl → 3I2 + 6KCl + 3H2O II Cách tiến hành Chuẩn bị mẫu Cân 10g dứa Cho dứa vào cối + HCl 1% ngập mẫu Nghiền dứa (không 10ph) Lọc lấy dịch Chuyển dịch vào bình định mức, định phân HCl 1% Thực Hút 10mL dịch từ bình định vào erlen 100mL Nhỏ vài giọt hồ tinh bột 1% Định phân KIO3/KI 0.01N đến xuất màu xanh Định phân lần Thay dịch chứa vitamin C dung dịch HCl 1%, tiến hành song song với mẫu kiểm chứng III Kết Kết thí nghiệm: Sau tiến hành chuẩn độ với KIO3/KI ta kết sau: (1) (2) (3) (4) Bình (1) ,(2), (3), (4) xuất màu xanh chất thị hồ tinh bột Kết tính tốn Ta có cơng thức tính số gam Nito acid amin có lít nước mắm sau: X= (a – b) x 0,88 xVDM x 100 (#) 10 x V (hay m) Trong đó: X: hàm lượng vitamin C (mg/100mL) (mg/100g) a: số mL KIO3/KI 0.01 N dùng để chuẩn độ mẫu chứa vitamin C b: số mL KIO3/KI 0.01 N dùng để chuẩn dung dịch kiểm chứng 0.88 số mg acid ascorbic ứng với 1mL dung dịch KIO3/KI 0.01 N VDM: thể tích bình định mức V hay m: thể tích hay khối lượng mẫu ban đầu  Sau chuẩn độ ta có số mL KIO3/KI 0.01 N dùng: V KIO3/KI lần = 11.55 mL V KIO3/KI lần = 11.55 mL V KIO3/KI lần = 11.53mL  Số mL KIO3/KI 0.01 N dùng để chuẩn dung dịch kiểm chứng: 0.1 mL  Thể tích bình định mức: 50 mL Thế tất số liệu vào (#) ta thu Xlần 1= (11.55 – 0.1) x 0.88 x 100 x 50 = 503.80 mg/g 10 x 10 X lần 2= (11.55 – 0.1) x 0.88 x 100 x 50 = 503.80 mg/g 10 x 10 X lần 3= (11.53 – 0.1) x 0.88 x 100 x 50 = 502.92 mg/g 10 x 10 Xtrung bình= ( 503.08+503.80+502.92)/3= 503.36 mg/g Mặc khác ta có n (số lần làm thí nghiệm) = ; f = n- = ; P= 0.95 => tp,f = 4.3 Sai số ngẫu nhiên: Sx= √ Sai số ngẫu nhiên tuyệt đối: + =+ Vậy hàm lượng vitamin C X= 503,36+ 1.24 mg/g IV Bàn luận  Vitamin C bền môi trường acid nên nghiền mẫu ta nghiền chung với HCl để giữ lại lượng vitamin C có mẫu giúp làm mềm mẫu  Trong phân tử acid ascorbic có chứa nhóm endiol -C(OH)=(OH)C- có khả oxy hóa thuận nghịch => bị iod tạo từ phản ứng KIO3/KI HCl oxy hóa thành acid dehydroascorbic 10  Khi lượng Iod dư làm thị hồ tinh bột đổi thành màu xanh => xác định hàm lượng vitamin C phương pháp chuẩn độ KIO3/KI B CÁC ENZYME HÔ HẤP I Dehydrogenase Nguyên tắc Dehydrogenase nhóm enzyme oxi hóa khử xúc tác cho phản ứng tách H trực tiếp từ chất giai đoạn đầu chuỗi hơ hấp Có vai trị quan trọng q trình sinh tổng hợp Cách tiến hành Cho vào 1/3 ống nghiệm củ cải cắt mỏng Thêm xanh methylene 0.01% ngập củ cải Đổ lên lớp dầu lửa Phơi nắng ống nghiệm tiếng Làm ống nghiệm kiểm chứng không chứa củ cải Kết 3.1 Kết thí nghiệm: 11 - Ố n g nghiệm (1) có chứa củ cải : xanh methylene dần chuyển thành màu trắng Ống nghiệm (2) không chứa cải: xanh methylene không chuyển màu Bàn luận Dehydrogenase tham gia trình tách H2 giai đoạn đầu chuỗi hơ hấp Do cho xanh methylene 0.01% vào củ cải H2 giải phóng kết hợp với gốc N Cl xanh methylene làm cho màu II Catalase Nguyên tắc Catalase loại enzyme Hemoprotein Ở tế bào thực vật catalase chứa nhóm Hem Khi enzyme xúc tác Fe nhóm ngoại khơng thay đổi hóa trị Fe Fe catalase 12 Cách tiến hành Nghiền kỹ 10g khoai tây Thêm 10mL nước cất Lọc Cho vào ống nghiệm 2mL H2O2 1% Hút 0.5mL dịch lọc vào ống nghiệm Kết Ống nghiệm cho dịch khoai tây tác dụng với H2O2 xuất hiện tượng sủi bọt Bàn luận  Trong khoai tây có chứa enzynme catalase, enzyme có khả phân hủy H2O2 thành O2 H2O  Khi cho dịch lọc khoai tây vào ống nghiệm chứa H2O2 xuất hiện tượng sủi bọt ống nghiệm 13 ... methylen acid amin Do nhóm amin bị methylene hóa R─CH─COOH + HCHO NH2 Các hợp chất tạo thành acid mạnh acid amin tự , dễ dàng định phân kiềm qua gián tiếp tính lượng nitơ amin acid amin có nguyên... ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C VÀ KHẢO SÁT CÁC ENZYME HƠ HẤP Ngày thí nghiệm: 30/06/2022 A ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C I Nguyên tắc Acid ascorbic (vitamin C) hợp chất chưa no có chứa nhóm endiol Acid ascorbic... ống nghiệm (1)  Ở ống nghiệm (2) khơng có xúc tác nhiệt độ nên phản ứng không xảy B ĐỊNH LƯỢNG NITƠ ACID AMIN THEO PHƯƠNG PHÁP SORENSEN I.Nguyên tắc Khi cho formaldehyde tác dụng với acid amin