Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học một số chủng vi nấm phân lập ở vùng biển Bái Tử Long, Quảng Ninh

Bài viết Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học một số chủng vi nấm phân lập ở vùng biển Bái Tử Long, Quảng Ninh trình bày nghiên cứu được thực hiện nhằm khảo sát sơ bộ thành phần hóa học các chủng vi nấm phân lập từ vùng biển Bái Tử Long, Quảng Ninh bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Công trình nghiên cứu KHOA HC TRNG I HC Y DƯỢC HẢI PHỊNG KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HĨA HỌC MỘT SỐ CHỦNG VI NẤM PHÂN LẬP Ở VÙNG BIỂN BÁI TỬ LONG, QUẢNG NINH Vũ Thùy Dung1, Hoàng Thị Hồng Liên2, Đoàn Thị Mai Hương3, Lưu Mạnh Hùng1, Nguyễn Văn Hùng1, Cao Đức Tuấn1 TÓM TẮT9 Mục tiêu: Nghiên cứu thực nhằm khảo sát sơ thành phần hóa học chủng vi nấm phân lập từ vùng biển Tử Long, Quảng Ninh kỹ thuật sắc ký l ng hiệu cao Đối tượng phương pháp nghiên cứu: ối tượng gồm 25 chủng vi nấm biển phân lập từ vùng biển vịnh Tử Long, Quảng Ninh năm 2019 Phương pháp nghiên cứu hóa học sinh học thực nghiệm Kết kết luận: 25 chủng vi nấm biển nghiên cứu có thành phần hóa học sơ tương tự chủng vi nấm biển Penicillium chrysogenum M612, bao gồm hợp chất cylodipeptide có độ phân cực trung bình cyclo(L-Pro-L-Leu), cyclo-(L-Pro-L-Val), cyclo-(LAla-L-Pro), cyclo-(L-Pro-L-ILe), cyclo-(L-ProL-Phe), cyclo-(D-Pro-D-Phe) cyclo-(L-Pro-LTyr) ên cạnh đó, số chủng có hợp chất có độ phân cực cao (M401, M402, M403, M431, M447, M571 M598) Tuy nhiên, kỹ thuật HPLC kh ng phát hợp chất có hàm lượng nh , để nâng cao hiệu nghiên cứu, áp dụng phương pháp phân tích Trường Đại Học Y Dược Hải Phịng Trường Đại học Bn Ma Thuột Viện Hóa Sinh Biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Văn Hùng, Cao ức Tuấn Email:nvhung@hpmu.edu.vn; cdtuan@hpmu.edu.vn Ngày nhận bài: 11.2.2022 Ngày phản biện khoa học: 19.3.2022 Ngày duyệt bài: 25.5.2022 58 có độ nhạy, độ đặc hiệu cao LC-MS, GC-MS Từ khóa: Tử Long, cylodipeptide, HPLC, vi nấm biển SUMMARY PRELIMINARY SCREENING OF CHEMICAL CONSTITUENTS OF MARINE-DERIVED FUNGI ISOLATED FROM BAI TU LONG SEA, QUANG NINH Aims: The study was done to determine the preliminary chemical constituents of marinederived fungi isolated from Bai Tu Long sea, Quang Ninh by high performance liquid chromatography Subject and methods: The research subjects were 25 marine-derived fungi strains isolated from Bai Tu Long sea, Quang Ninh in 2019, utilizing experimental methods in chemistry and biology Results and conclusion: The main chemical constituents of 25 marinederived fungi strains were similar to that of strain Penicillium chrysogenum M612, including medium polarized cylodipeptides, cyclo-(L-ProL-Leu), cyclo-(L-Pro-L-Val), cyclo-(L-Ala-LPro), cyclo-(L-Pro-L-ILe), cyclo-(L-Pro-L-Phe), cyclo-(D-Pro-D-Phe) and