Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cao chiết và các phân đoạn của cây hòa (sophora japonica l )

TRƯỜNO BẠI Hộc nguyễn TẤT THÀNH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHÓA GVHD Jyễn Tất Thành ^n^Thư viện 1587 PHẠM HỒNG HẠNH CỔNG NGHỆ SINH HỌC 2013 • 2ÚI7 TS NGUYỒN HOẢNG DỠN KHẢO SÁT SO BỌ TH ANH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO CHIÉT VÀ CÁC PHÂN ĐOẠN CỦA CÂY HÒE (Sophora japonic a L.) PHẠM HĨNG HẠNH Khóa luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bàng Kỹ sư Ngành Công nghệ Sinh học Giảng viên hường dần: TS NGUYỀN HOÀNG DŨNG TRƯỜNG ĐH NGUYỀN TẤT THÀNH TRUNG TÀM THÒNG TIN-THƯ VIỆN L.V0OI5ỸT /oM Tp HỒ Chí Minh, tháng 08 năm 2017 i LỜI CẢM ƠN Đê hồn thành khóa luận cách tót đẹp, em nhận rât nhiêu giúp đỡ từ q thay cơ, gia đình bạn bè Lời đâu tiên em xin gửi lời cám ơn sáu sấc lẽa q Thầy, Có khoa Nơng nghiệp Công nghệ cao Công nghệ Sinh học Trường Đại học Nguyễn Tất Thành tận tình truyền đạt kiến thức thời gian qua Với vốn kiến thức tiếp thu ưong q trình học khơng tảng cho trinh nghiên cứu khóa luận mà cịn hành trang q báu để em bước vào đời cách vững vả tự tin Em xin gửi lời cám 011 chân thành nhầt đèn Tháy TS Nguyễn Hồng Dũng, người dìu dất, truyền cho em niềm dam mê nghiên cưu giúp đỡ cho em trình học tập thực đề tài Và em xin gửi cảm ơn đến anh chị vả bạn làm việc phịng thí nghiệm Viện Kỹ thuật Công nghệ cao NTT - Đại học Nguyễn Tất Thành, đặc biệt chị ThS Nguyễn Lương Hiếu Hịa nhiệt tình giúp đỡ động viên em lúc khó khăn thời gian thực đề tài Con vô cảm ơn ba mẹ, gia đình ln bên cạnh ủng hộ động viên suốt trình học tập Cám ơn bạn bè, tập thể lớp 13DSH02 hỗ frợ, chia sẻ việc học tập thời gian năm Đại học Em xin chân thành cảm ơn! Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2017 Phạm Hồng Hạnh 11 TÓM TẤT Đê tài "Khảo sát so thành phân hóa học vã hoạt tính sinh học cao chiết cao phân đoạn Hòe (Sophora japonica L.)" thực phịng thí nghiệm Viện Kỹ thuật Công nghệ cao NTT- £>ậi học Nuyễn Tất Thành, địa chi số 298A Nguyễn Tất Thành, Phường 13, Quận - Tp Hổ Chí Minh Để tài thực từ tháng 02/2017 đến tháng 07/2017 với —-_c ĩiéu định tính thành phần hóa học hợp chất có Hòe (Sophora jar.criica L.) khảo sát so hoạt tính cùa Hịe Thí nghiệm bố trí theo thứ tự Nội dung thực gồm: - Định tính sơ thành phần hóa học - Thu nhận cao chiết từ nụ Hịe dung mói methanol, tách thu nhận cao phân đoạn từ dung môi methanol, hexan chloroform, ethyl ethylic, nước - Xác định hàm lượng polyphenol tổng số có cao chiết tổng methanol từ nụ Hòe - Khảo sát khả kháng oxy hóa kháng khuẩn cùa cao chiêt tỏng cao phân đoạn từ nụ Hòe Kết đạt được: - Xác định hệ dung môi sử dụng chiết cao cho hàm lượng cao đạt chất lượng methanol, ethyl acetate - Xác định ừong nụ Hịe có flavonoid (rutin), saponin, tannin, tinh dầu acid hữu - Xác định hàm lượng polyphenol tổng số có ơong cao chiết nụ Hịe 480,11 mg GAE/g - Xác định cao chiết từ nụ Hịe Sophora Janonica L cỏ hoạt tính kháng khuẩn cao tổng methanol, CPĐ EA CPĐ hexan - Xác định cao chiết nụ Hòe Sophora Janonica L có hoạt tính kháng oxy hóa Cao tổng methanol có khà kháng oxy hóa mạnh nhất, CPĐ nước có khả kháng oxy hóa thấp nhát iii MỤC LỤC Trang BÌA LĨT .i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT V DANH SÁCH CÁC HÌNH vi DANH CÁC BẢNG vii MỞ ĐÀU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nôi dung thực Ý ngĩa đề tài Chuông 1: TỎNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Hòe 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Phân bố thu hái 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Công dụng 1.2 Các gghiên cứu nước nước 1.2.1 Nghiên cứu nước 1.2.2 Nghiên cứu nước 1.3 Giới thiệu sơ chùng vi khuẩn 1.3.1 Chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus (Tụ cầu vàng) 1.3.2 Chủng vi khuẩn nhôm Enterobacteriaceae (Họ vi khuẩn đường ruột) 1.3.3 Chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa (Trực khuẩn mủxanh) 1.3.4 Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis 10 Chuông 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cửu 11 iv 2.1 Thởi gian, địa điếm vật liệu nghiên cứu 11 2.