--- ∞0∞--- TRẦN KIẾN TƯỜNG KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM CỦA CAO CHIẾT NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TP
TỔNG QUAN 1 Tổng quan về nấm Linh chi (Ganoderma lucidum)
Tổng quan về một số vi khuẩn gây bệnh thử nghiệm
Loài: Escherichia coli (Buchanan và Gibbons, 1994)
E coli là loài thuộc chi Escherichia, là trực khuẩn Gram âm di động thuộc loại kỵ khí tùy nghi Nhiệt độ thích hợp cho tăng trưởng là 37 o C, tuy nhiên có thể tăng trưởng từ 10 - 46oC Mọc dễ dàng trong môi trường Mac Conkey, EMB…
E coli là một loại vi khuẩn hay được tìm thấy trong ruột của người và động vật máu nóng Vi khuẩn E coli có thể gây ra các bệnh như: nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm trùng máu, viêm màng não cấp và bệnh tiêu chảy (James P Nataro và cộng sự, 1998)
Tình hình gây bệnh của các chủng E coli đang ngày càng nghiêm trọng Theo
Tổ chức y tế thế giới (WHO) đã thống kê có khoảng 525.000 trẻ em mỗi năm tử vong do bệnh tiêu chảy gây ra bởi E coli và bệnh tiêu chảy là nguyên nhân thứ hai gây tử vong ở trẻ em dưới 5 tuổi
Theo Mark Melzer và cộng sự (2007) cho biết ngoài gây tử vong cao, vi khuẩn E.coli càng ngày khó điều trị bằng kháng sinh do đã xuất hiện nhiều chủng E coli kháng thuốc như các chủng E coli sinh ESBL đều đề kháng với cephalosporin Kháng ciprofloxacin, trimethoprim, gentamicin và amikacin lần lượt là 91,3; 84,8%; 30,4% và 4,3% Tỷ lệ bệnh nhân tử vong cao đáng kể do vi khuẩn gây ra bởi E coli sản sinh ESBL là 60,8%, so với E coli không sản xuất ESBL
Theo Betina Hebbelstrup Jensen và cộng sự (2014) cho biết vào năm 2011 tại Đức bệnh viêm đại tràng xuất huyết do một chủng E coli gây ra đã khiến 54 người chết Theo Tổ chức y tế thế giới (WHO) cho biết tình trạng kháng thuốc kháng sinh fluoroquinolone ở E coli, được sử dụng để điều trị nhiễm trùng đường tiết niệu đang phổ biến, tỷ lệ E coli kháng cephalosporin thế hệ thứ ba là 36,0%
Loài: Pseudomonas aeruginosa (Buchanan và Gibbons, 1994)
P aeruginosa là trực khuẩn mủ xanh, thẳng hoặc hơi cong có đơn mao ở một đầu, nhờ đó di động kích thước 0,6 × 2 μm, hiếu khí tuyệt đối, mọc dễ trên hầu hết các môi trường thông dụng, có thể phát ra mùi thơm giống mùi nho (grapelike odor) Mọc tốt ở nhiệt độ 37 o C đến 42 o C và có thể mọc ở nhiệt độ 5- 42 o C, không lên men glucose Thử nghiệm oxidase dương tính Gây tiêu huyết β trên thạchmáu, P aeruginosa có thể tiết ra 4 loại sắc tố: pyoverdin, pyocyanin, pyomelanin (Nguyễn Thanh Bảo, 2008)
Trực khuẩn mủ xanh tiết ra nhiều enzyme và độc tố khác nhau Vi khuẩn này gây bệnh khi: xạ trị, hóa trị, sức đề kháng của cơ thể bệnh nhân suy giảm, niêm mạc da và mô của bệnh nhân bị tổn thương, sử dụng các dụng cụ y khoa, lạm dụng kháng sinh, tiêu diệt hết vi khuẩn thường trú ở ruột… chúng gây nhiễm trùng da, mắt như viêm nang lông, viêm da chảy nước ở các vùng kẽ hoặc viêm tai ngoài, viêm loét giác mạc,… ngoài ra P aeruginosa là căn nguyên gây nhiễm trùng vết bỏng, vết thương, xương khớp, huyết, dịch não tủy, tiết niệu và hô hấp (Nguyễn Thanh Bảo, 2008)
Chi: Salmonella Loài: Salmonella typhimurium (Buchanan và Gibbons, 1994)
S typhimurium là trực khuẩn có lông xung quang thân, Gram âm, có khả năng di động và không sinh nha bào Kích thước khoảng 0,3-0,8 × 2–3 μm S typhimurium là vi khuẩn hiếu khí tùy vào điều kiện môi trường, phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường Trong môi trường thích hợp sau 24 giờ khuẩn lạc có kích thước trung bình 2 - 4 mm
S typhimurium gây bệnh cho người, đặt biệt là gây bệnh thương hàn Bệnh thương hàn có thể gây biến chứng chủ yếu là xuất huyết tiêu hóa và thủng ruột Một số biến chứng ít gặp hơn như viêm màng não, viêm tủy xương, viêm khớp, viêm thận (Nguyễn Thanh Bảo, 2008).
