Đề tài tiến hành khảo sát sơ bộ thành phần hóa học và sàng lọc một số tác dụng sinh học in vitro của các bộ phận Cam thảo Đá Bia. Mời các bạn cùng tham khảo!
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 Nghiên cứu KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ SÀNG LỌC MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC IN VITRO CÂY CAM THẢO ĐÁ BIA (JASMINANTHES TUYETANHIAE T.B TRAN & RODDA, APOCYNACEAE) Thái Hồng Đăng1,2,3, Nguyễn Lê Thanh Tuyền4, Đỗ Thị Hồng Tươi1, Trần Thị Vân Anh1 TÓM TẮT Đặt vấn đề: Cam thảo Đá Bia (CTĐB) Jasminanthes tuyetanhiae Apocynaceae dược liệu đặc hữu vùng núi Đá Bia - Phú Yên, rễ có vị dân gian dùng chữa ho thay Cam thảo bắc thuốc Mục tiêu: Đề tài tiến hành khảo sát sơ thành phần hóa học sàng lọc số tác dụng sinh học in vitro phận CTĐB Phương pháp nghiên cứu: Rễ, thân CTĐB chiết với dung môi khác Khảo sát sơ thành phần hóa học theo phương pháp Ciuley cải tiến so sánh thành phần hóa học phận sắc ký lớp mỏng Khảo sát tác dụng chống oxi hóa thử nghiệm DPPH, tác dụng độc tế bào phương pháp MTT, tác dụng kháng viêm mơ hình ức chế sản sinh NO từ tế bào bạch cầu RAW 264.7, kháng khuẩn kháng nấm phương pháp khuếch tán đĩa thạch Kết quả: Các phận rễ, thân, CTĐB có thành phần saponin Rễ cho kết chống oxi hóa kháng viêm tốt so với thân Cao chiết dicloromethan từ có tiềm tác dụng dịng tế bào ung thư MDA-MB-231 RD Các cao chiết từ ba phận khơng thể hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm chủng vi sinh vật thử nghiệm Kết luận: Rễ, phận dùng CTĐB thể tác dụng kháng viêm tốt, tác dụng liên hệ với thành phần hóa học saponin Từ khóa: Cam thảo Đá bia, chống oxi hóa, độc tính tế bào, kháng viêm, RAW 264.7, kháng khuẩn, kháng nấm ABSTRACT PRELIMINARY SCREENING OF PHYTOCHEMICAL CONSTITUENTS AND BIOACTIVITIES IN VITRO OF JASMINANTHES TUYETANHIAE T.B TRAN & RODDA, APOCYNACEAE Thai Hong Dang, Nguyen Le Thanh Tuyen, Do Thi Hong Tuoi, Tran Thi Van Anh * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol 25 - No - 2021: 11 - 19 Introduction: Cam thao Da Bia (CTDB) Jasminanthes tuyetanhiae T.B.Tran & Rodda, Apocynaceae is an endemic plant of the Da Bia mountainous region in Phu Yen province The roots of this plant with sweet taste are used as a substitution for licorice in traditional medicine Objective: Preliminary screening of phytochemical constituents and bioactivities in vitro of J tuyetanhiae were conducted to establish a foundation for further studies Methods: Roots, stems and leaves of CTDB were extracted with different solvents Preliminary phytochemical screening was conducted by the improved Ciuley method and thin layer chromatography Antioxidant activity was evaluated by DPPH test, cytotoxicity activity was evaluated by MTT method; anti Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh 2Trung tâm nghiên cứu sản xuất Dược liệu miền Trung Khoa Dược, Trường Đại học Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh 4Trung tâm Khoa học Cơng nghệ Dược Sài Gịn (Sapharcen) Tác giả liên lạc: PGS.TS.DS Trần Thị Vân Anh ĐT: 0918852989 Email: ttvananh@ump.edu.vn B - Khoa học Dược 11 Nghiên cứu Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 inflammatory activity was accessed by lipopolysaccharide-induced production of NO in RAW 264.7 macrophages method, antibacterial and antifungal test was conducted with agar well diffusion method Results: Roots, stems and leaves of CTDB have the same main constituents as saponin The result of in vitro test indicated that roots and leaves showed better antioxidant and anti-inflammatory activity than stems The CTDB leaf extract showed the potential effects on MDA-MB-231 and RD cancer cell Extracts from three plant