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 11 2.2.1 Thiết bị 11 2.2.2 Dụng cụ 12 2.2.3 Hóa chất 12 2.3 Nội dung thực 12 2.4 Phương pháp nghiên cửu 13 2.4.1 Phương phápthu nhận cao tổng cao phin đoạn từ nụ Hịe 13 2.4.2 Tiến hành quy trình 14 2.5 Định tính sơ thành phần hóa học 14 2.5.1 Định tính thành phần hóa học có nụ Hòe 14 2.5.2 Định tính rutin 16 2.5.2.1 Phương pháp phản ứng màu đặc trưng 16 2.5.2.2 Phương pháp TLC (Thinlayer Chromatography) 17 2.6 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tồng số 18 2.7 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa cao chiết nụ Hịe ưên mơ hình DPPH 19 2.8 Khảo sát khả kháng khuẩn cao chiết từ nụ Hịe 20 Chng 3: KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Thu nhận cao chiết tổng cao phân đoạn từ cao tông 22 3.2 Định tính thành phần hóa học có ừong dịch chiết nụ Hòe 23 3.3 Kết định tính rutin 23 3.3.1 Định tính phản ứng màu đặc trưng 23 3.3.2 Định tính phương pháp sắc ký lớp mòng (TLC) 24 3.4 Định polyphenol tổng số có ưong dịch chiết 25 3.5 Xác định khả kháng oxy hóa cùa cao chiết 27 3.6 Xác định khả kháng khuẩn cao chiết ưèn đĩa thạch 30 KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 PHỤ LỤC 37 V DANH SÁCH CHƠ VIÉT TẮT AG: Acid gallic CPĐ: Cao phân đoạn DMSO: Dimethyl sulfoxyde DPPH: Gốc tự - 2,2 -diphenyl - - pic-Tnydrazyl EA: Ethyl acetate GAE: Đưong lượng Gallic acid - Gallic Acid Equivalent HPLC: Sắc ký hiệu cao - High Performance Liquid Chromatography IC50: Nồng độ ức chế 50% vi khuầTu nam gốc tự -Half maximal inhibitory concentration OD: Mật độ quang - Optical Density' Oxh Oxy hóa PL Phụ lục STT: Số thứ tự TLC: Sắc lý lớp mỏng - Thin Layer Chromatography TPHH: Thành phần hóa học uv Tia từ ngoại - Ultraviolet vi DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình Hình 1.1: Cây Hịe Sophora japonica L Hình 1.2: cấu tạo số hoạt chất có Hịe Hình 1.3: Vi khuẩn Staphylococcus aureus Hình 1.4: Vi khuẩn Samonella typhi Escherichia coll Hình 1.5: Vi khuẩn Pseudonomas aeruginosa 10 Hình 1.6: Vi khuẩn Bacillus subtilis 10 Hình 2.1: Nụ Hịe sấy khơ .11 Hình 2.2: Sơ đồ quy trình bố trí thí nghiệm 12 Hình 2.3: Sơ đồ quy trình thu nhân cao chiết nụ Hòe 13 Hình 2.4: Sơ đồ quy trình thu nhận dịch chiết nụ Hịe để phần tích TPHH 15 Hình 2.5: Phản ứng trung hòa gốc DPPH .19 Hình 3.1: Hình ảnh vết rutin chạy ttên bàn sắc lý lớp mông 25 Hình 3.2: Đồ thị đường chuẩn acid gallic 26 Hình 3.3: Khả bắt gốc tự rutin có cao tổngmethanol 27 Hình 3.4: Khả bắt gốc tự rutin có CPĐ hexan 27 Hình 3.5: Khả bắt gốc tự rutin có CPĐ chloroform 28 Hình 3.6: Khả bắt gốc tự rutin có CPĐ EA 28 Hình 3.7: Khả bắt gốc tự rutin có CPĐ nước 29 Hình 3.8: Đồ thị giá trị IC50của cao tổng CPĐ (đơn vị mgml) .29 vii DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng Bảng 2.1: Môi trường nuôi cấy vi khuẩn 20 Bảng 3.1: Khảo sát hàm lượng cao chiết dưng môi methanol 22 Bảng 3.2: Khảo sát hàm lượng thu hồi sau chiết kng-lòng cao chiết methaoL 22 Bảng 3.3: Kết phân tích sơ TPHH nụ Hòe 23 Bảng 3.4: Ket định tính rutin 24 Bảng 3.5: Hàm lượng polyphenol có cao tong methanol 26 Bảng 3.6: Kết khảo