Tổng quan về vi nấm gây bệnh
Bộ: Saccharomycetales Họ: Saccharomycetaceae Chi: Candida (Theo Maheshwari, 2010)
Hình 1.7 Hình ảnh hiển vi của nấm Candida albicans
(https://medlatec.vn/tin-tuc/nam-candida nguyen-nhan-chu-yeu-gay-viem-am-dao- s159-n18001)
Nấm men Candida có hình tròn hay hình bầu dục, sinh sản bằng các nảy chồi hay cho sợi tơ nấm giả và bào tử bao dầy
C albicans là thành viên của hệ vi nấm ở da và niêm mạc người Nó là nhân tố gây nhiễm khi có sự biến đổi của môi trường và cơ thể cho phép nó sinh trưởng ngoài tầm kiểm soát C albicanns thường sống không gây hại ở màng nhầy của người và động vật máu nóng (miệng, âm đạo, ruột,…) và không thấy ở trên da với dạng đơn bào Ở một số điều kiện thuận lợi, nấm này phân thành các dạng sợi để xâm nhập vào màng nhầy, sinh trưởng không kiểm soát gây ra bệnh khá nghiệm trọng
C albicans là tác nhân gây ra một số bệnh ở người ở các vị trí như da, móng, niêm mạc Vi nấm này có thể xâm nhập vào sâu các cơ quan khác gây nhiễm máu và bệnh nấm nội tạng rất nguy hiểm Khả năng tồn tại ở hai dạng hình thái là tế bào và dạng sợi giúp loài này có khả năng nhanh chóng chuyển đổi hình thái trong điều kiện thích hợp và khó bị tiêu diệt (Trần Linh Thước, 2006; Maheshwari, 2010)
Hình 1.8 Hình ảnh hiển vi của nấm Trichophyton rubrum (https://icarepharma.com.vn/nhiem-nam-kerion-bien-chung-nguy-hiem-cua-benh-nam- da-dau/)
Hình 1.9 Hình ảnh hiển vi của nấm Trichophyton mentagrophytes
(https://docosan.com/blog/da-lieu/nam-toc/)
Trichophyton spp Có bào tử đính lớn, khi trưởng thành có dạng phẳng và thường có từ 1 đến 12 vách ngăn mỏng Chúng được tạo ra thành các chùm nhỏ hoặc các hạt đơn lẻ, hình trụ hình thùy, hình thoi, Kích thước duy trì trong khoảng chiều dài 6 – 88 μm, chiều ngang 3 – 13 μm Bào tử đính lớn thường ít hơn các bào tử đính nhỏ, chúng có thể là dạng hình quả lê, hình cầu, hoặc hình chùm, không cuống và được tạo ra đơn lẻ dọc theo 2 bên sợi nấm hoặc thành cụm giống như chùm nho
T rubrum có thể gây ra bệnh về da như nấm móng, biểu hiện dưới dạng tróc vẩy khô, mụn nước hoặc viêm Bệnh gây ngứa ngáy, khó chịu Các bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS dễ mắc các bệnh nhiễm trùng cơ hội Khi hệ miễn dịch của cơ thể suy yếu bệnh do nấm T rubrum gây ra chiếm 35,7 %
Hầu hết các trường hợp nhiễm trùng là do T rubrum gây nên Khi bị nấm xuất hiện nhiều ở bàn tay, lòng bàn tay và phía trong ngón tay là nơi thưởng bị ảnh hưởng nhất, dấu hiệu thường thấy nhất là sừng lan tỏa diện rộng ở lòng bàn tay sau đó ra mu tay, rồi đến các ngón tay
Biểu hiện tổn thương do nấm Trichophyton mentagrophytes thường khác nhau vết thương đường kính từ 1 - 2 cm đến hàng chục cm, da đầu bị bong vảy, tóc bị rụn cụt sát mặt da, chân tóc còn lại bị vẩy trắng vụn bao quanh giống như tóc bị nhúng trong bột mì (Weitzman, 1995)
Hình 1.10 Hình ảnh hiển vi của nấm Microsporum canis
(https://phil.cdc.gov/details.aspx?pid472)
Microsporum canis là một loại nấm da phổ biến ở chó và mèo, loại nấm này thường sống kí sinh trên lông ở vùng đầu, chân, đuôi và một vài nơi khác của cơ thể Trong một số trường hợp nghiêm trọng thì vùng da bị ảnh hưởng sẽ trở nên đỏ và chảy mủ Sợi nấm trưởng thành nhanh chóng, các khuẩn lạc có màu trắng tới vàng sẫm, màu vàng tươi hoặc màu vàng cam ở mặt sau
Microsporum canis có đặc điểm là bào tử đính lớn có những vách ngăn thô ráp do có nhiều điểm nhỏ, gai nhỏ, hoặc nhiều mụn cơm Ban đầu, bào tử đính lớn được mô tả bởi Chester Emmons (1934), chúng có hình dạng như hình con quay hoặc hình thoi Bào tử đính lớn có thể có vách mỏng, hơi dày cho đến dày, có từ 1 đến15 vách ngăn và kích thước nằm trong khoảng chiều dài 6 − 160 μm, chiều rộng 6 − 25 μm Bào tử đính nhỏ không có cuống hoặc có cuống và có dạng hình chùm, thường được bố trí đơn lẻ dọc theo sợi nấm hoặc có dạng chùm (Weitzman I và Summerbell R.C., 1995)
Bệnh do Microsporum canis gây ra:
+ Microsporum canis là nguyên nhân thường gặp gây nấm ngoài da ở người, đặc biệt là trẻ em Xâm nhập vào da, tóc, móng tay
+ Mèo và chó là nguồn lâu nhiễm chính, nó cũng có thể được truyền sang người thông qua tiếp xúc trực tiếp và gián tiếp với động vật và vật truyền bệnh như lược, bàn chãi, mũ, đồ nội thất
+ Các yếu tố nguy cơ lớn nhất đối với nhiễm trùng là liên hệ với các tế bào bị hư hại trên da, tóc và móng tay Microsporum canis có thể lây nhiễm tất cả các loài động vật có vú.
Khái quát phương pháp thử hoạt tính kháng nấm
Nguyên tắc: Chất thử từ đĩa giấy hay giếng đục trong thạch sẽ khuyết tán vado môi trường thạch được nuôi cấy vi nấm thử nghiệm Mức tác động của chất thử được đánh giá dựa vào đường kính vòng ức chế Phương pháp này cho kết quả định tính và bán định lượng hoạt tính của chất thử
Tùy vào từng loại vi nấm thử nghiệm ta có thể chọn môi trường phù hợp Đối với các vi nấm khó mọc thì các tiêu chuẩn về môi trường phải được biến đổi cho phù hợp, bổ sung các hợp chất cần thiết đối với mỗi loại vi nấm
4.2 Phương pháp pha loãng liên tiếp
Nguyên tắc: Dựa trên sự tương quan giữa nồng độ pha loàng của chất thử đối với sự tăng trưởng của vi nấm trong mỗi nồng độ chất thử khác nhau mà ta xác định được nồng độ ức chế tối thiểu của chất thử có khả năng ngăn chặn sử tăng trưởng của vi nấm thử nghiệm
Chất thử được pha loãng thành các nồng độ từ cao đến thấp theo cấp số nhân Tác động kháng các loại vi nấm sẽ được xác định dựa vào nồng độ ức chế tối thiểu của chất thử (Minimum Inhibitory Concetration – MIC) Đây là nồng độ thấp nhất trong dãy nồng độ ức chế được sự phát triển của vi nấm Phương pháp này có ý nghĩa là định lượng MIC càng thấp thì chất thử tác động càng mạnh
Các tiêu chuẩn về phương pháp pha loãng hiện đang được sử dụng:
+ Phương pháp pha loãng xác định hoạt tính kháng nấm men: CLSI, 2018, M27 – A3 + Phương pháp pha loãng xác định hoạt tính kháng nấm sợi: CLSI, 2018, M38 – A2 + Phương pháp pha loãng xác định hoạt tính kháng khuẩn: CLSI, 2009, M7 – A8.
