TÓM TẮT Trong thí nghiệm này nhằm thực hiện phân lập, khảo sát và định danh các chủng vi khuẩn từ mẫu đất thu được tại khu vực RNM huyện Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh bằng phương pháp n
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Thời gian và địa điểm thực hiện
Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 4 năm 2023 tại phòng 315, Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là các chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu đất khác nhau thu thập tại 2 địa điểm (bảng 3.1) thuộc huyện Cần Giờ.
Bảng 3 1 Địa điểm thu mẫu đất
STT Địa điểm thu mẫu Khối lượng mẫu (kg) Tọa độ
1 Bìa rừng Sác huyện Cần Giờ 1 10.5332773, 106.8425624
3.2.2 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất
3.2.2.1 Dụng cụ và thiết bị
Dụng cụ: Túi zip nhựa, đá gel, thùng giữ nhiệt, bình tam giác (250 mL), ống nghiệm, đĩa Petri, que cấy kim loại (que cấy vòng, que cấy trang), micropipette (1000 àL), đốn cồn, ống đong (10 mL, 250 mL và 500 mL), ống Falcon (50 mL), eppendorf (1,5 mL) Thiết bị: Kính hiển vi, nồi hấp vô trùng, cân kỹ thuật, máy lắc, tủ cấy vô trùng, máy vortex, lò vi sóng và tủ đông
Dung dịch nước muối sinh lý 0,9% NaCl (w/v) được sử dụng để pha loãng mẫu Trong nghiên cứu, môi trường nuôi cấy sử dụng gồm: môi trường khoáng cơ bản (Mineral salt medium - MSM) bổ sung 1% CMC dùng để phân lập và khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase; MSM chứa 1% CMC bổ sung 3, 5, 7 % NaCl để khảo sát khả năng chịu mặn; và môi trường tăng sinh.
Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Thu mẫu và phân lập vi khuẩn có khả năng sinh enzyme cellulase từ các mẫu đất
Thu mẫu đất: Mẫu đất được thu trực tiếp tại rừng ngập mặn thuộc huyện Cần Giờ Mẫu đất được thu ngẫu nhiên tại rừng ngập mặn Cần Giờ ở tầng mặt có độ sâu từ
2 - 10 cm nơi có xác thực vật phân hủy hoặc vùng rễ cây Mẫu sau khi thu thập được cho vào túi zip vô trùng và bảo quản lạnh dưới 10 o C để giữ nguyên trạng thái tự nhiên của mẫu Vận chuyển mẫu về phòng thí nghiệm và thực hiện các thí nghiệm trong vòng
48 giờ sau khi thu mẫu
Mẫu đất được cân định lượng là 1 g/mẫu và tiến hành huyền phù một hỗn hợp đồng nhất bằng dung dịch nước muối sinh lý 0,9% NaCl (w/v) Tiếp sau đó, pha loãng dịch huyền phù với tỷ lệ 9 mL nước muối sinh lý với 1 mL dịch pha loãng Tiếp tục pha loãng dung dịch trên với dãy các nồng độ lần lượt là 10 -3 , 10 -4 và 10 -5 Chuẩn bị môi trường khoáng cơ bản có bổ sung CMC đổ vào các đĩa petri (khoảng 2/3 thể tích đĩa) và để đông tự nhiên từ ngày hôm trước (cần tránh tạo hơi nước quá nhiều trên nắp đĩa) Sử dụng micropipet hỳt 100 àL dung dịch pha loóng ở ba nồng độ liờn tiếp là 10 -3 , 10 -4 và
Sau khi chuẩn bị môi trường thạch, cấy trải các chủng vi khuẩn lên bề mặt thạch với 10 nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ lặp lại 2 lần Ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ, vi khuẩn sẽ phát triển thành các khuẩn lạc riêng biệt Tiến hành quan sát và chọn các khuẩn lạc đơn nhô cao lên bề mặt thạch, coi mỗi khuẩn lạc là một chủng riêng Sau đó, cấy chấm điểm các chủng vi khuẩn đã chọn lên môi trường MSM để bảo quản, đánh số thứ tự để dễ dàng theo dõi và nghiên cứu.