sát khả kháng khưin cao chiêt 30 viii MỞĐẢL Đặt vấn đề Việt Nam nước thuộc khu vực nhiệt đớt gịỏ mùa ẩm nên có hệ thực vật phát triên đa dạng Trong đó, nguôn tài nguyên thực vi: sừ dụng làm dược liệu vô phong phú Cây dược liệu sừ dụng rệng ròi gắn liền với sống hàng ngày cùa người, sử dụng trực tiếp cho việc iảm thuốc, thực phẩm, ứng dụng quan trọng khác công nghệ dược phẩm, thực phầm chức Mặt khác, nhu cầu nguồn dược liệu ngành công nghiệp ngày cảng nhiều Tuy nhiên, việc nghiên cứu, khai thác để đưa vảo sản xuất chế biến loại có cơng dụng phịng trị bệnh nước ta nhiều hạn chế Do việc sâu vào nghiên cứu để phát thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi có ý nghĩa lớn mặt khoa học thực tiễn, góp phần thúc đẩy phát triền Y học Việt Nam Cây Hòe {Sophora janonica L.) từ lâu dân gian sử dụng vị thuốc với tác dụng cầm máu, giảm bớt tính thẩm thau mao mạch làm tăng độ bền thành mao mạch, chống viêm, chống loét da dày chống dị ứng, chống oxy hóa Ngồi hong cịn chứa nhiều họp chất khác nhau, đặc biệt rutin (6 - 30%), hợp chất tự nhiên có nhiều hoạt tính sinh học bật kháng khuẩn, kháng oxy hóa Tuy nhiên, Hịe xem loại thuốc Đông y Nhằm tạo tiền đề khoa học cho sàn phẩm ứng dụng từ cày dược liệu này, thực đề tài “Khảo sát sơ thành phần hóa học hoạt tính sinh học cao chiết phân đoạn cao cày Hòe {Sophora japonica L.)” Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát sơ thành phần hỏa học hoạt tính sinh học cao chiết phân đoạn cao Hòe {SophoraJaponica L.) KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ Kết luận - Hiệu suất chiết cao methanol thu ỉà 24.64% Hiệu suất thu CPĐ thu là: CPĐ hexan 2,4%, CPĐ chlorofcra 24.8%, CPĐ EA 40% CPĐ nước 32,2% - Kết khảo sát sơ thành phần hố học hoạt chất có nụ H, bước đầu định tính thành phần hóa học chất có nụ Hịe như: flavonoid (rutin), saponin, tinh dầu, tannin acid hữu Băng phương pháp sắc lý lớp mỏng (TLC) khẳng định thêm có mặt chắn cúa rutin nụ Hòe - Xác định hàm lượng tổng số polyphenol có ưong cao chiết tổng methanol từ nụ Hoè 480,11 mg G AE/g - Xác định hoạt tính chống oxy hóa theo phương pháp loại gốc tự DPPH Kết giá trị IC50 cao chiết tổng methanol IC50 = 0.1852 mg ml có khả bắt gốc tự mạnh Trong cao chiết phân đoạn CPĐ EA có khả bắt gốc tự mạnh nhất, giá trị IC50 là: CPĐ hexan IC50 = 3.048 mg/ml, CPĐ chloroform IC50 = 0,4818 mg/ml, CPĐ EA IC50 = 0.332 mg/ml, CPĐ nước IC50 = 1,867 mg/ml - Xác định hoạt tính kháng khuẩn cao chiết tổng cao phân đoạn Bằng phương pháp thử kháng khuẩn đĩa thạch với năm loại vị khuẩn chi thị, kết luận mẫu cao phân đoạn chiết dung môi ethyl acetate cho khả kháng khuẩn tốt so với dung mơi cịn lại - Từ khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa kháng khuẩn ưên cao chiết tổng cao chiết phân đoạn cho thấy hệ dung mơi dùng để chiết cao có ảnh hưởng đến chất lượng cao thu sau trình chiết thu nhận cao Cụ thể hai dung môi methanol ethyl acetate cho hàm lượng cao đạt chất lượng tốt 31 Kiến nghị Khảo sát mẫu số dung mói khác đe tăng hàm lượng trích ly Khảo sát nồng độ ức che toi thiếu cua cao chiết, thử nghiệm số chủng vi khuẩn gây bệnh khác, khảo sát kha náng chống ung thư, bệnh viêm gan, viêm khớp cúa Hòe Tiếp tục nghiên cứu thêm để phát triển thành sàn phẩm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm chức năng, nước uống có tác dụng hệ tim mạch, đường huyết 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Bộ Y tê, 2002 Dirợc điển Việt Nam /// Ha Nội Đồ Tất Lợi, 1999 Những cày thuẵc ’•/ thuốc Việt Nam NXB Y bọc ĩr 29* GS.TS Lê Huy Chính, 2013 Vi sh:h vật Y học, tái băn lần thử ỉ±iù NX3 Hà Nội, tr 133-141, 165-175.218-220 b: