Báo Cáo Thí Nghiệm Kiểm Soát Vi Sinh Vật Trong Thực Phẩm.pdf

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM

KIỂM SOÁT VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM

Họ và tên : Nguyễn Thị Quỳnh Anh

Hà Nội, tháng 12 năm 2021

Trang 2

BÀI 1 CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TỔNG SỐ1 Nguyên tắc

- Vi sinh vật tổng số là tất cả các vi sinh vật có thể tồn tại và phát triển được trên môitrường dinh dưỡng chung, ở nhiệt độ 30˚C sau một thời gian nuôi cấy nhất định (24 –72 giờ).

- Nuôi cấy một lượng mẫu nhất định hoặc mẫu đã pha loãng trên môi trường thạchdinh dưỡng ở nhiệt độ 30 ± 1˚C trong điều kiện hiếu khí, thời gian 48 – 72 giờ Đếmtất cả số khuẩn lạc mọc trên đó Từ tổng số khuẩn lạc đếm được sẽ suy ra số lượng tếbào sống có trong mẫu phân tích.

Chú ý: phương pháp này không thể xác định được các loại vi sinh vật yếm khí nghiêmngặt mà chỉ xác định được vi sinh vật hiếu khí và yếm khí tùy tiện.

- Cần chọn độ pha loãng thích hợp sao cho số khuẩn lạc mọc trên mỗi hộp petrikhoảng từ 30 – 300.

3 Hóa chất, môi trường

- Môi trường TGA (Trypton Glucoza Agar): Trypton hoặc peptone 5g; glucoza 4g;

cao nấm men 2,5g; thạch 15g; H O cho đủ 1000 ml Chuẩn bị 350 ml môi trường,2

tương đương với 16 đĩa petri cho cả 4 nhóm) Môi trường đem hấp khử trùng ở121˚C trong 20 phút.

- Dung dịch pha loãng: nước muối sinh lý vô trùng (0,85% NaCl) Cân 5,1g muối cho

vào cốc 500ml, thêm nước cất vào bình, định lượng đến 600ml, dùng đũa thủy tinhkhuấy đều rồi đem hấp khử trùng ở 121˚C trong 20 phút Chúng ta chuẩn bị 600 mlnước muối sinh lý vô trùng cho cả 4 nhóm.

2

Trang 3

4 Tiến hành

- Mẫu thí nghiệm: nem chua

- Bật ngọn lửa đèn cồn, dùng cồn vệ sinh tay và xung quanh vị trí làm việc- Rửa sạch và khử trùng các dụng cụ cũng như dung dịch pha loãng.- Lấy mẫu đem nghiền nhỏ

- Cân 10g mẫu, chuyển mẫu vào bình tam giác.

- Thêm 90 ml nước muối sinh lý vô trùng vào bình tam giác chứa mẫu và lắc đều.- Pha loãng thập phân mẫu phân tích đến 10 -5

- Cấy giống trên bề mặt thạch:

+ Môi trường sau khi hấp khử trùng thì rót vào các đĩa petri, mỗi đĩa cho 15 -18 mlmôi trường Xếp các đĩa trên mặt phẳng ngang, để yên cho đến khi thạch nguội vàđông hoàn toàn (có thể để 2-3 ngày ở nhiệt độ 30˚C để kiểm tra độ vô trùng của cáchộp) Khi cấy chọn các hộp petri còn hoàn toàn vô trùng.

+ Lấy 0,1 ml mẫu đã pha loãng cho vào hộp petri đã chứa môi trường thạch dinhdưỡng (làm tại 2 độ pha loãng 10 , 10 , mỗi độ pha loãng làm 2 hộp) Chang đều trên-2-3

Trong đó: n : số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 1 (độ pha loãng thấp nhất) 1

n2: số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 2 (độ pha loãng tiếp theo) f1: hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ nhất

v: thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa petriΣ

Σ: tổng số khuẩn lạc trên tất cả các đĩa

Trang 4

6 Nhận xét

- ………- Số lượng vi sinh vật trung bình có trong 1g là ……… CFU/g

- Nguyên nhân:

+ Do nem chua được làm từ thịt nên không thể đảm bảo vệ sinh trong quá trìnhgiết mổ, vận chuyển, bảo quản và mua bán.

