Đánh giá hoạt tính kháng nấm và thành phần hóa học của cao chiết nấm Linh chi Ganoderma lucidum

Quy trình nghiên cứu

Tổng hàm lượng polysaccharide của dịch chiết nước nóng được xác định bằng phương pháp axit phenol-sulfuric với D -glucose theo Nielsen và cộng sự, 2017. Định tính sơ bộ một số nhóm chất có trong cao chiết toàn phần Phương pháp định tính được thực hiện theo quy trình mô tả của Sofowora, 1996 và Tiwari, 2013. - Khả năng kháng khuẩn của các dịch chiết nấm linh chi đối với các chủng vi khuẩn kiểm định được đo bằng đường kính vòng vô khuẩn sau 16-18 giờ nuôi ủ ở 37°C.

- Sau khi pha được huyền dịch vi nấm gây bệnh, dùng tâm bông vô trùng nhúng vào ống vi nấm cho ngập đầu tâm bông ròi ép vào thành cho ráo bớt nước. - Khả năng kháng nấm của các dịch chiết nấm Linh chi đối với các chủng vi nấm kiểm định được đo bằng đường kính vòng vô khuẩn sau 16-18 giờ nuôi ủ ở 37°C.

Kết quả thu cao chiết mẫu nấm

Thông thường, yêu cầu dung môi phải hòa tan tốt các cấu tử cần chiết tách, nếu cấu tử cần chiết có cấu tạo phân cực thì phải chọn dung môi có tính phân cực như nước, ethanol, methanol… Ngược lại nếu cấu tử không phân cực thì phải lựa chọn các dung môi không phân cực như benzene, n-hexan…Polysaccharide là hợp chất phân cực, do đó các nghiên cứu trong và ngoài nước khi chiết tách polysaccharide đã dùng những dung môi phân cực như: ethanol, nước, methanol…Nhóm nghiên cứu ở Viện Công nghiệp thực phẩm của Trương Thị Hòa, 2013 đã tiến hành chiết Linh chi (Ganoderma lucidum) chủng Nhật Bản trên dung môi cồn và nước. Qing-Yi Lu và cộng sự cũng tiến hành đánh giá ảnh hưởng của cao chiết ethanol và cao chiết nước nấm Linh chi đối với sự ức chế tăng trưởng các tế bào ung thư bàng quang. Việc lựa chọn dung môi này cho thấy chúng tôi đã sát sao với thực tế trong quá trình nghiên cứu của mình nhằm đưa ra những kết quả có tính ứng dụng cao.

Sau mỗi lần chiết hiệu suất thu hồi cao giảm dần do các hợp chất có trong cao đã được thu hồi vào những lần thu trước. Đặc điểm cảm quan của sản phẩm (cao toàn phần): Màu nâu đen, để lâu ngoài không khí khi còn nóng sẽ chuyển sang màu nâu đen đậm.

Kết quả tổng hàm lượng polysachride, polyphenol và định lượng adenosine

Như vậy, kết quả khảo sát hàm lượng polysachride cho kết quả đáng khích lệ về hàm lượng hợp chất và khả năng hoạt động kháng oxy hóa của polyssaccharde từ nấm Linh chi. Các hợp chất phenolic có nguồn gốc từ thảo dược thiên nhiên không chỉ biết đến bởi khả năng kháng oxy hoá (nhường hydro hoặc nhường điện tử) mà còn là chất trung gian ổn định để chuyển hóa chất. Trong nhóm nấm Linh chi đã sử dụng làm dược liệu theo truyền thống, có thể nhận thấy mẫu nấm Linh chi Quảng Bình thiên nhiên có chứa tổng phenolic cao vượt trội so với các mẫu nấm trồng khác, tương đương với Linh chi đã có thương hiệu của Hàn quốc cũng cao hơn với mẫu khảo.

Adenosine trong mẫu cao có hàm lượng 2.146 mg/g mẫu và không thấy có sự xuất hiện của hợp chất Cordycepin đúng với trong thực nghiệm với sắc kí đồ chuẩn Adenosin xuất hiện tại vị trí 6 đến 8 và không xuất hiện hợp chất Cordycepin do hợp chất này hiện nay không có trên nấm Linh chi mà chỉ xuất hiện trên nấm Đông trùng hạ thảo. Có thể kết luận rằng mẫu có khả năng đập tắt trạng thái kích thích của tế bào thần kinh và ức chế giải phóng nhiều chất dẫn truyền thần kinh sinap ứng với công dụng của Adenosin.

Định tính sơ bộ một số nhóm chất có trong cao chiết toàn phần 1. Định tính alkaloid

Thêm vài giọt HCl đậm đặc vào mẫu thử đã pha loãng sau đó cho một ít bột kim loại Mg vào, tiếp tục quan sát như trên hình thì không thấy sự chuyển sang màu đỏ của các loại dịch chiết, có thể kết luận sơ bộ là trong dịch chiết của mẫu cao chiết nấm linh chi không có sự xuất hiện của flavonoid. Cho vài tinh thể Na2CO3 vào mẫu cao chiết đã pha loãng, có hiện tượng sủi bọt xảy ra, nên có thể có sự xuất hiện của acid hữu cơ trong cao chiết mẫu nấm linh chi. Sau khi pha loãng mẫu cao chiết sau đó thêm dịch FeCl3 5%, quan sát hình hiện tượng nhận thấy rằng ống 2 có phản ứng tạo màu xanh đen do xuất hiện hợp chất chứa Fe.

Pha loãng mẫu dịch chiết nấm với ethanol 960 , lắc nhẹ ta thấy trong dịch chiết nấm có xuất hiện nhiều kết tủa như trên hình, kết luận sơ bộ rằng trong tơ nấm linh chi có thể có hợp chất đường loại acid uronic. Khi so sánh thành phần hóa học có trong cao chiết nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) và cao chiết nấm Linh chi đen (A. subresinosum) kết quả cho thấy trong tơ nấm Linh chi đen A.

Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nấm Linh chi

Cao chiết kháng khuẩn Staphylococcus aureus sinh ra vòng kháng 23,333±0,066 cm và Cao chiết kháng khuẩn Pseudomonas aeuginosa sinh ra vòng kháng 11,778±0,033cm. Thành tế bào của vi khuẩn Gram âm phức tạp hơn bởi các lớp peptidoglycan mỏng, cứ một lớp không gian chu chất và tới lớp màng ngoài là phức hợp của lipoprotein và lipopolysaccharide. Chính cấu trúc nhiều lớp này đã bảo vệ tế bào vi khuẩn Gram âm khỏi các tác động của cao chiết và khoảng không gian ngoại sinh chứa các độc tố và enzyme có thể làm bất hoạt cao chiết trước khi tác động lên màng sinh chất.

Ở mẫu thử nghiệm và bài báo so sánh tại nồng độ 200 mg/ml không có vòng kháng khuẩn trên vi khuẩn Pseudomonas aeuginosa và đối với 3 chủng còn lại là Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus thì vòng kháng khuẩn của bài báo luôn cao hơn vòng kháng khuẩn của cao chiết thực nghiệm. Tuy nhiên ở cả thực nghiệm và bài báo so sánh đều cho kết quả âm tính với chủng vi khuẩn Pseudomonas aeuginosa và kết quả vòng vô khuẩn to nhất vẫn xuất hiện ở chủng vi khuẩn gram dương Staphylococcus aureus.

Hoạt tính kháng nấm của cao chiết nấm Linh chi

- Đối với vi nấm Cadida albicans kết quả định tính cho thấy nấm mọc nhanh và cao chiết không tạo vòng kháng nấm xung quang lỗ chứa cao chiết, có thể kết luận rằng cao chiết không có khản năng kháng vi nấm Cadida albicans. - Đối với vi nấm Microsporum canis kết quả định tính cho thấy nấm mọc trung bình và cao chiết không tạo vòng kháng nấm xung quang lỗ chứa cao chiết, có thể kết luận rằng cao chiết không có khản năng kháng vi nấm Microsporum canis. - Đối với vi nấm Trichophyton rubrum kết quả định tính cho thấy nấm mọc trung bình và cao chiết không tạo vòng kháng nấm xung quang lỗ chứa cao chiết, có thể kết luận rằng cao chiết không có khản năng kháng vi nấm Trichophyton rubrum.

- Đối với vi nấm Trichophyton mentagrophytes kết quả định tính cho thấy nấm mọc chậm và cao chiết tạo vòng kháng nấm xung quang lỗ chứa cao chiết và lỗ không có cao chiết không xuất hiện vòng kháng và nấm vẫn có thể mọc được, vóng kháng được đo tại các lỗ có cao chiết lần lượt là 16mm, 17mm, 17mm. Từ kết quả trên cho thấy cao chiết kháng vi nấm mạnh nhất đối với chủng Trichophyton mentagrophytes với đường kính vòng kháng là 16,333±0,666 và không thấy sự xuất hiện vòng kháng đối với các chủng Cadida albicans, Trichophyton rubrum, Microsporum canis.

Hoạt tính chống oxi hóa tế bào của cao chiết nấm Linh chi

Kết quả này cho thấy cao chiết từ mẫu nấm Linh chi có khả năng kháng lại chủng vi nấm Trichophyton mentagrophytes có thể kết luận rằng cao chiết nấm Linh chi có khả năng kháng vi nấm Trichophyton mentagrophytes. Tuy nhiên đã có một số công trình nghiên cứu về cao chiết nấm Linh chi nhưng chỉ dừng lại ở mức độ định tính, định lượng, phân lập các hợp chất mà chưa nghiên cứu sâu về khả năng kháng vi nấm của cao chiết. Khi các electron đơn lẻ này kết hợp với hydro của chất chống oxy hóa để hình thành dạng DPPH – H, hợp chất sẽ chuyển từ màu tím sang vàng tương ứng với lượng electron kết hợp với DPPH.

24Kết quả định tính hoạt tính chống oxi hóa bằng phương pháp TLC Kết quả định tính hoạt tính chống oxi hóa bằng phương pháp TLC nhận thấy cao chiết nấm linh chi chia thành 2 phân đoạn và ở tại phân đoạn 2 có hoạt tính chống oxi mạnh nhất nên tại phân đoạn 2 xuất hiện chấm màu vàng. Kết quả thể hiện ở hình 3.20 cho thấy trong cao chiết có chất chống oxi hóa nên khi chạy sắc kí và soi dưới đèn UV thì nhận thấy có phân đoạn chứa chất chống oxi hóa màu vàng.

Kiến nghị

- Xây dựng được quy trình chiết cao bằng phương pháp nước nóng thu được khối lượng cao như mong đợi. - Đã định tính được các nhóm chất bằng phản ứng hóa học đặc trưng, kết quả cho thấy trong quả thể nấm Linh chi có chứa các nhóm chất như: saponin, carotenoid, đường khử, acid hữu cơ,. - Khảo sát được khả năng kháng khuẩn, kháng nấm và chống oxi hóa của cao chiết nấm Linh chi qua đó bổ sung thêm đặc tính sinh học cho loài này.