Tình hình nghiên cứu
Ở Việt Nam các tác giả nghiên cứu về họ nấm Ganodermataceae Donk, phần lớn tập trung nghiên cứu ở các miền Bắc như tác giả Trịnh Tam Kiệt (1980, 1981, 1996,
2011, 2012…), Phan Huy Dục và cộng sự (2004), Đảm Nhận (1996), Mai Văn Phô và Nguyễn Nghĩa Thìn (2003), các công trình này nghiên cứu về tính đa dạng của họ nấm
Ganodermataceae ở khu vực phía Bắc Ở Miền Trung có tác giả Ngô Anh (2003, 2007), đã nghiên cứu về thành phần loài của họ nấm Ganodermataceae ở tình Thừa Thiên Huế Khu vực miền núi phía Tây Nguyên có tác giả Lê Bá Dũng đã mô tả chi tiết 13 loài gồm
2 chi Ganoderma và Amauroderma ở Nam Tây Nguyên Ở miền Nam có tác giả Lê Xuân Thám (1996, 2005, 2009, 2011) đã nghiên cứu thành phần loài của họ nấm
Ganodermataceae ở Vườn Quốc gia Cát Tiên Nguyễn Phương Đại Nguyên (2013) đã nghiên cứu về chi nấm Ganoderma trong các công trình nghiên cứu về nấm lớn của ông
Trên thế giới việc nghiên cứu về nấm Linh chi đã được thực hiện bởi nhiều tác giả: Iarevskii (1913), Khincova S và cộng sự (1986) các tác giả này chỉ tập trung nghiên cứu những đặc trưng cơ bản của họ nấm Ganodermataceae Patouillard (1928) và Steyaert (1972) đã nghiên cứu rất rộng về giới Nấm trong đó có nấm Linh chi Tuy nhiên, các tác giả chỉ xây dựng khóa phân loại cho các bộ trong giới Nấm mà chưa đề cập đến việc các hợp chất và hoạt tính sinh học có trong nấm Ryvarden L, Johansen, I (1991, 2000) đã nghiên cứu khá chi tiết về những đặc trưng của họ nấm Ganodermataceae
Năm 2016, xác định thành phần hóa học của hệ sợi nấm của 5 loài nấm Linh chi có nguồn gốc từ Việt Nam và 3 loài nấm Linh chi từ Châu Âu và vùng Siberia do Tsivileva và cộng sự thực hiện.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 Vật liệu
Dụng cụ, thiết bị, môi trường và hóa chất
Mẫu nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) được thu nhận từ Lâm Đồng
1.2 Thiết bị, dụng cụ, môi trường và hóa chất
⮚ Cân kĩ thuật và cân phân tích
Quy trình nghiên cứu
Mẫu nấm được thu thập tại Đà Lạt và được bảo quản tại phòng Sinh học phân tử, khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh
3.2 Thu cao chiết mẫu nấm
Quy trình thu cao chiết mẫu nấm được thực hiện theo Cheng và cộng sự, 2013
Xác định hợp chất Khảo sát hoạt tính Định tính Định lượng
Chống oxi hóa tế bào
- 50g quả thể khô được đem đi xay bằng máy xay
- 50g mẫu sau khi xay được chiết xuất bằng phương pháp nước nóng 100°C trong 8h với tỉ lệ 5 : 200, w/v
Hình 2.1 Mẫu được bổ sung nước và chiết trong 8h ở nhiệt độ 100°C
- Sau 8h mẫu được lọc thu hồi bằng vải mỏng Sau đó lượng dịch chiết thu được sẽ đem đi lọc bằng giấy lọc và máy hút chân không
Hình 2.2 Cao chiết sau khi lọc bằng vải mỏng
Hình 2.3 Dịch chiết được lọc bằng máy hút chân không
- Sau khi dịch chiết đã được lọc bằng máy hút chân không sẽ được đem đi cô cạn đến khi đạt được cao thô
- Cao chiết được bảo quản và thực hiện các thí nghiệm tiếp theo
3.3 Xác định tổng hàm lượng polysachride, polyphenol và định lượng adenosine
Tổng hàm lượng polysaccharide của dịch chiết nước nóng được xác định bằng phương pháp axit phenol-sulfuric với D -glucose theo Nielsen và cộng sự,
-1 ml phenol 5% (w / v) được thêm vào 1 ml dung dịch mẫu cao chiết, lắc nhẹ
- Tiếp theo là 5 ml H 2 SO 4 đậm đặc được thêm vào ống Để yên trong vòng
- Độ hấp thụ được đo bằng máy quang phổ (Shimadzu series 1601 UV / Vis) ở bước sóng 483 nm
- Đọc kết quả và xây dựng đường chuẩn tổng hàm lượng polysachride
Tổng hàm lượng polyphenol được xác định dựa vào đường chuẩn acid galic
- Xây dựng đường chuẩn acid galic: 0,1 ml mẫu + 0,5 ml Folin 10% + 0,4 ml
Na2CO3 10% + 1,5 ml nước ủ 2h, đo OD ở bước sóng 760 nm
- Mẫu cao dược liệu: 0,1 ml mẫu + 0,5 ml Folin 10% + 0,4 Na2CO3 10% + 1,5 ml nước, ủ 2 giờ trong nhiệt độ phòng, đo OD ở bước sóng 765 nm
- Đối chứng âm: 0,1ml dung môi chiết (nước, etanol…) + 0,5 ml Folin 10% + 0,4 ml Na2CO3 10% + 1,5 ml nước, ủ 2 giờ trong nhiệt độ phòng, đo OD ở bước sóng
765 nm Định lượng và xác nhận adenosine cũng được thực hiện trong sắc ký lỏng Perkin Elmer (HPLC) theo Yang và cộng sự 2006
- Pha tĩnh là các hạt silicagel
- Pha động là metanol: 10 mM dung dịch đệm kali photphat (15: 85), pH 5,0
- Tốc độ dòng là 1,5 mL / phút
- Cao chiết được cho vào bình hồi lưu sau đó thêm 50ml methanol 90% Cân Tiến hành chiết hồi lưu trong 60 phút
- Để nguội sau đó thêm methanol 90% đến trọng lượng ban đầu Lắc đều và lọc qua màng 0,45àm Sau đú đem phõn tớch sắc kớ
- Adenosine được xác định nồng độ bằng cách xây dựng đường chuẩn thu được từ các chất chuẩn thương mại của các hợp chất này (Sigma)
3.4 Định tính sơ bộ một số nhóm chất có trong cao chiết toàn phần
Phương pháp định tính được thực hiện theo quy trình mô tả của Sofowora,
Nhóm chất Phương pháp Hiện tượng quan sát
Alkaloid 2ml cao chiết + 2ml thuốc thử
Flavonoid 1ml cao chiết + HCl đđ + Mg Màu vàng
Acid hữu cơ 2ml cao chiết + 0,1g tinh thể
Bọt khí nổi lên trên dung dịch
Saponin 2ml cao chiết lắc mạnh 30 giây
Bọt khí bên trên bền từ 3 đến 60 phút Phenolic + tanine 2ml cao chiết + 3 giọt FeCl3