+ Trong lúc thực hiện vi sinh vật từ môi trường bên ngoài bay vào.

+ Thí nghiệm tiến hành có thể có sai số trong quá tình tiến hành: trang mẫukhông chuẩn, xác định và đếm khuẩn lạc không chính xác, sai số do dụng cụhay các sai số thí nghiệm khác.

- So sánh với Bảng chỉ tiêu vi sinh vật trong nhóm thực phẩm nem chua ( theo quyếtđịnh của Bộ trưởng Bộ Y tế, số 667/1998/QĐ-BYT) đối với chỉ tiêu tổng số vi khuẩnhiếu khí là 3.10 CFU/g thì vi sinh vật tổng số của sản5

……… ………

4

Trang 5

BÀI 2 CHỈ TIÊU NẤM MEN, NẤM MỐC1 Tổng quan và nguyên tắc

- Mục đích thí nghiệm: xác định số lượng nấm men – nấm mốc có trong sản phẩmthực phẩm để đánh giá chất lượng, tình trạng vệ sinh và các điều kiện bảo quản sảnphẩm và dự đoán khả năng hư hỏng của sản phẩm.

- Môi trường dinh dưỡng YGC (Yeast Glucose Chloramphenicol) chứa chất ức chế sựphát triển của vi khuẩn là Chloramphenicol.

- Cấy lên bề mặt thạch của môi trường YGC một lượng mẫu đã được pha loãng nhấtđịnh và nuôi ở nhiệt độ 30 ± 1˚C trong điều kiện hiếu khí, thời gian 48 – 72 giờ Đếmtất cả số khuẩn lạc mọc trên đó từ đó suy ra lượng nấm men và nấm mốc trong mẫuphân tích.

- Môi trường YGC ( Yeast Glucose Chloramphenicol): Glucoza 20g cao nấm men; 5g;thạch 15g; Chloramphenicol ( hoặc Tetracyclin hay Oxytetracylin) 0,1g; H2O cho đủ1000 ml Chuẩn bị 350 ml môi trường, tương đương với 16 đĩa petri cho cả 4 nhóm).Môi trường đem hấp khử trùng ở 121˚C trong 20 phút.

- Dung dịch pha loãng: nước muối sinh lý vô trùng (0,85% NaCl): Cân 5,1g muối cho

4 Tiến hành

- Mẫu thí nghiệm: nem chua

- Bật ngọn lửa đèn cồn, dùng cồn vệ sinh tay và xung quanh vị trí làm việc- Rửa sạch và khử trùng các dụng cụ cũng như dung dịch pha loãng

Trang 6

- Lấy mẫu đem nghiền nhỏ

- Cân 10g mẫu, chuyển mẫu vào bình tam giác.

- Thêm 90 ml nước muối sinh lý vô trùng vào bình tam giác chứa mẫu và lắc đều.- Pha loãng thập phân mẫu phân tích đến 10 -4

- Cấy giống trên bề mặt thạch:

+ Lấy 0,1 ml mẫu đã pha loãng cho vào hộp petri đã chứa môi trường thạch dinhdưỡng (làm tại 2 độ pha loãng 10 , 10 , mỗi độ pha loãng làm 2 hộp) Thang đều trên-1-2

n2: số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 2 (độ pha loãng tiếp theo) f1: hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ nhất

v: thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa petri

Σ Σ: tổng số khuẩn lạc trên tất cả các đĩa

6 Nhận xét:

6

Trang 7

- Nguyên nhân:

+ Do nem chua làm từ thịt nên không thể đảm bảo vệ sinh trong quá trình giếtmổ, vận chuyển, bảo quản và mua bán.

- So sánh với Bảng chỉ tiêu vi sinh vật trong nhóm thực phẩm nem chua ( theo quyếtđịnh của Bộ trưởng Bộ Y tế, số 667/1998/QĐ-BYT) đối với chỉ tiêu tổng số bào tử

mốc……… ………

Trang 8

BÀI 3: CHỈ TIÊU COLIFORMS VÀ E COLI

- Mục đích thí nghiệm: xác định Coliform và E.coli cho biết mức độ nhiễm và tìnhtrạng vệ sinh trong phân xưởng sản xuất, hoặc chính xác hơn là mức độ nhiễm phâncủa sản phẩm.

A Định lượng Coliform

I Phương pháp MPN1 Nguyên tắc

- Mẫu được pha loãng ít nhất ở ba độ pha loãng liên tiếp nhau và mỗi độ pha loãngđược cấy trong 3 ống fancol lặp lại có chứa môi trường tăng sinh chọn lọc ( môitrường lỏng Tryptoza Lauryl Sulffat, TLS).

- Sau thời gian nuôi cấy, quan sát và ghi nhận các ống dương tính và cấy tiếp sangmôi trường khẳng định ( môi trường lỏng mật lactoza lục sáng – Brilliant Green BileLactoza Broth, BGBLB) Từ các ống nghiệm có phản ứng dương tính, tra bảng MacGrady để suy ra số lượng coliform có trong mấu phân tích.

2 Dụng cụ

- Dụng cụ, chuẩn bị mẫu- Ống durham, pipet3 Hóa chất, môi trường

- Môi trường TLS ( tryptoza lauryl sulfat): tryptoza 20g; lactoza 5g; K2HPO4 2,75g;KH PO24 2,75g; NaCl 5g; natri lauryl sulfat 0,1g; H O cho đủ 1000ml Chuẩn bị 800ml2

môi trường TLS (dùng cho cả E.Coli) Sau đó phân phối môi trường vào các ốngfancol có ống Durham Mỗi nhóm chuẩn bị 9 ống, mỗi ống chứa 10ml môi trường.Đem ống TLS hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 C trong 20 phút.o

- Môi trường BGBLB (canh thang mật lactoza lục sáng – Brilliant Green Bile Lactoza

Broth): Pepton 10g; lactoza 10g; mật bò khô 20g; lục sáng 0,0133g; H O cho đủ2

1000ml Cân 24g bột môi trường BGBLB pha sẵn cho vào bình, thêm nước cất vàobình, định lượng đến 600ml, đóng nắp bình lại rồi lắc đều Sau đó phân phối môitrường vào các ống fancol Mỗi nhóm chuẩn bị 9 ống, mỗi ống chứa 10ml môi trường.Đem ống BGBLB Hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 C trong 20 phút.o

4 Tiến hành

- Mẫu thí nghiệm: nem chua

8

Trang 9

- Bật ngọn lửa đèn cồn, dùng cồn vệ sinh tay và xung quanh vị trí làm việc- Rửa sạch và khử trùng các dụng cụ cũng như dung dịch pha loãng.- Lấy mẫu nghiền nhỏ

- Cân 10g mẫu, chuyển mẫu vào bình tam giác.

- Thêm 90 ml nước muối sinh lý vô trùng vào bình tam giác chứa mẫu và lắc đều.- Pha loãng thập phân mẫu phân tích đến 10 -3

- Tuần tự cấy 1ml dịch mẫu đã pha loãng ở các nồng độ 10 , 10 , 10 vào các ống-1-2-3

nghiệm có chứa môi trường tăng sinh chọn lọc TLS, mỗi độ pha loãng làm 3 ống lặplại Để các ống đã cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 37±1 C trong 48h Quan sát và ghi nhậno

các ống có sinh khí và đục (có kết quả dương tính).

- Dùng pipet cấy chuyển 1 ml mẫu từ các ống nghiệm dương tính sang các ốngnghiệm có chứa môi trường BGBLB Để các ống đã cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ37±1oC trong 48h Với độ pha loãng, tính tổng số ống có sinh khí và đục ( có kết quảdương tính).

5 Kết quả

Ghi nhận các ống bị làm đục và sinh khí trong ống durham dương tính

Môi trường Số ống dương tính

Nồng độ 10-1 Nồng độ 10-2 Nồng độ 10-3

TLSBGBLB

Trang 10

6 Nhận xét………

Môi trường Endo có chứa natri sulfit và fucshin, có khả năng ức chế các vi khuẩngram (+) Trong quá trình phát triển trên môi trường này, coliform lên men đườnglactoza tạo thành aldehyt và axit, aldehyt tác động đến phức chất fucshin-sulfit và giảiphóng fucshin, sau đó fucshin nhuộm các khuẩn lạc từ màu hồng đến màu đỏ cánhsen, tròn, bờ đều, có thể có ánh kim hoặc không.

- Môi trường Endo: pepton 10g; lactoza 10g; K2HPO4 2,5g; natri sulfit 3g; fucshinkiềm 0,3g; thạch 15g; H O cho đủ 1000ml; pH = 7,5 Chuẩn bị 700 ml môi trường,2

tương đương với 16 đĩa petri cho cả 4 nhóm) Môi trường đem hấp khử trùng ở121˚C trong 20 phút.

- Dung dịch pha loãng: nước muối sinh lý vô trùng (0,85% NaCl) Cân 5,1g muối cho

3 Tiến hành

- Mẫu thí nghiệm: nem chua

- Rửa sạch và khử trùng các dụng cụ cũng như dung dịch pha loãng.- Bật ngọn lửa đèn cồn, dùng cồn vệ sinh tay và xung quanh vị trí làm việc

10

Trang 11

- Lấy mẫu đem nghiền nhỏ

- Cấy giống trên bề mặt thạch:

+ Lấy 0,1 ml mẫu đã pha loãng cho vào hộp petri đã chứa môi trường thạch dinhdưỡng (làm tại 2 độ pha loãng 10 , 10 , mỗi độ pha loãng làm 2 hộp) Chang đều-1-2

trên mặt thạch.

+ Lật ngược đĩa, đặt vào tủ ấm để nhiệt độ 37 ± 1˚C trong thời gian 48 – 72 giờ.- Trên mỗi hộp petri đã nuôi, chọn các khuẩn lạc có màu hồng đến màu đỏ cánh sen,tròn, bờ đều.

n : số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 2 (độ pha loãng tiếp theo) 2

f1: hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ nhấtv: thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa petri

Σ: tổng số khuẩn lạc trên tất cả các đĩa

5 Nhận xét

- Các khuẩn lạc có màu có màu hồng đến màu đỏ cánh sen, bờ đều, không có ánh kim.

Trang 12

- Các khuẩn lạc mọc không đều, bị loang, có nhiều khuẩn lạc dính nhau.- Số lượng Coliform có trong 1 g mẫu là ……… CFU/g

- Nguyên nhân:

+ Do nem chua làm từ thịt nên không thể đảm bảo vệ sinh trong quá trình giếtmổ,chế biến, vận chuyển, bảo quản và mua bán.

- So sánh với Bảng chỉ tiêu vi sinh vật trong nhóm thực phẩm nem chua ( theo quyết

định của Bộ trưởng Bộ Y tế, số 667/1998/QĐ-BYT) đối với chỉ tiêu Coliform

12

Trang 13

B Định lượng E.coli

I Phương pháp MPN1 Nguyên tắc

Mẫu được pha loãng ở ba độ pha loãng liên tiếp nhau và mỗi nồng độ pha loãng đượccấy trong 3 ống nghiệm lặp lại chứa môi trường tăng sinh chọn lọc ( môi trường lỏngTryptoza Lauryl Sulffat, TLS) Sau thời gian nuôi cấy, quan sát và ghi nhận các ốngdương tính và cấy tiếp sang môi trường EC Từ các ống nghiệm có phản ứng dươngtính cấy sang các ống nghiệm có chứa nước trypton Sau khi đã nuôi cấy ở nhiệt độ44oC thì kiểm tra có sinh indol hay không Đếm số ống nghiệm nuôi cấy trên môitrường EC dương tính ứng với các ống có sinh indol, tra bảng Mac Grady để từ đó suyra số lượng E.coli có trong mẫu phân tích.

- Môi trường TLS (tryptoza lauryl sulfat): tryptoza 20g; lactoza 5g; K2HPO4 4g;KH PO24 1,5g; NaCl 5g; H2O cho đủ 1000ml.

- Môi trường EC: tryptoza 20g; lactoza 5g, muối mật ( bile salts) số 3 1,5g; lục sáng

0,00133g ; H O cho đủ 1000ml.2

- Dung dịch trypton: trypton 10g; NaCl 5g; H O cho đủ 1000ml; pH = 7,3 ở nhiệt độ2

- Thuốc thử indol: 4-dimethylaminobenzaldehyt 5g; 2-metyl butan-1-ol ( hoặc

pental1-ol) 75ml; HCl đậm đặc 25ml Hòa tan 4-dimethylaminobenzaldehyt trong metyl butan-1-ol ( hoặc pental-1-ol), hoặc đun nhẹ trong nồi cách thủy 50-55 C Làmo

2-nguội và cho axit vào, bảo quản chỗ tối ở nhiệt độ thấp Thuốc thử có màu vàng sáng.

3 Tiến hành thí nghiệm- Mẫu thí nghiệm: nem chua

- Bật ngọn lửa đèn cồn, dùng cồn vệ sinh tay và xung quanh vị trí làm việc- Rửa sạch và khử trùng các dụng cụ cũng như dung dịch pha loãng.- Lấy mẫu nghiền nhỏ

Trang 14

- Tuần tự cấy 1ml dịch mẫu đã pha loãng vào các ống nghiệm ở các nồng độ 10 , 10 ,10-3 chứa môi trường tăng sinh chọn lọc TLS, mỗi độ pha loãng làm 3 ống lặp lại Đểcác ống cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 44 ± 1 C trong 24 - 48h Quan sát và ghi nhận cáco

ống có sinh khí và đục ( có kết quả dương tính).

Dùng pipet cấy chuyển 1 ml dịch mẫu từ các ống nghiệm dương tính sang các ốngnghiệm có chứa môi trường EC Để các ống đã cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 44 ± 1oCtrong 24 - 48h Quan sát và ghi nhận các ống có sinh khí và đục ( có kết quả dươngtính).

Phép thử khẳng định:

- Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu từ các ống nghiệm có chứa môi trường ECdương tính sang các ống nghiệm có chứa nước trypton Để các ống đã cấy trong tủấm ở nhiệt độ 44 ± 1 C trong 48h.o

- Thêm 0,5ml thuốc thử indol vào các ống chứa dung dịch trypton đã nuôi cấy, lắc đềuvà sau 1 phút thì quan sát và ghi nhận số lượng các ống có màu đỏ (kết quả dươngtính) cho mỗi độ pha loãng.

Trang 15

Môi trường Endo có natri sulfit và fucshin, có khả năng ức chế các vi khuẩn gram (+).Trong quá trình phát triển trên môi trường này Coliform chịu nhiệt và E.coli lên menđường lactoza ở 44 C tạo thành aldehyt và axit, aldehyt tác động đến phức chất o

fucshin-sulfit và giải phóng fucshin, sau đó fucshin nhuộm các khuẩn lạc thành màuhồng đến màu đỏ cánh sen, tròn, bờ đều, có thể có ảnh kim hoặc không Nếu khuẩnlạc hồng có ánh kim có thể giả định là E.coli thì kiểm tra có sinh indol hay không.

- Môi trường Endo: pepton 10g; lactoza 10g; K2HPO4 2,5g; sulfit natri 3,3g; fucshinkiềm 0,3g; thạch 15; H O đủ 1000ml; pH=7,5.2