1, 2, 3 …) để phân biệt các khuẩn lạc đơn Bỏ qua bước làm thuần trên môi trường thạch, nhuộm các khuẩn lạc bằng Congo Red 1% và sau đó rửa sạch bằng NaCl 1M để bước đầu chọn ra những khuẩn lạc có khả năng phân giải cellulose Tiến hành chọn và trữ các chủng phân lập đó vào môi trường MSM trước khi thực hiện các thí nghiệm tiếp theo
3.3.2 Khảo sát hoạt tính của vi khuẩn phân lập
Các chủng vi khuẩn phân lập trữ trong các đĩa chứa môi trường MSM Tiến hành cấy ria các chủng vi khuẩn phân lập trên thạch đĩa MSM có bổ sung NaCl nồng độ 3%, 5%, 7% Ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày Kiểm tra khả năng chịu mặn của các chủng bằng cách so sánh, quan sát sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn trên môi trường có bổ sung NaCl so với mẫu đối chứng (sinh trưởng phát triển trên môi trường không bổ sung NaCl)
3.3.2.2 Khả năng tổng hợp enzyme cellulase
Các chủng vi khuẩn phân lập trữ trong các đĩa môi trường thạch MSM Lựa chọn các khuẩn lạc đơn để tiến hành cấy điểm trên MSM ở nhiệt độ phòng trong khoảng 3 ngày Mỗi chủng vi khuẩn khảo sát được cấy lặp lại 2 lần trên 2 đĩa môi trường khác nhau Mỗi điểm khuẩn được rửa sạch khỏi đĩa bằng nước cất trước khi nhuộm đĩa bằng dung dịch Congo Red 1%, tiếp theo rửa bằng dung dịch muối NaCl 1M và tiến hành đo vòng phân giải để tuyển chọn chủng có khả năng phân giải cellulose cao nhất
3.3.3 Định danh chủng vi khuẩn phân lập
Mô tả đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn tuyển chọn
Cấy ria làm thuần vi khuẩn được tuyển chọn trên môi trường MSM, ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 3 ngày Xác định kiểu hình của khuẩn lạc dựa trên năm tham số: kích thước, hình thức, màu sắc, kết cấu và lề khuẩn lạc So sánh hình thái khuẩn lạc đã mô tả với các loài tiêu chuẩn và đưa ra nhận định ban đầu dựa trên hình thái khuẩn lạc
Mô tả đặc điểm tế bào vi khuẩn tuyển chọn
Tiến hành nhuộm Gram tế bào và tạo tiêu bản từ khuẩn lạc đã thu được Xem tiêu bản đã tạo ở thấu kính 100X và mô tả các đặc điểm tế bào vi khuẩn đã tuyển chọn Các đặc điểm cần mô tả: Hình dạng tế bào, cấu trúc, khả năng di động (có hoặc không), … Kết hợp với mô tả về hình thái khuẩn lạc ta có thể so sánh tương quan với các chủng vi khuẩn, xạ khuẩn tiêu chuẩn đã được mô tả trong các nghiên cứu trước đây và đưa ra nhận định ban đầu
Các phản ứng sinh hóa đặc trưng của chủng vi khuẩn được kiểm tra thông qua phản ứng catalase, phản ứng oxydase và khả năng sinh H2S trên môi trường KIA Phản ứng catalase kiểm tra khả năng sản sinh enzyme catalase phân hủy hydro peroxide Phản ứng oxydase kiểm tra sự hiện diện của enzyme cytochrome oxidase, liên quan đến chuỗi vận chuyển điện tử Phản ứng sinh H2S kiểm tra khả năng khử lưu huỳnh của vi khuẩn, cho thấy sự hiện diện của enzyme sulfhydryl Những phản ứng này hỗ trợ trong việc xác định các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn, cung cấp thông tin quan trọng cho phân loại và chẩn đoán.
3.3.3.2 Định danh sinh học phân tử
Chủng vi khuẩn tuyển chọn được tăng sinh trong môi trường LB ủ lắc qua đêm ở nhiệt độ phòng Thu sinh khối bằng cách ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 5 phút DNA tổng số của vi khuẩn được ly trích với GeneJET Genomic DNA Purification Kit (Thermo
Scientific) theo hướng dẫn của nhà sản xuất DNA tổng số được kiểm tra chất lượng, nồng độ và sau đó được sử dụng làm khuôn để khuếch đại đoạn gene 16S rRNA bằng
PCR, với cặp primer 27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) và 1492R (5’-
Phản ứng PCR thực hiện với tổng thể tớch 25 àL bao gồm cỏc thành phần sau:
12,5 àL Dream Taq 2X, 0,5 àL primer 27F 10 àM, 0,5 àL primer 1492R 10 àM, 2 àL
DNA và 9,5 àL nước cất Chu trỡnh nhiệt của phản ứng PCR gồm 3 giai đoạn: tiền biến tính: 95 o C 5 phút; 35 chu kỳ được với mỗi chu kỳ bao gồm: biến tính: 95 o C 30 giây, bắt cặp: 52 o C 30 giây, kéo dài: 72 o C 90 giây; giai đoạn kết thúc: 72 o C 7 phút Sản phẩm
PCR có được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1% và sau đó được gửi giải trình tự tại công ty Nam Khoa
Kết quả giải trình tự được phân tích bằng phần mềm BioEdit và MEGAX xây dựng cây phát sinh loài để mô tả mối quan hệ di truyền với các trình tự tương đồng chọn lọc.
Phương pháp xử lý số liệu
Dữ liệu giải trình tự được xử lý bằng phần mềm Bioedit và MEGAX để chuyển trình tự từ dạng peak sang dạng mã và xây dựng cây phát sinh loài