cyclo-(L-Pro-L-Tyr) Besides, there were several strains containing higher polarized compouds, such as M401, M402, M403, M431, M447, M571 M598 However, the high performance liquid chromatography technique can not detect low concentration compounds, thus, to increase the research outcomes, more sensitive and selective TạP CHí Y học việt nam tP 515 - tháng - sè ĐẶC BIỆT - 2022 methods like LC-MS, GC-MS should be applied Keywords: Bai Tu Long, cylodipeptide, HPLC, marine-derived fungi nấm biển phân lập từ vùng biển Tử Long, Quảng Ninh kỹ thuật sắc ký l ng hiệu cao (HPLC) I ĐẶT VẤN ĐỀ Trong khu n khổ nhiệm vụ hợp tác quốc tế Trường ại học Y Dược Hải Phòng Trường ại học Dược, ại học Quốc gia Chungnam, Hàn Quốc, khu vực biển Tử Long, Quảng Ninh phê duyệt để thu m u phục vụ nghiên cứu, sàng lọc hợp chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm biển [1] ằng phương pháp lặn sâu có khí tài SCU A, từ ngày 27/8/2019 đến ngày 02/9/2019, 128 m u vật gồm 15 m u nước, 15 m u trầm tích 98 m u sinh vật biển thu thập [2] Từ m u biển thu nhận, 25 chủng vi nấm biển phân lập phịng thí nghiệm Sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật (VSV) kiểm định cho thấy 25/25 chủng vi nấm biển phân lập thể hoạt tính, đó, 4/25 chủng ức chế 4/7 chủng VSV thử nghiệm, 6/25 chủng ức chế 3/7 chủng VSV thử nghiệm [3] ây nguồn nguyên liệu tốt để thực nghiên cứu Chủng Penicillium chrysogenum M612 (ức chế 4/7 chủng VSV thử nghiệm, MIC: 128 – 256 µg/mL) lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học, từ phân lập hợp chất cyclodipeptide biết, hợp chất có hoạt tính kháng VSV [4] Mặc dù đạt kết ban đầu, nhiên, phương pháp tìm kiếm hợp chất mới, tiềm dựa định hướng hoạt tính sinh học d n đến việc phân lập hợp chất biết, gây tốn thời gian, nguồn lực nghiên cứu ể bổ sung liệu phục vụ sàng lọc hiệu hơn, nghiên cứu thực với mục tiêu: Khảo sát thành phần hóa học sơ chủng vi II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng địa điểm nghiên cứu ối tượng nghiên cứu 25 chủng vi nấm biển phân lập từ m u biển thu nhận vùng biển Tử Long, Quảng Ninh năm 2019 [2] Nghiên cứu thực trường ại học Y Dược Hải Phịng; Viện Hóa Sinh iển Viện Hóa học, viện Hàn lâm Khoa học C ng nghệ Việt Nam 2.2 Thiết bị hố chất Các hóa chất sử dụng cung cấp từ hãng Hidia (Ấn ộ), Sigma-Aldrich (Mỹ), ức Giang (Việt Nam) Thành phần hóa học sơ xác định hệ thống HPLC Shimadzu, đầu dị UV bước sóng 205 nm 254 nm, cột Phenomenex C18 150 x 4.6 mm 2.3 Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nuôi cấy vi nấm biển lượng nhỏ (500 mL dịch nuôi cấy) Ống lưu giữ chủng vi nấm - 80 oC đem rã đ ng từ từ đá, sau cấy chấm vào đĩa petri chứa m i trường tương ứng với m i trường phân lập [5], nu i tĩnh 28 oC ngày Từ đĩa petri, tiến hành nhân giống cấp cách cấy khuẩn lạc từ đĩa petri vào bình tam giác chứa 10 mL m i trường nu i cấy dạng l ng tương ứng, sau nu i lắc với tốc độ 100 vòng/ph t nhiệt độ 28oC 10 đến 14 ngày để thu dịch nhân giống cấp Từ dịch nhân giống cấp 1, tiến hành nu i cấy lượng nh cách bổ sung dịch nhân giống cấp vào bình tam giác chứa 500 mL m i trường nu i cấy dạng l ng tương ứng, sau nu i lắc với tốc độ 100 vịng/ph t nhiệt độ 28 oC 10 đến 14 ngy 59 Công trình nghiên cứu KHOA HC TRNG I HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG Phương pháp tạo cặn chiết Sau thời gian nu i cấy, tiến hành thu nhận dịch nu i cấy (500 mL) chủng vi nấm biển Dịch nu i cấy lọc qua màng lọc, sau chiết với dung m i ethyl acetate (EtOAc; 300 mL x lần) Dịch chiết sau làm kh áp suất giảm thu cặn chiết tương ứng Phương pháp xác định sơ thành phần hóa học HPLC Cặn chiết chủng vi nấm hòa tan dung m i MeOH nồng độ mg/mL, lọc màng lọc (0,45µm) 10 µL m u đưa lệ hệ thống HPLC Shimadzu, cột Phenomenex C18 150 × 4.6 mm, thực phân tích theo quy trình ( ảng 1) với pha động MeOH/nước, tốc độ dòng mL/ph t Sắc ký đồ ghi nhận bước sóng 205nm Phương pháp c ng sử dụng để xác định thời gian lưu số chất đối chứng (các hợp chất cyclodipeptide phân lập từ chủng vi nấm biển M612 [4]) Bảng Chương trình chạy phân tích HPLC TT Thời gian Tỷ lệ MeOH (%) 40 100 50 100 51 5 60 III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết nuôi cấy, tạo cặn chiết chủng vi nấm biển vùng Bái Tử Long ầu tiên, chủng vi nấm biển hoạt hóa nu i cấy quy m 500 mL theo phương pháp m tả Dịch nu i cấy chiết dung m i EtOAc, loại dung m i áp suất giảm thu cặn chiết tương ứng Thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật cho thấy m u cặn chiết có hoạt tính ức chế chủng vi sinh vật kiểm định thử nghiệm ( ảng 2) Bảng Kết nuôi cấy tạo cặn chiết chủng vi nấm biển Bái Tử Long Môi Cặn Môi Cặn Môi TT Mẫu trường EtOAc TT Mẫu trường EtOAc TT Mẫu trường nuôi (g) nuôi (g) nuôi CZ 0,7256 10 M447 ISP2 0,6772 19 M581 A1 M401 0,3684 11 M448 MEA 0,1981 20 M583 MEA M402 PDA 0,7775 21 M584 ISP2 M403 SWA 0,5799 12 M501 ISP2 0,6394 13 M508 A1 0,7102 22 M586 PDA M404 PDA A1 0,4139 14 M516 A1 0,1687 23 M598 ISP2 M406 0,5644 15 M520 PMDA 0,9134 24 M601 PDA M425 ISP2 CZ 0,8121 16 M561 PMDA 0,1979 25 M612 MEA M428 0,1328 17 M571 MEA 0,5808 M431 ISP2 0,6913 M432 PMDA 0,8284 18 M574 A1 60 Cặn EtOAc (g) 0,2944 0,1996 0,1160 0,2443 0,8900 0,4571 0,3740 T¹P CHÝ Y häc viƯt nam tẬP 515 - th¸ng - sè ĐẶC BIỆT - 2022 3.2 Kết xác định thành phần hóa học sơ chủng vi nấm biển Bái Tử Long Thành phần hóa học sơ chủng vi nấm biển xác định HPLC theo phương pháp m tả Trên sắc ký đồ 25 chủng nghiên cứu cho thấy pic thời gian lưu tương tự (Hình 2), đó, chủng có thành phần hóa học tương đối giống Hình Sắc ký đồ (205 nm) cặn chiết chủng vi nấm biển số đến 13 Thành phần hóa học sơ 25 chủng trung bình: cyclo-(L-Pro-L-Leu), cyclo-(Lvi nấm biển nghiên cứu c ng so sánh Pro-L-Val), cyclo-(L-Ala-L-Pro), cyclo-(Lvới hợp chất phân phân lập từ chủng vi Pro-L-ILe), cyclo-(L-Pro-L-Phe), cyclo-(Dnấm biển M612 (Hình 3) [4] ối chiếu sắc Pro-D-Phe) cyclo-(L-Pro-L-Tyr) Bên ký đồ hợp chất với sắc ký đồ cạnh đó, sắc ký đồ số chủng có pic xuất chủng vi nấm phân lập từ vùng biển thời gian lưu 22-32 ph t, tương ứng Tử Long (Hình 4) cho phép xác định sơ với hợp chất có độ phân cực cao hơn, thành phần chủ yếu chủng vi nấm bao gồm: M401, M402, M403, M431, M447, nghiên cứu cyclodipeptide có độ phân cực M571 M598 Hình Sắc ký đồ (205 nm) cặn chiết chủng vi nấm bin s 14 n 25 61 Công trình nghiên cứu KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHỊNG Hình Cấu trúc hợp chất phân lập từ chủng vi nấm biển M612 [4] Hình Sắc ký đồ (205 nm) cặn chiết chủng vi nấm biển M612 hợp chất phân lập từ chủng vi nấm M612 IV BÀN LUẬN Kết nghiên cứu cho thấy, 25 chủng vi nấm biển Tử Long có hoạt tính kháng VSV khác nhau, chủng vi nấm có thành phần hóa học sơ tương đối giống nhau, đặc biệt hợp chất có độ phân cực trung bình (được rửa giải kh i cột sắc ký khoảng 5-17 ph t, tương ứng với 10-40% MeOH H2O) Dựa đặc điểm sắc ký đồ chủng vi nấm biển nghiên cứu, so sánh với thời gian lưu hợp chất cyclodipeptide phân lập từ chủng M612 cho phép dự đoán, thành phần hóa học số chủng nghiên cứu cịn có hợp chất có độ phân cực cao Kết c ng phù hợp với nghiên cứu nhóm chủng vi nấm biển phân lập 62 từ m u trầm tích biển Cát [6] Tuy nhiên, phương pháp xác định thành phần hóa học sơ kỹ thuật HPLC m tả thực cặn chiết từ 500 mL dịch nu i cấy Phương pháp có hạn chế chưa phát chất có hàm lượng nh , tín hiệu tương ứng với chất có cường độ thấp, dễ l n với tạp chất hay đường sắc ký đồ Nhận định kiểm chứng chủng vi nấm biển Aspergillus sp M445 (có thành phần hóa học sơ tương đối giống chủng M612) [6] Trong trình phân lập, chủng M445 nu i cấy quy m 20L dịch nu i cấy, kết hợp với b qua phân đoạn có chứa hợp chất cyclodipeptide phân lập từ chủng vi nấm biển M612, phát T¹P CHÝ Y häc viƯt nam tẬP 515 - th¸ng - sè ĐẶC BIỆT - 2022 hợp chất, bao gồm hợp chất có hoạt tính kháng sinh tốt germicidine A [7] Mặc dù chưa tìm chất có hoạt tính việc tìm hợp chất germicidine A từ chủng M445 khẳng định quan trọng ưu/nhược điểm phương pháp xác định thành phần hóa học sơ kỹ thuật HPLC Như vậy, hiệu sàng lọc c ng xác định thành phần hóa học nghiên cứu tìm kiếm hợp chất mới, tiềm từ tự nhiên nâng cao nhờ áp dụng đồng thời nhiều phương pháp: (1) sàng lọc theo định hướng hoạt tính sinh học, sử dụng phép thử tế bào, mà kh ng quan tâm đến đích tác dụng chất thử Dựa vào kết thử nghiệm hoạt tính lựa chọn đối tượng nghiên cứu tiềm Phương pháp gọi phát triển thuốc bề mặt (phenotyping