báo cáo kết quả thực tập về đặc điểm thực vật và thành phần hoá học của cây lục lạc ba lá tròn tiểu luận nghiên cứu dược liệu biển

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOBỘ Y TẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNGBÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC TẬP VỀĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦACÂY LỤC LẠC BA LÁ TRÒN TIỂU LUẬN NGHIÊN CỨU DƯỢC LIỆU BI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG

BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC TẬP VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA CÂY LỤC LẠC BA LÁ TRÒN TIỂU LUẬN NGHIÊN CỨU DƯỢC LIỆU BIỂN

HẢI PHÒNG, NĂM 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG

BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC TẬP VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA CÂY LỤC LẠC BA LÁ TRÒN

TIỂU LUẬN NGHIÊN CỨU DƯỢC LIỆU BIỂN

Bộ môn: THỰC VẬT – DƯỢC LIỆU

em được tìm hiểu, nghiên cứu về một số dược liệu biển Chúng em cảm ơn thầy cô

đã tạo điều kiện để chúng em được đi thực địa, tìm hiểu và tự tay thu hái một số loàithực vật ngập mặn; qua đó chúng em có được những trải nghiệm và được học hỏithêm nhiều kiến thức thực tế Chúng em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS.Ngô Thị Quỳnh Mai đã hướng dẫn, giúp đỡ chúng em tìm kiếm, tra cứu tài liệu cóliên quan trong quá trình thực hiện bài tiểu luận này

Do điều kiện về thời gian, kiến thức còn hạn chế nên bài tiểu luận của chúng emkhông tránh khỏi còn nhiều thiếu sót Chúng em rất mong nhận được ý kiến đónggóp từ quý thầy cô để bài tiểu luận của chúng em hoàn thiện hơn

Chúng em xin chân thành cảm ơn!

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ CHI CROTALARIA L 2

I Vị trí phân loại, phân bố: 2

II Đặc điểm hình thái: 2

III Công dụng: 3

IV Tình hình nghiên cứu: 3

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 4

I Đối tượng nghiên cứu: 4

II Phương pháp nghiên cứu: 4

1 Nghiên cứu về thực vật: 4

2 Nghiên cứu về thành phần hóa học: 4

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 14

I Đặc điểm hình thái ngoài của Lục lạc ba lá tròn: 14

II Đặc điểm vi phẫu của cây Lục lạc ba lá tròn: 16

III Thành phần hóa học của cây Lục lạc ba lá tròn: 18

KẾT LUẬN 20

KIẾN NGHỊ 20

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 :Mẫu vật và dụng cụ 5

Bảng 2 : Mẫu vật, dụng cụ và hóa chất 6

Bảng 3 : Các bước tẩy - nhuộm tiêu bản 8

Bảng 4 : Kết quả phản ứng hóa học 18

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 :Một số loài thuộc chi Crolataria 2

Hình 2 : Nhãn tiêu bản khô 6

Hình 3 : Mẫu vật, dụng cụ, hoá chất làm vi phẫu 7

Hình 4 : Cắt mẫu tiêu bản vi phẫu 8

Hình 5 : Tiêu bản vi phẫu thân và lá Lục lạc ba lá tròn 9

Hình 6 : Bột dược liệu 10

Hình 7 : Dịch ngâm và dịch lọc 10

Hình 8 : Thu hồi dung môi 11

Hình 9 : Kết quả dịch chiết các phân đoạn 12

Hình 10 : Phương trình phản ứng Liebermann-Burchard 13

Hình 11 : Phản ứng giữa polyphenol và TT Folin-Ciocalteu 14

Hình 12 : Lục lạc ba lá tròn mọc ngoài tự nhiên 15

Hình 13 : Tiêu bản khô cây Lục lạc ba lá tròn 15

Hình 14 : Vi phẫu lá Lục lạc trên kính hiển vi 16

Hình 15 : Vi phẫu thân cây Lục lạc 17

Hình 16 : Kết quả sắc kí lớp mỏng 20

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là một nước n•m trong v‚ng khí hậu nhiệt đới gió m‚a nên có hệ thựcvật đa dạng và phong phú Theo ước tính, nước ta có khoảng gần 13.000 loài thựcvật bậc cao trong đó có khoảng hơn 4.000 loài được sử dụng làm thuốc Nhân dân ta

đã biết tận dụng những nguồn nguyên liệu đó để phòng và chữa bệnh, nâng cao sứckhoẻ con người

Lục lạc ba lá tròn thuộc chi Crotalaria, là một loài cây mọc ở nhiều nơi trên đấtnước ta và đã quen thuộc với người dân Cây chủ yếu làm phân xanh, thân cành làmcủi Hạt Lục lạc được d‚ng để chữa chóng mặt do sốt, suy nhược thần kinh, di tinh,xuất tinh sớm, bạch đới, đái dầm, chứng đa niệu Rễ d‚ng để trị bệnh hạch bạchhuyết, viêm vú, lỵ, trẻ em hấp thu kém và suy dinh dưỡng…[…] Tuy nhiên, cho tớithời điểm hiện tại có rất ít công trình nghiên cứu về cây Lục lạc nói riêng và các câythuộc chi Crotalaria nói chung

Gần đây nhờ sự tạo điều kiện của Bộ môn Dược liệu - Dược cổ truyền, chúng

em đã có cơ hội được đi thực địa tại khu vực xã Ph‚ Long, huyện Cát Hải, thành phốHải Phòng Chúng em nhận ra r•ng cây Lục lạc phát triển nhiều ở khu vực này Vớimong muốn góp phần vào bảo tồn đa dạng sinh học, đóng góp thêm cơ sở dữ liệutrong việc đánh giá và sử dụng nguồn lợi của cây Lục lạc ba lá tròn; chúng em tiếnhành làm tiểu luận: “Tổng quan tài liệu về đặc điểm và thành phần hóa học của câyLục lạc ba lá tròn” với các mục tiêu sau:

1 Mô tả đặc điểm hình thái của cây Lục lạc ba lá tròn

2 Xác định đặc điểm vi học của cây Lục lạc ba lá tròn

3 Khảo sát thành phần hóa học của cây Lục lạc ba lá tròn

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ CHI CROTALARIA L.

I Vị trí phân loại, phân bố:

Trong hệ thống phân loại thực vật, vị trí phân loại của chi Crotalaria L là: Giới thực vật: Plantae

Ngành: Magnoliophyta (Ngành Ngọc Lan)

Lớp: Magnoliopsida (Lớp Ngọc Lan) Bộ: Fabales (Bộ Đậu)

Họ: Fabaceae (Họ Đậu) Chi: Crotalaria (Chi Lục Lạc) Chi Crotalaria được cho là có nguồn gốc từ châu Phi với trung tâm đa dạng nhất

là ở v‚ng nhiệt đới của châu Phi và Madagascar Các đại diện của Chi chủ yếu phân

bố ở các khu vực có khí hậu nhiệt đới, cận nhiệt đới của Nam bán cầu và châu Phi

Hình 1:Một số loài thuộc chi Crolataria

II Đặc điểm hình thái:

Cây thân bụi, thân thảo sống hàng năm hoặc nhiều năm Lá có thể là lá đơn(thường là những cây sống ở v‚ng khô hạn) hoặc lá kép (thường là những cây sống

ở v‚ng ẩm ướt); dạng lá kép thường có 1-3 lá chét, 1 số có nhiều lá chét Hoa cánh

2

CC l il i

cờ, các cánh bên và các cánh thìa; thường có màu vàng, màu trắng đến hơi tía hoặchơi xanh; thích nghi với thụ phấn nhờ ong Trái phồng.

IV Tình hình nghiên cứu:

Người đầu tiên nghiên cứu về hình thái và phân loại của chi Crotalaria làCarolus Linnaeus; năm 1753, ông đã mô tả và đặt tên cho 13 loài của chi Crotalaria;sau đó có rất nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu tới Chi này; các nghiên cứu chủ yếuđược thực hiện ở châu Phi, châu Mỹ và châu Á

Được UNESCO công nhận là Khu dự trữ sinh quyển thế giới vào năm 2004,quần đảo Cát Bà, Việt Nam, có hệ sinh thái nhiệt đới cận chí tuyến điển hình, thíchhợp cho nhiều loài trong chi Crotalaria sinh trưởng và phát triển Tuy nhiên, cho đếnnay vẫn chưa có nhiều nghiên cứu cụ thể về các loài trong Chi tại đây Vì vậy rất cần

có thêm các nghiên cứu để góp phần định hướng cho việc khai thác và sử dụng cácloài trong chi Crotalaria tại khu vực quần đảo Cát Bà

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

I Đối tượng nghiên cứu:

Thân, lá, hoa và quả cây Lục lạc ba lá tròn được thu hái ở:

- Tọa độ: 20,79°N - 106,55°E

- Địa điểm: xã Ph‚ Long, huyện Cát Hải, thành phố Hải Phòng

- Thời gian 15h45 ngày 11/09/2023

II Phương pháp nghiên cứu:

1 Nghiên cứu về thực vật:

- Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái thực vật của cây tại thực địa [ ]

- Giám định tên khoa học của cây trên cơ sở phân tích đặc điểm hình thái, đặcđiểm bộ phận sinh sản, so sánh với các tài liệu phân loại thực vật [ ] c‚ng với sựgiúp đỡ của các chuyên gia về phân loại thực vật

- Nghiên cứu đặc điểm vi học: cắt và làm tiêu bản vi phẫu, quan sát các đặcđiểm, mô tả và chụp ảnh tiêu bản

2 Nghiên cứu về thành phần hóa học:

2.1 Phương pháp làm tiêu bản khô:

2.1.1 Mục đích của việc làm tiêu bản khô:

- Quản lý nguồn tài nguyên thực vật của một địa phương

- Lưu trữ mẫu tài nguyên thực vật phục vụ so mẫu trong công tác nghiên cứuthực vật và dược liệu, các mục đích kinh tế khác

- Xác định tên khoa học của cây: Cây cỏ chỉ ra hoa kết quả theo m‚a và nhiềuloài chỉ phân bố ở một địa phương nhất định trong một nước hoặc khu vực nào đótrên trái đất Tiêu bản thực vật giúp ta trong một thời điểm và một địa điểm nhấtđịnh có được các mẫu cây cần thiết cho việc nghiên cứu hình thái và giám định têncây

2.1.2 Quy trình tiến hành:

Bước 1: Chuẩn bị mẫu và dụng cụ

4

Bảng 1:Mẫu vật và dụng cụMẫu vật Cây Lục lạc ba lá tròn

Dụng cụ

Bìa cứngGiấy trắngBút chìKim-chỉNhãn tiêu bảnGiấy bản, báo cũKhung épKéo

Bước 2: Ép và sấy mẫu tiêu bản

Ép và sấy mẫu tiêu bản là hai quá trình không tách rời nhau trong khi sấy cần épchặt mẫu để lá khỏi nhăn nheo để mẫu cây làm đúng vị trí định dán mẫu

Sắp xếp mẫu trên giấy trắng và dưới một lớp giấy thấm để cố định trước khi sấy.Khi sắp xếp mẫu cần tuân thủ một số nguyên tắc:

+ Trong số các lá ít nhất có một lá được lật ngược lên

+ Không để các bộ phận của cây đè lên nhau

+ Cấn sắp xếp đều trên diện tích cho phép (không tập trung vào phần giữa) + Cây dài có thể sắp xếp theo hình chữ V, N hay hình khác

+ Nếu cần bỏ lá chú ý giữ cuống lá (để thấy được sắp xếp lá trên cây)

+ Những phần nhỏ (lá, phao) bị rụng cần đặt bên cạnh mẫu

+ Các bộ phận sử dụng làm thuốc có thể bảo quản b•ng cách phơi sấy khô hoặcngâm trong các dịch bảo quản

Sau khi xếp mẫu lên tờ báo gặp nửa tờ báo còn lại lên mẫu Đặt các mẫu lên cặp

ép (không dày quá 40cm) buộc cặp ép lại sấy ở 35 – 40 C trong khoảng 8 – 12h,⁰

trong quá trình sấy cần thường xuyên thông thoáng Lấy cặp ép ra buộc lại, thay báo

và sấy đến khô

Bước 3: Khâu hoặc dán mẫu cây lên tiêu bản

Chọn bìa trắng có kích thước ph‚ hợp với tiêu bản để làm bìa khâu Đặt mẫu đã

ép và sấy khô lên bìa và khâu vào bìa, dán giấy lên lớp trên các nốt khâu ở mặt trái Bước 4: Nhãn tiêu bản

Khi mẫu đã khâu, dán nhãn vào góc phải phía dưới của tiêu bản Kích thướcnhãn 8×13cm Nhãn gồm các thông tin: Số hiệu tiêu bản, tên khoa học, họ, tên ViệtNam, thời gian thu mẫu, người định danh

Hình 2: Nhãn tiêu bản khô2.2 Phương pháp làm tiêu bản vi phẫu:

2.2.1 Chuẩn bị mẫu vật, dụng cụ và hóa chất:

Bảng 2: Mẫu vật, dụng cụ và hóa chấtMẫu vật Thân, lá cây Lục lạc ba lá tròn

Dụng cụ

Kính hiển vi Kính lúp Đĩa petri Mặt kính đồng hồ Kim mũi mác Phiến kính

Lá kính Pipet Dao lam Chổi lông Khoai lang hoặc cà rốt

6

sau khi cô cắn Lấy khối lượng sau khi cô cắn trừ khối lượng cốc ban đầu để biếtđược khối lượng cắn thu được sau khi thu hồi dung môi.

Hình 8: Thu hồi dung môi

- Lấy 1 lượng nhỏ cắn toàn phần cho vào ống nghiệm làm sắc ký lớp mỏng(Hình 9.1)

- Hòa cắn với nước nóng (5-10ml) tại thành nhũ dịch Lắc phân đoạn với -nhexan (10ml*2) Thu được dịch chiết phân đoạn -hexan và dịch chiết phân đoạnnnước

- Dịch chiết phân đoạn -hexan chia vào 4 ống nghiệm n (Hình 9.2), cô cách thủyđến cắn để định tính sterol, chất béo, carotenoid và sắc ký lớp mỏng

- Phân đoạn nước tiếp tục lắc với EtOAc Thu được phân đoạn nước và phânđoạn EtOAc Phân đoạn EtOAc chia vào 2 ống nghiệm (Hình 9.3), cô cách thủy đếncắn để định tính polyphenol và sắc ký lớp mỏng Phân đoạn nước d‚ng trực tiếp để.định tính tanin và sắc ký lớp mỏng (Hình 9.4)

- Riêng ống sắc ký lớp mỏng không cần cô cắn hoàn toàn

- Cơ chế phản ứng: Nhân sterol bị oxy hoá trong môi trường H SO đặc, tạo ion₂ ₄carbodium 3,5-dien Sản phẩm tạo ra tác dụng với anhydrid acetic tạo cationpentaenylic có màu đỏ (λ max 620nm) và nhanh chóng chuyển thành cholestahexane sulfonic acid có màu xanh λ max 410nm) (

12

Hình 10: Phương trình phản ứng Liebermann-Burchard

2.3.2.2 Định tính chất béo:

Hòa tan một phần cắn -hexan vào 2ml nước nóng Nhỏ 1 giọt dịch chiết trên lên nmiếng giấy lọc, hơ nóng cho bay hết hơi dung môi Nếu thấy để lại vết mờ trên giấylọc, mẫu có chứa chất béo

2.3.2.3 Định tính carotenoid:

Cho vào ống nghiệm nhỏ một ít cắn khô Nhỏ 1,5ml dung dịch Diethylether vào ốngnghiệm, lắc tan cắn Thêm 0,5ml H SO đặc₂ ₄ Phản ứng dương tính khi xuất hiệnmàu xanh lá

- Cơ chế phản ứng: Carotenoid chứa hệ thống nối đôi liên hợp khiến hợp chất khôngbền, dễ bị oxy hoá bởi các tác nhân hoá học như acid

2.3.2.4 Định tính polyphenol:

Phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteu: Cắn phân đoạn EtOAc được hòa tan trongnước, lọc qua bông Lấy 2ml dịch lọc phân đoạn EtOAc, thêm vào 1ml thuốc thửFolin-Ciocalteu và 2ml Na CO₂ ₃ 7.5%, để yên trong tối 1h Nếu có chứa polyphenol,dung dịch sẽ từ màu vàng chuyển sang màu xanh

- Cơ chế phản ứng: Thuốc thử Folin-Ciocalteu chứa chất oxi hóa là acid vonframic trong quá trình khử các nhóm hydroxyl phenol dễ bị oxi hóa, chất oxi hóanày sinh ra màu xanh Phản ứng này do sự hình thành màu xanh của vonfram và molypdren

photphos-Hình 11: Phản ứng giữa polyphenol và TT Folin-Ciocalteu

2.3.2.5 Định tính tanin:

Phân đoạn nước được lọc và chia vào các ống nghiệm để làm các phản ứng sau:

- Ống 1: 1ml dịch lọc, thêm 1ml giọt dung dịch FeCl ₃ 5%, sẽ xuất hiện màuxanh đen

- Ống 2: 1ml dịch lọc, thêm 1ml dung dịch gelatin 1%, sẽ có tủa bông trắng.2.3.3 Định tính b•ng sắc ký lớp mỏng:

Bước 1: Chuẩn bị mẫu:

- Cắn các phân đoạn được d‚ng để định tính b•ng sắc ký lớp mỏng: toàn phần,n-hexan, EtOAc và nước

- Pha dung dịch mẫu thử nồng độ 1mg/ml để chấm sắc ký

Bước 2: Tiến hành sắc ký lớp mỏng:

- Pha tĩnh: bản mỏng silicagel pha thuận

- Pha động: hệ dung môi -hexan:nước (2:1) n

Bước 3: Quan sát:

- Quan sát ở ánh sáng thường, UV 254nm, 366nm sau khi hiện màu b•ng H SO₂ ₄10% trong cồn

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

I Đặc điểm hình thái ngoài của Lục lạc ba lá tròn:

- Cây bụi lâu năm cao khoảng 1m

- Thân cành hơi có lông rạp xuống

- Lá có ba lá chét; lá chét hình trái xoan ngược tròn ở chóp (Hình 3.1a); các láchét bên nhỏ hơn, mặt trên nhẵn, mặt dưới có lông ngắn (Hình 3.2b)

14

- Hoa màu vàng xếp thành ch‚m gồm những vòng giả, có lông ngắn (Hình3.2c)

- Quả đậu hình dải, lúc non có lông, về sau nhẵn (Hình 3.2d)

- Hạt nhiều, màu hạt dẻ nhạt hoặc vàng da cam, hình thận

Hình 12: Lục lạc ba lá tròn mọc ngoài tự nhiên

Hình 13: Tiêu bản khô cây Lục lạc ba lá tròn

Qua quan sát các đặc điểm của loài nghiên cứu, tham khảo các tài liệu về thựcvật [ ] và dưới sự giúp đỡ của TS Ngô Thị Quỳnh Mai, mẫu nghiên cứu đã được

định danh tên khoa học là Crotalaria pallida Aiton, họ Đậu (Fabaceae), tên tiếngViệt là Lục lạc ba lá tròn.

II Đặc điểm vi phẫu của cây Lục lạc ba lá tròn:

1 Vi phẫu lá

Hình 14: Vi phẫu lá Lục lạc trên kính hiển vi

Đặc điểm vi phẫu gân lá:

Mặt cắt ngang gân lá có mặt trên hơi lõm, mặt dưới lồi Nhìn dưới kính hiển vi

từ trên xuống dưới thấy: Biểu bì trên (1) và biểu bì dưới (7) cấu tạo bởi một lớp tếbào mỏng, hình chữ nhật nối tiếp với biểu bì ở phần phiến lá Mô dày (2) cấu tạo bởi1-2 lớp tế bào ở sát dưới lớp biểu bì trên và dưới của gân lá Mô mềm ruột (3) phíatrên và mô mềm vỏ (6) phía dưới bó libe-gỗ (4)(5), có nhiều tế bào hình đa giáchoặc hình tròn, các góc có khoảng gian bào nhỏ

Bó Libe-Gỗ làm thành hình cung ở chính giữa gân lá, mặt lõm quay về phíatrên, gỗ (5) bắt màu xanh ở giữa, libe (4) bắt màu đỏ bao bọc xung quanh Lông chechở (8) đa bào, dài và lông tiết (9) n•m rải rác ở biểu bì dưới (7) Lỗ khí (10) n•mrải rác ở biểu bì dưới phiến lá

Đặc điểm vi phẫu phiến lá:

Mặt cắt ngang phiến lá nhìn dưới kính hiển vi từ trên xuống dưới thấy: Biểu bìtrên (1) cấu tạo bởi một lớp tế bào mỏng có màng cutin, không có lỗ khí Hạ bì trên(2) cấu tạo bởi 1-2 lớp tế bào n•m ngay sát biểu bì, chứa nước và màng hơi dày Môgiậu (3) gồm 2 lớp tế bào hình trụ xếp sát nhau

16

Hình vẽ

Phiến láGân lá

Hình vẽ

Hạ bì dưới (4) lại mỏng hơn hạ bì trên và biểu bì dưới (5) có cấu tạo tương tựbiểu bì trên nhưng mang các phòng ẩn lỗ khí (Hình ảnh lỗ khí n•m trên phiến lá ởhình gân lá trên) N•m rải rác trong thịt lá là các tinh thể calci oxalat (6) hình cầugai

2 Vi phẫu thân:

Hình 15: Vi phẫu thân cây Lục lạcMặt cắt ngang thân có tiết diện tròn Nhìn dưới kính hiển vi từ ngoài vào trongthấy: Lông che chở (1) đa bào n•m trên lớp bần (2) cấu tạo bởi vài hàng hình chữnhật, xếp đều đặn thành các vòng, màng tế bào hóa bần bắt màu xanh Mô dày (3)cấu tạo bởi tế bào sống, kéo dài, có màng dày b•ng cellulose, bắt màu đỏ đậm Mômềm vỏ (4) gồm nhiều tế bào hình đa giác, xếp không đều nhau, các góc có khoảnggian bào