Dung dịch chuyển đen Đường khử 2ml cao chiết + 4 đến 5 giọt thuốc thử fehling A + 4 đến 5 giọt thuốc thử fehling B
Acid uronic 2ml cao chiết mẩu nấm + 4ml ethanol 96 o
3.5 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
Quy trình thực hiện khảo sát hoạt tính kháng khuẩn được thực hiện theo Bauer và cộng sự (1966)
- Số lượng mẫu cao chiết: 1 mẫu (Cao chiết thu nấm thu được sau quá trình chiết cao)
- Nồng độ khảo sát: Cao chiết sẽ được pha ở nồng độ 400; 200; 100; 50; 25; 12,5 mg/ml với nước cất khử ion
- Hòa tan 400 mg cao chiết với 1ml nước cất khử ion để được ống 1 nồng độ 400 mg/ml, sau đú hỳt 500àl từ ống 1 vào ống 2 và cho thờm 500àl nước cất khử ion thu được ống 2 nồng độ 200 mg/ml Làm tiếp tục đến khi thu được ống 6 nồng độ 12,5 mg/ml
- Nước cất vô trùng được thực hiện làm chứng âm
- Số lượng chủng vi khuẩn: 4 chủng (1 chủng gram dương là Staphylococcus aureus (ATCC 25923) và 3 chủng gram âm gồm Pseudomonas aeruginosa (ATCC
27853), Salmonella typhimurium (ATCC 14028), Escherichia coli (ATCC 25922))
- Số lượng đĩa cần trong thí nghiệm là 16 đĩa Mỗi đĩa đục 4 lỗ thạch 3 lỗ được bơm cao chiết ở mỗi nồng độ, 1 lỗ làm lỗ đối chứng bơm nước cất vô trùng
- Môi trường thử nghiệm Nutrient Agar (NA) được hấp vô trùng 121°C trong 20 phút Sau đó 10ml môi trường được đổ vào đĩa
- Môi trường thử nghiệm MHA (Mueller Hinton Agar) được hấp vô trùng 121°C trong 20 phút Sau đó 20ml môi trường được đổ vào đĩa
- Vi khuẩn được cấy hoạt hóa trong môi trường NA ủ ở 37 𝑜 C trong 24 giờ
- Dùng tăm bông lấy khuẩn lạc của chủng vi khuẩn gây bệnh pha dịch treo NaCl 0.85% Độ đục của ống vi khuẩn đạt được là 0,5 theo tiêu chuẩn McFarland
- Dùng tăm bông trải dịch vi khuẩn được trên đĩa môi trường MHA (Mueller Hinton Agar)
- Đục lỗ tạo thành giếng với đường kính 6mm sau đó 70ul dịch chiết nấm Linh chi ở các nồng độ được đổ vào giếng
- Các đĩa Petri được để ổn định cho dịch chiết nấm linh chi thấm vào môi trường thạch ở 4°C trong 15 phút
- Đem đĩa ủ trong tủ nuôi ở 37°C trong ít nhất 16 giờ
- Nước cất vô trùng được thực hiện làm đối chứng âm
- Khả năng kháng khuẩn của các dịch chiết nấm linh chi đối với các chủng vi khuẩn kiểm định được đo bằng đường kính vòng vô khuẩn sau 16-18 giờ nuôi ủ ở 37°C
3.6 Khảo sát hoạt tính kháng nấm
Quy trình thực hiện khảo sát hoạt tính kháng nấm, được thực hiện theo Nxumalo và cộng sự, 2020
- Môi trường SDA và môi trường PDA thử nghiệm được hấp vô trùng ở
- Môi trường PDA được đổ vào đĩa petri (đường kính 90) với thể tích 25ml
⮚ Chuẩn bị cao chiết thử nghiệm
- Nồng độ khảo sát: Cao chiết sẽ được pha ở nồng độ 400; 200; 100; 50; 25; 12,5 mg/ml với nước cất khử ion (Thy và cộng sự, 2020)
⮚ Chuẩn bị dịch treo vi nấm gây bệnh
- Vi nấm thử nghiệm hoạt tính: Cadida albicans, Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Microsporum canis
- Lấy khoảng 3 đến 5 khóm vi nấm trên đĩa thạch đã được cấy hoạt hóa trong 5 ngày để pha thành dịch treo trong nước muối sinh lý 0,85%
- Đem đi vortex trong vòng 10 giây đến 30 giây đến khi đạt độ đục chuẩn Độ đục chuẩn tương đương với nồng độ 1 – 2 *10 6 tế bào/ml
- Sau khi pha được huyền dịch vi nấm gây bệnh, dùng tâm bông vô trùng nhúng vào ống vi nấm cho ngập đầu tâm bông ròi ép vào thành cho ráo bớt nước
- Sau đó trải đều dịch vi khuẩn có trong bông tâm vô trùng lên mặt thạch, trải đều vi khuẩn hết cả đĩa thạch đến khi thấy mặt thạch khô
- Sau khi mặt thạch khô tiến hành đục lỗ thạch với đường kính 6mm Mỗi đĩa đục
4 lỗ lấy 1 lỗ làm lỗ đối chứng
- Cao chiết được thờm vào mỗi giếng thạch khoảng 70àl Cỏc đĩa Petri được để yờn ở 4°C trong 15 phút cho dịch chiết nấm linh chi thấm vào môi trường thạch
- Mẫu đối chứng âm được thực hiện với nước cất vô trùng
- Khả năng kháng nấm của các dịch chiết nấm Linh chi đối với các chủng vi nấm kiểm định được đo bằng đường kính vòng vô khuẩn sau 16-18 giờ nuôi ủ ở 37°C
Cao chiết thử nghiệm có khả năng kháng vi nấm gây bệnh khi xung quang lỗ thạch có vòng vô khuẩn
Hình 2.4 Kết quả vòng kháng khuẩn, kháng nấm
3.7 Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa tế bào
Khả năng chống oxy hóa của nấm Linh chi được đánh giá theo phương pháp của
- Số lượng mẫu cao chiết: 1 mẫu (Cao chiết thu nấm thu được sau quá trình chiết cao)
- Cao chiết được pha thành dải nồng độ: 200; 100; 50; 25; 12,5 àg/ml với nước cất khử ion Hũa tan 200 àg cao chiết với 1ml nước cất khử ion để được ống 1 nồng độ
200 àg/ml, sau đú hỳt 500àl từ ống 1 vào ống 2 và cho thờm 500àl nước cất khử ion thu được ống 2 nồng độ 100 àg/ml Làm tiếp tục đến khi thu được ống 4 nồng độ 25 àg/ml
- Acid ascorbic (đối chứng dương) pha với nồng độ 200; 100; 50; 25; 12,5 àg/ml với nước cất khử ion Cõn 200 àg acid ascorbic hũa tan vào 1ml nước cất khử ion để đạt dược nồng độ 200 àg/ml thu được ống 1 Hỳt 500àl từ ống 1 cho vào ống 2 và thờm
500àl nước cất khử ion thu được ống 2 với nồng độ 100 àg/ml Tiếp tục pha đến khi đạt ống 5 nồng độ 12,5 àg/ml
- Cân 0,05g DPPH định mức trong cồn 96° thành 25 ml Để ổn định trong tối khoảng 30 phút Lúc này DPPH có nồng độ 2%