drug discovery) (2) Xác định thành phần hóa học sơ kỹ thuật HPLC (3) Sử dụng kỹ thuật/phương pháp phân tích có độ nhạy, độ đặc hiệu cao để xác định sơ thành phần hóa học đối tượng nghiên cứu tiềm năng: Sắc ký l ng ghép nối khối phổ (LC-MS), sắc ký khí ghép nối khối phổ (GC-MS) V KẾT LUẬN ã xác định thành phần hóa học sơ 25 chủng vi nấm phân lập từ m u biển thu nhận vùng biển Tử Long, Quảng Ninh, đó, thành phần hóa học hợp chất cycodipeptide có độ phân cực trung bình cyclo-(L-Pro-L-Leu), cyclo-(L-Pro-L-Val), cyclo-(L-Ala-L-Pro), cyclo-(L-Pro-L-ILe), cyclo-(L-Pro-L-Phe), cyclo-(D-Pro-D-Phe) cyclo-(L-Pro-LTyr) ên cạnh đó, số chủng có hợp chất có độ phân cực cao (M401, M402, M403, M431, M447, M571 M598) Tuy nhiên, kỹ thuật HPLC kh ng phát hợp chất có hàm lượng m u nh , để nâng cao hiệu nghiên cứu, trình khảo sát nên áp dụng thêm phương pháp phân tích có độ nhạy, độ đặc hiệu cao LC-MS, GC-MS Lời cảm ơn: Nghiên cứu hoàn thành với tài trợ kinh phí từ đề tài mã số HNQT/SP P/11.19 ộ Khoa học C ng nghệ Việt Nam đề tài mã số HPMU/CS/22.164 Trường ại học Y Dược Hải Phòng TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Khoa học Công nghệ, Quyết định số 975/Q - KHCN ngày 25/4/2019, Phê duyệt tổ chức chủ trì, cá nhân chủ nhiệm, kinh phí, phương thức khốn chi thời gian thực nhiệm vụ KH&CN thuộc Chương trình hợp tác nghiên cứu song phương đa phương KH&CN đến năm 2020 Đỗ Anh Duy, Cao Đức Tuấn cộng sự, Nghiên cứu phân lập số chủng vi nấm biển có hoạt tính kháng viêm từ vùng biển Tử Long Tạp chí N ng nghiệp Phát triển Nông thôn, 2021 Tháng 11-2021: p 112-122 Cao Đức Tuấn, Hoàng Thị Hồng Liên, Lê Thị Hồng Minh cộng sự, Sàng lọc định danh chủng vi nấm biển có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định từ m u trầm tích sinh vật biển thu thập thuộc vùng biển Tử Long, Việt Nam Tạp chí C ng nghệ Sinh học, 2021 19(4): p 237-242 Bach Thi Nhu Quynh, Cao Duc Tuan, et al Cyclodipeptides Isolated From a Marinederived Fungus Penicillium chrysogenum M612 of Bai Tu Long Sea, Quang Ninh, Vietnam In: Van Toi, V., Nguyen, TH., Long, V.B., Huong, H.T.T (eds) 8th International Conference on the Development of Biomedical Engineering in Vietnam BME 63 ... KẾT LUẬN ã xác định thành phần hóa học sơ 25 chủng vi nấm phân lập từ m u biển thu nhận vùng biển Tử Long, Quảng Ninh, đó, thành phần hóa học hợp chất cycodipeptide có độ phân cực trung bình... 0,3740 T¹P CHÝ Y häc vi? ?t nam tẬP 515 - th¸ng - sè ĐẶC BIỆT - 2022 3.2 Kết xác định thành phần hóa học sơ chủng vi nấm biển Bái Tử Long Thành phần hóa học sơ chủng vi nấm biển xác định HPLC theo... 25 chủng vi nấm biển phân lập từ m u biển thu nhận vùng biển Tử Long, Quảng Ninh năm 2019 [2] Nghiên cứu thực trường ại học Y Dược Hải Phịng; Vi? ??n Hóa Sinh iển Vi? ??n Hóa học, vi? ??n Hàn lâm Khoa học