- Hút 1 ml mẫu nghiên cứu đã pha ở các nồng độ vào ống thủy tinh Thêm 1 ml dung dịch DPPH đã chuẩn bị ở trên vào các ống đã có sẵn mẫu nghiên cứu
- Mẫu đối chứng dương bao gồm 1 ml dung dịch acid ascorbic và 1ml DPPH (2%)
- Ống không có mẫu thử làm đối chứng âm chỉ có 1 ml nước và 1 ml DPPH
- Ủ ở nhiệt độ phòng trong 60 phút Xác định độ hấp thụ quang của dung dịch sau phản ứng tại bước sóng 517 nm trên máy đo OD
(Vì mẫu nghiên cứu và dung dịch DPPH đưa vào ống theo tỷ lệ 1:1, nên nồng độ mẫu nghiên cứu trong ống có DPPH sẽ giảm đi một nửa còn 100; 50; 25; 12,5; 6,25 àg/ml Nồng độ acid ascorbic (VitC) trong ống cú DPPH sẽ giảm đi một nửa cũn 100; 50; 25; 12,5; 6,25 àg/ml)
- Giếng có chứa DPPH hòa cùng dung môi hòa mẫu nghiên cứu được coi là giếng đối chứng Acid ascorbic là chất đối chứng tham khảo Khả năng trung hòa GTD (Scavenging Activities - SA) sinh ra từ DPPH của mẫu thử được tính theo công thức sau:
% SA = (ODđối chứng − ODmẫu thử)
ODđối chứng: giá trị OD của mẫu không có dịch chiết
ODmẫu thử: giá trị OD của mẫu không có dịch chiết
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1 Kết quả thu cao chiết mẫu nấm
Kết quả tổng hàm lượng polysachride, polyphenol và định lượng adenosine
Bảng 3 2 Bảng so sánh hàm lượng polysacharide giữa các mẫu nấm
STT Hàm lượng polysachride TLTK
Từ kết quả phân tích trên bảng trên ta có thể thấy rằng nấm Linh chi ở những vùng khác nhau thì có hàm lượng khác nhau Nấm Linh chi giống Hàn có hàm lượng polysachride nhiều nhất gấp 1,271 lần giống Nhật và 3,409 lần mẫu khảo sát Nấm
Linh chi giống Nhật gấp 2,682 lần mẫu khảo sát Như vậy, kết quả khảo sát hàm lượng polysachride cho kết quả đáng khích lệ về hàm lượng hợp chất và khả năng hoạt động kháng oxy hóa của polyssaccharde từ nấm Linh chi
Xây dựng đường chuẩn acid galic: 0,1 ml mẫu + 0,5 ml Folin 10% + 0,4 ml
Na2CO3 10% + 1,5 ml nước ủ 2h, đo OD ở bước sóng 760 nm
Hình 3 3 Đường chuẩn các định hàm lượng Phenolid tổng
Các hợp chất phenolic có nguồn gốc từ thảo dược thiên nhiên không chỉ biết đến bởi khả năng kháng oxy hoá (nhường hydro hoặc nhường điện tử) mà còn là chất trung gian ổn định để chuyển hóa chất Trên cơ sở đường chuẩn này, hàm lượng tổng phenolic trong mẫu nghiên cứu được xác định và trình bày ở bảng
Bảng 3 3 Hàm lượng phenolic của mẫu cao chiết
Hàm lượng Phenolic tổng (mg GAE/ g chất khô)
0,041 ± 0,001 Bảng 3 4Bảng so sánh hàm lượng phenolic giữa mẫu và những bài báo khác
Mẫu Xuất xứ Hàm lượng tổng phenolic (mg GAE/ g chất khô)
Nấm Linh chi Đà Lạt 0,041 ± 0,001 Nghiên cứu này
Hàn Quốc 0,135 ± 0,005 Lê Trung Hiếu,
Quảng Bình 0,118 ± 0,002 Lê Thùy Trang,
Kết quả ở bảng cho thấy: Hàm lượng tổng phenolic trong các mẫu nguyên liệu nuôi trồng ở những địa lí khác nhau thì rất khác nhau Trong nhóm nấm Linh chi đã sử dụng làm dược liệu theo truyền thống, có thể nhận thấy mẫu nấm Linh chi Quảng Bình thiên nhiên có chứa tổng phenolic cao vượt trội so với các mẫu nấm trồng khác, tương đương với Linh chi đã có thương hiệu của Hàn quốc cũng cao hơn với mẫu khảo sát gấp 3,33 lần Điều này cho thấy rằng điều kiện nuôi cấy có thể ảnh hưởng đến nồng độ các hợp chất có trong nấm Linh chi Như vậy, có thể kết luận rằng mẫu nấm đang khảo sát có khả năng kháng oxi hóa tế bào
Hình 3 4 Phổ HPLC của adenosin Dựa vào hình ảnh ta có thể nhận thấy được Adenosin xuất hiện ở vị trí peak 6.5 phút Adenosine trong mẫu cao có hàm lượng 2.146 mg/g mẫu và không thấy có sự xuất hiện của hợp chất Cordycepin đúng với trong thực nghiệm với sắc kí đồ chuẩn Adenosin xuất hiện tại vị trí 6 đến 8 và không xuất hiện hợp chất Cordycepin do hợp chất này hiện nay không có trên nấm Linh chi mà chỉ xuất hiện trên nấm Đông trùng hạ thảo Có thể kết luận rằng mẫu có khả năng đập tắt trạng thái kích thích của tế bào thần kinh và ức chế giải phóng nhiều chất dẫn truyền thần kinh sinap ứng với công dụng của Adenosin
Bảng 3 5Các thông số của cao chiết nấm
Thông số Thông số kĩ thuật
Màu sắc Nâu đen sẫm
Định tính sơ bộ một số nhóm chất có trong cao chiết toàn phần
Hình 3 5 Định tính alkaloid Ống 1 (Bên trái): Nước cất + thuốc thử Mayer Ống 2 (Bên phải): Dịch chiết nước + thuốc thử Mayer
Cho cao chiết mẫu nấm đã được pha loãng tác dụng với thuốc thử Mayer Nhận thấy có tủa màu vàng nhạt K2(HgI4) không xuất hiện như trên ảnh Có thể kết luận trong mẫu cao chiết không có sự hiện diện của nhóm alkaloid
Hình 3 6 Định tính flavonoid Ống 1 (Bên trái): Nước cất + HClđđ + Mg Ống 2 (Bên phải): Dịch chiết nước + HClđđ + Mg Thêm vài giọt HCl đậm đặc vào mẫu thử đã pha loãng sau đó cho một ít bột kim loại Mg vào, tiếp tục quan sát như trên hình thì không thấy sự chuyển sang màu đỏ của các loại dịch chiết, có thể kết luận sơ bộ là trong dịch chiết của mẫu cao chiết nấm linh chi không có sự xuất hiện của flavonoid
3.3 Định tính acid hữu cơ
Hình 3 7 Định tính acid hữu cơ Ống 1 (Bên trái): Dịch chiết nước đối chứng Ống 2 (Bên phải): Dịch chiết nước + Tinh thể Na2CO3
Cho vài tinh thể Na2CO3 vào mẫu cao chiết đã pha loãng, có hiện tượng sủi bọt xảy ra, nên có thể có sự xuất hiện của acid hữu cơ trong cao chiết mẫu nấm linh chi
2CnH2n+1COOH +Na2CO3 => 2CnH2n+1COONa + CO2 + H2O
Hình 3 8 Định tính saponin Ống 1 (Bên trái): Dịch chiết nước đối chứng không lắc Ống 2 (Bên phải): Dịch chiết nước sau khi lắc và để yên 5 phút Cho 5ml nước cất vào ống dung dịch cao chiết đã pha loãng, bịt miệng ống nghiệm bằng nút bông và lắc mạnh theo chiều dài của ống, nhận thấy được ống cao chiết mẫu nấm tạo bọt và tồn tại hơn 10 phút do tạo được sức căng bề mặt với nước Có thể kết luận cao chiết mẫu nấm có hợp chất saponin
Hình 3 9 Định tính phenolic và tanine Ống 1 (Bên trái): Nước cất + FeCl3 5% Ống 2 (Bên phải): Dịch chiết mẫu nấm + FeCl3 5%
Sau khi pha loãng mẫu cao chiết sau đó thêm dịch FeCl3 5%, quan sát hình hiện tượng nhận thấy rằng ống 2 có phản ứng tạo màu xanh đen do xuất hiện hợp chất chứa
Fe Ta có thể kết luận sơ bộ được là trong dịch chiết tơ nấm linh chi với nước, có thể có tanin
Hình 3 10 Định tính đường khử trước khi đun
Hình 3 11 Định tính đường khử sau khi đun Ống 1 (Bên trái): Nước cất + thuốc thử Fehling A, B Ống 2 (Bên phải): Dịch chiết mẫu nấm + thuốc thử Fehling A, B Cho vào dung dịch đã pha loãng 4 – 5 giọt thuốc thử Fehling A lắc nhẹ sau đó cho thêm 4 – 5 giọt thuốc thử Fehling B, lắc nhẹ và đem đi đun cách thủy, ta thấy được cả 2 ống nghiệm không có hiện tượng xảy ra và đối với ống nghiệm 2 không có xuất hiện kết tủa đỏ gạch, nên có thể trong ống nghiệm không xuất hiện đường khử
Hình 3 12 Định tính acid uronic Ống: Mẫu dịch chiết tơ nấm với ethanol
Pha loãng mẫu dịch chiết nấm với ethanol 96 0 , lắc nhẹ ta thấy trong dịch chiết nấm có xuất hiện nhiều kết tủa như trên hình, kết luận sơ bộ rằng trong tơ nấm linh chi có thể có hợp chất đường loại acid uronic
❖ Ngoài ra còn thực hiện trên một số nhóm chất như: acid béo, tinh dầu, carotenoid,… Kết quả định tính sơ bộ được tóm tắt trong Bảng 3.6 Kết quả cho thấy trong cao chiết từ mẫu nấm Linh chi có sự xuất hiện của nhiều hợp chất
Bảng 3 6Tóm tắt sự hiện diện của các hợp chất tự nhiên có trong cao chiết Mẫu cao chiết
Thuốc thử Kết quả Hợp chất tự nhiên
- Thuốc thử Mayer Có tủa màu Alkaloid
- HClđđ + Mg Có vòng màu đỏ Flavonoid
+ Tinh thể Na2CO3 Bọt khí nổi lên trên dung lịch
+ Lắc mạnh dung dịch Bọt khí bền từ 3 đến 60 phút
+ FeCl3 5% Dung dịch chuyển đen Phenolic và tanin
Tủa đỏ gạch Đường khử
+ Ethanol Có kết tủa Acid uronic
- Nhỏ dịch trên giấy lọc Để lại vết ố Acid béo
- Bay hơi còn lại cặn Có mùi thơm Tinh dầu
+ H2SO4 đđ Màu xanh Carotenoid
Ghi chú: (-): âm tính (+): dương tính
Khi so sánh thành phần hóa học có trong cao chiết nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) và cao chiết nấm Linh chi đen (A subresinosum) kết quả cho thấy trong tơ nấm
Linh chi đen A subresinosum có nhiều hoạt chất hóa học hơn G lucidum, cụ thể như: acid béo, tinh dầu, acid hữu cơ,… Kết quả so sánh hợp chất giữa 2 loài nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) và nấm Linh chi đen (A subresinosum) được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3 7So sánh thành phần hóa học có trong nấm G lucidum và A.subresinosum Hợp chất tự nhiên Kết quả định tính thành phần hóa học trong tơ nấm
Phenolic và tanin + + Đường khử - +
Ghi chú: (-): âm tính (+): dương tính
Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nấm Linh chi
Tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của mẫu cao chiết nấm ở nồng độ cao thô là 400; 200; 100; 50; 25; 12,5 mg/ml pha trong DMSO 1% để khảo sát hoạt tính kháng lại một số chủng vi khuẩn như: Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeuginosa, Escherichia coli bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch, ta có kết quả đường kính vòng ức chế vi khuẩn như sau:
Hình 3 13 Khả năng kháng khuẩn Pseudomonas aeuginosa của cao chiết nấm tại nồng và 200 mg/ml
Hình 3 14 Khả năng kháng khuẩn Pseudomonas aeuginosa của cao chiết nấm tại nồng và 400 mg/ml
Hình 3 15 Khả năng kháng khuẩn E coli của cao chiết nấm tại nồng độ 200 mg/ml
Hình 3 16Khả năng kháng khuẩn E coli của cao chiết nấm tại nồng độ 400 mg/ml
Hình 3 17Khả năng kháng khuẩn Salmonella typhimurium của cao chiết nấm tại nồng độ 200 mg/ml
Hình 3 18 Khả năng kháng khuẩn Salmonella typhimurium của cao chiết nấm tại nồng độ 400 mg/ml
Hình 3 19Khả năng kháng khuẩn Staphylococcus aureus của cao chiết nấm tại nồng độ 200 mg/ml
Hình 3 20 Khả năng kháng khuẩn Staphylococcus aureus của cao chiết nấm tại nồng độ 400 mg/ml Bảng 3 8 Khả năng kháng khuẩn của cao chiết
Mẫu thí nghiệm Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)
Mẫu ở nống độ 25mg/ml - - - -
Mẫu ở nống độ 50mg/ml - - - -
Mẫu ở nống độ 100mg/ml - - - -
Mẫu ở nống độ 200mg/ml 12,700±0,066 9,778±0,066 - 8,778±0,033
Mẫu ở nống độ 400mg/ml 23,333±0,066 18,333±0,066 11,778±0,033 16,333±0,066
❖ Chú thích: (-) không thể hiện hoạt tính kháng
Dimethyl sulfoxide (DMSO) 1% được dùng làm dung môi để pha loãng cao chiết và nước được khảo sát hoạt tính kháng khuẩn tương tự như cao chiết để làm chứng âm Kết quả cho thấy, nước không có khả năng ức chế vi khuẩn thử nghiệm Ảnh hưởng của DMSO 1% và cao chiết đến sự phát triển của vi khuẩn được trình bày ở bảng 3.8
Kết quả trình bày ở bảng 3.8 cho thấy, cao chiết nấm linh chi có khả năng ức chế đối với 3 dòng vi khuẩn: E coli, S typhimurium, S aureus ở nồng độ 200 mg/ml đường kính vòng kháng khuẩn được tạo ra ở nồng độ cao chiết khảo sát, khi nồng độ cao chiết càng tăng thì đường kính vòng vô khuẩn càng tăng Đồng thời, sự thay đổi kích thước vòng kháng khuẩn khác biệt có ý nghĩa thống kê ở các nồng độ được khảo sát Do đó, khi tăng nồng độ cao chiết lên cao hơn có thể sẽ tạo ra các vòng kháng khuẩn có đường kính còn lớn hơn nữa Trong những dòng vi khuẩn bị ức chế, cao chiết cho hiệu quả ức chế vi khuẩn S aureus cao nhất, tạo được vòng kháng khuẩn lớn nhất ở các nồng độ 400 mg/ml so với các dòng vi khuẩn khác Cao chiết cho hiệu quả ức chế vi khuẩn P aeuginosa thấp nhất, không tạo được vòng kháng khuẩn ở nồng độ
400 mg/ml so với các dòng vi khuẩn khác
Dựa vào kết quả cho thấy ở các nồng độ 25, 50, 100 mg/ml không thấy hoạt động kháng khuẩn của cao chiết Ở nồng độ 200 mg/ml cho thấy cao chiết không hình thành vòng vô khuẩn với Pseudomonas aeuginosa Cao chiết kháng khuẩn Escherichia coli sinh vòng kháng 8,77±0,066 cm.Cao chiết kháng khuẩn Salmonella typhimurium sinh vòng kháng 9,77±0,066 cm Cao chiết kháng khuẩn Staphylococcus aureus sinh ra vòng kháng 12,700±0,060 cm Ở nồng độ 400 mg/ml cho thấy cao chiết kháng khuẩn Escherichia coli sinh vòng kháng 16,333±0,066 cm Cao chiết kháng khuẩn
Salmonella typhimurium sinh vòng kháng 18,333±0,066 cm Cao chiết kháng khuẩn Staphylococcus aureus sinh ra vòng kháng 23,333±0,066 cm và Cao chiết kháng khuẩn Pseudomonas aeuginosa sinh ra vòng kháng 11,778±0,033cm
Mặt khác, kết quả nghiên cứu cũng cho thấy rằng tác động của cao chiết lên vi khuẩn Gram dương mạnh hơn lên vi khuẩn Gram âm Điều này có thể được giải thích bởi sự khác biệt của thành tế bào của hai loại vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương Thành tế bào Gram dương được cấu tạo bao gồm một lớp peptidoglycan dày bao quanh màng sinh chất Thành tế bào của vi khuẩn Gram âm phức tạp hơn bởi các lớp peptidoglycan mỏng, cứ một lớp không gian chu chất và tới lớp màng ngoài là phức hợp của lipoprotein và lipopolysaccharide Chính cấu trúc nhiều lớp này đã bảo vệ tế bào vi khuẩn Gram âm khỏi các tác động của cao chiết và khoảng không gian ngoại sinh chứa các độc tố và enzyme có thể làm bất hoạt cao chiết trước khi tác động lên màng sinh chất
Khi so sánh kết quả kháng khuẩn từ nấm linh chi thu được từ thực nghiệm cùng với bài báo của TS Nguyễn Hoàng Dũng, 2015; R Kamble, 2010 thu được bảng sau
Bảng 3 9Bảng so sánh kết quả khả năng kháng khuẩn từ thực nghiệm và bài báo
Chủng vi khuẩn Đường kính vòng kháng khuẩn nấm thử nghiệm Đường kính vòng kháng khuẩn từ bài báo Nồng độ thấp nhất không thấy thể hiện vòng kháng
Mẫu ở nống độ 200mg/ml
Nồng độ thấp nhất không thấy thể hiện vòng kháng
Mẫu ở nống độ 200mg/ml
Kết quả so sánh từ bài báo cho thấy ở những nồng độ thấp dưới 50 mg/ml không thấy được khả năng kháng khuẩn của cao chiết nấm linh chi tại Việt Nam Ở mẫu thử nghiệm và bài báo so sánh tại nồng độ 200 mg/ml không có vòng kháng khuẩn trên vi khuẩn Pseudomonas aeuginosa và đối với 3 chủng còn lại là Escherichia coli,
Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus thì vòng kháng khuẩn của bài báo luôn cao hơn vòng kháng khuẩn của cao chiết thực nghiệm Tuy nhiên ở cả thực nghiệm và bài báo so sánh đều cho kết quả âm tính với chủng vi khuẩn Pseudomonas aeuginosa và kết quả vòng vô khuẩn to nhất vẫn xuất hiện ở chủng vi khuẩn gram dương
Hoạt tính kháng nấm của cao chiết nấm Linh chi
Để khảo sát hoạt tính kháng lại một số chủng vi nấm như: Cadida albicans,
Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Microsporum canis bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch, các loại cao chiết được chuẩn bị ở nồng độ 400 mg/ml, sau đó được bơm vào các giếng đã đánh dấu và được ủ ở 37 0 C, trong 3 ngày Quan sát và đo vòng kháng
Hình 3 21Khả năng kháng nấm Trichophyton mentagrophytes của cao chiết nấm tại nồng độ 400 mg/ml (mặt trên và mặt dưới đĩa)
Hình 3 22Khả năng kháng nấm Microsporum canis của cao tại nồng độ 400 mg/ml
Hình 3 23Khả năng kháng nấm Trichophyton rubrum của cao tại nồng độ 400 mg/ml
Dimethyl sulfoxide (DMSO) 1% được dùng làm dung môi để pha loãng cao chiết và nước được khảo sát hoạt tính kháng nấm tương tự như cao chiết để làm chứng âm Kết quả cho thấy, nước không có khả năng ức chế vi nấm thử nghiệm Ảnh hưởng của DMSO 1% và cao chiết đến sự phát triển của vi nấm được trình bày ở bảng
Bảng 3 10Khả năng kháng nấm của cao chiết
Mẫu thí nghiệm Đường kính vòng kháng nấm (mm)
Mẫu ở nống độ 25mg/ml - - - -
Mẫu ở nống độ 50mg/ml - - - -
Mẫu ở nống độ 100mg/ml - - - -
Mẫu ở nống độ 200mg/ml - - - -
Mẫu ở nống độ 400mg/ml - - 16,333±0,666 -
❖ Chú thích: (-) không thể hiện hoạt tính kháng
Từ kết quả ở bảng trên có thể nhận thấy:
- Đối với vi nấm Cadida albicans kết quả định tính cho thấy nấm mọc nhanh và cao chiết không tạo vòng kháng nấm xung quang lỗ chứa cao chiết, có thể kết luận rằng cao chiết không có khản năng kháng vi nấm Cadida albicans
- Đối với vi nấm Microsporum canis kết quả định tính cho thấy nấm mọc trung bình và cao chiết không tạo vòng kháng nấm xung quang lỗ chứa cao chiết, có thể kết luận rằng cao chiết không có khản năng kháng vi nấm Microsporum canis
- Đối với vi nấm Trichophyton rubrum kết quả định tính cho thấy nấm mọc trung bình và cao chiết không tạo vòng kháng nấm xung quang lỗ chứa cao chiết, có thể kết luận rằng cao chiết không có khản năng kháng vi nấm Trichophyton rubrum
- Đối với vi nấm Trichophyton mentagrophytes kết quả định tính cho thấy nấm mọc chậm và cao chiết tạo vòng kháng nấm xung quang lỗ chứa cao chiết và lỗ không có cao chiết không xuất hiện vòng kháng và nấm vẫn có thể mọc được, vóng kháng được đo tại các lỗ có cao chiết lần lượt là 16mm, 17mm, 17mm Kết quả này cho thấy cao chiết từ mẫu nấm Linh chi có khả năng kháng lại chủng vi nấm
Trichophyton mentagrophytes có thể kết luận rằng cao chiết nấm Linh chi có khả năng kháng vi nấm Trichophyton mentagrophytes
Từ kết quả trên cho thấy cao chiết kháng vi nấm mạnh nhất đối với chủng
Trichophyton mentagrophytes với đường kính vòng kháng là 16,333±0,666 và không thấy sự xuất hiện vòng kháng đối với các chủng Cadida albicans, Trichophyton rubrum, Microsporum canis
Hiện nay nước ta chưa có công trình nghiên cứu cũng như bài báo khoa học nói về khả năng kháng vi nấm của cao chiết nấm Linh chi Tuy nhiên đã có một số công trình nghiên cứu về cao chiết nấm Linh chi nhưng chỉ dừng lại ở mức độ định tính, định lượng, phân lập các hợp chất mà chưa nghiên cứu sâu về khả năng kháng vi nấm của cao chiết Vì vậy kết quả kháng nấm từ nghiên cứu này cho thấy hướng đi mới về khả năng kháng khuẩn của cao chiết nấm Linh chi.
Hoạt tính chống oxi hóa tế bào của cao chiết nấm Linh chi
DPPH là một phương pháp được sử dụng phổ biến để kiểm tra khả năng loại bỏ các gốc tự do và các nhóm chất chứa hydro, phương pháp này cũng được sử dụng để định lượng các chất oxy hóa trong hệ thống sinh học phức tạp ngày nay Những điện tử mang điện đơn lẻ có trong gốc tự do DPPH cho thấy sự hấp thu mạnh nhất ở bước sóng 517 nm và hợp chất này có màu tím Khi các electron đơn lẻ này kết hợp với hydro của chất chống oxy hóa để hình thành dạng DPPH – H, hợp chất sẽ chuyển từ màu tím sang vàng tương ứng với lượng electron kết hợp với DPPH Vì vậy, khả năng làm sạch gốc tự do của một chất càng cao thì sự hấp thu quang phổ ở bước sóng
517 nm của phản ứng DPPH có giá trị càng thấp và ngược lại
Hình 3 24Kết quả định tính hoạt tính chống oxi hóa bằng phương pháp TLC
Kết quả định tính hoạt tính chống oxi hóa bằng phương pháp TLC nhận thấy cao chiết nấm linh chi chia thành 2 phân đoạn và ở tại phân đoạn 2 có hoạt tính chống oxi mạnh nhất nên tại phân đoạn 2 xuất hiện chấm màu vàng Sau đó, tiến hành xác định hoạt tính chống oxy hóa (COXH) của cao chiết mẫu ở các nồng độ, kết quả được thể hiện trong bảng 3.8 Đo độ hấp thu của DPPH: A0= 0,110 đối với cao chiết
Bảng 3 11Kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa của cao chiết Linh chi
Nồng độ (àg/ml) Giỏ trị OD517 % Ức chế
Bảng 3 12Kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa của vitamin C
Nồng độ (àg/ml) Giỏ trị OD517 % Ức chế
IC50 (àg/ml) 18,730 Đo độ hấp thu của DPPH: A0= 1,086 đối với vitamin C
Hình 3 25Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxi hóa của cao chiết từ nấm linh chi
Hình 3 26Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxi hóa của vitamin C
Kết quả thể hiện ở hình 3.20 cho thấy trong cao chiết có chất chống oxi hóa nên khi chạy sắc kí và soi dưới đèn UV thì nhận thấy có phân đoạn chứa chất chống oxi hóa màu vàng Từ kết quả nghiên cứu trong bảng cho thấy rằng cao chiết nấm Linh Chi ở nồng độ 200 àg/ml cú hoạt tớnh chống oxi húa cao nhất với tỉ lệ % ức chế là 60,909%, ở nồng độ 12,5 àg/ml thỡ hoạt tớnh chống oxi húa thấp nhất với tỉ lệ % ức chế là 33,636% So sánh kết quả kháng oxi hóa của cao chiết nấm Linh Chi và vitamin
% Ức chế của cao chiết
% Ức chế Linear (% Ức chế )
% Ức chế Linear (% Ức chế )
C ta thấy cao chiết từ nấm Linh Chi có khả năng chống gốc tự do DPPH tuy nhiên không cao bằng khả năng chống gốc tự do DPPH của vitamin C
Từ các kết quả nghiên cứu cho thấy rằng cao chiết linh chi có giá trị IC50 287,461 àg/ml cao hơn giỏ trị IC50 của vitamin C là 18,730 àg/ml, giỏ trị IC50 của cao chiết nấm linh chi lớn hơn gấp 15,31 lần, chứng tỏ hoạt tính chống oxi hóa của cao chiết nấm linh chi thấp hơn so với vtamin C Qua đó, nhóm nghiên cứu cũng đề xuất hướng phát triển tiếp theo của để tài đó là nghiên cứu, xác đinh thêm một số thành phần hợp chất khác trong cao chiết này
So sánh kết quả cao chiết nấm linh chi của nhóm với tác giả Poh và cộng sự,
2013 nhận thấy cao chiết đều có khả năng chống oxi hóa và nằm trong ngường từ 0,014±0,001-0,018 ± 0,001 tại nồng độ 200 àg/ml (P