parts did not show antibacterial and antifungal activity Conclusions: The root of CTDB, the used part of this plant, showed the anti-inflammatory activity which may relate with the main chemical constituent as saponin Keywords: Cam thao Da Bia, antioxidant, cytotoxicity, anti-inflammatory, antibacterial, antifungal ĐẶT VẤNĐỀ ĐỐI TƯỢNG- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU Cam thảo Đá Bia (CTĐB) loài dược liệu đặc hữu vùng núi Đá Bia - Phú Yên, phần rễ có vị dân gian sử dụng để chữa ho thay Cam thảo bắc thuốc(1) Do tác dụng độc đáo, CTĐB bị khai thác triệt để dẫn đến vài cá thể ỏi xếp vào sách đỏ Việt Nam năm 2007 với tên CTĐB Telosma procumbens (Blanco) Merr Asclepiadaceae (EN B1+2B)(2) Tháng 8/2017, nhóm nghiên cứu thuộc Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Dược liệu miền Trung với chuyên gia TS Trần Thế Bách thu mẫu hoa, CTĐB định danh lại mang danh pháp khoa học Jasminanthes tuyetanhiae T.B Tran & Rodda Apocynaceae(3) Đối tượng nghiên cứu Thành phần hóa học CTĐB hợp chất có cấu trúc khung C21 steroid glycosid(4,5) phổ biến thuộc họ Apocynaceae Tác dụng dược lý nhóm hợp chất nghiên cứu nhiều chi Jasminanthes mucronata thể hoạt tính kháng viêm, ức chế tăng cường miễn dịch, chống thải ghép(6-8) Hiện nay, chưa có nghiên cứu tác dụng dược lý liên quan đến CTĐB, công dụng CTĐB dựa kinh nghiệm lương y địa phương Nhằm mục đích bảo tồn, phát triển dược liệu quý, mở đầu cho nghiên cứu ứng dụng chữa bệnh tương lai, thực đề tài “Khảo sát sơ thành phần hóa học sàng lọc số tác dụng sinh học in vitro cao chiết Cam thảo Đá Bia Jasminanthes tuyetanhiae T.B.Tran & Rodda Apocynaceae” 12 Mẫu Cam thảo Đá Bia thu hái từ hệ sinh thái núi Đá Bia, Đơng Hịa, Phú n vào tháng 8/2017, định danh mặt hình thái dựa cơng bố TS Trần Thế Bách(3) Hóa chất 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH, Sigma-Aldrich, Mỹ), acid ascorbic (Viện kiểm nghiệm); - (4,5-dimethylthiazol 2-yl) -2,5diphenyl tetrazolium bromid (MTT, Sigma), Paclitaxel (Anzatax, Mayne Pharma, New Zealand); Dòng tế bào ung thư vú người (MDA-MB-231, ATCC), dòng tế bào ung thư vân (RD, Viện Pasteur), tế bào thận heo bình thường (LLC-PK1, Đại học Seoul, Hàn Quốc); Tế bào RAW 264.7 (ATCC TIB-71), Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco), phosphat buffer salin (PBS, Gibco), fetal bovine serum (FBS, Gibco), lipopolysaccharid (LPS, Sigma), dexamethason (bộ môn Kiểm nghiệm – Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh), N-alpha-naphthyl-ethylendiamin (Griess, BDH Chemical), Sulfanilamid (BDH Chemical), DMSO (Merck); Muller Hinton Agar (Himedia), Staphylococcus aureus nhạy cảm methicillin (ATCC 29213), S.aureus đề kháng methicillin (ATCC 33591), Streptococcus pneumoniae (ATCC 44619), Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), nấm men Candida albicans (ATCC 10231) (bộ mơn Vi kí sinh Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh) B - Khoa học Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 Phương pháp nghiên cứu Khảo sát sơ thành phần hóa học Dược liệu chiết với dung mơi có độ phân cực tăng dần ether, cồn nước, xác định nhóm hợp chất phương pháp Ciuley cải tiến(9) Chiết xuất cao thử nghiệm Các phận rễ (R), thân (T) (L) cân 50 g chiết siêu âm 10 phút với dicloromethan (D) lần (200 ml, 200 ml, 100 ml), dịch chiết gộp chung cô áp suất giảm để loại dung môi Sau chiết với dicloromethan (D), nguyên liệu phơi khô chiết tiếp với methanol (M) nước cất (H) với điều kiện tương tự Các mẫu R, T L chiết siêu âm (10 phút x lần), riêng lẻ với dung môi ethanol Nghiên cứu 96%, ethanol 70% ethanol 50% với điều kiện tương tự Dịch chiết cô đến thể chất cao đặc, đánh giá hàm ẩm cân xác định độ ẩm hồng ngoại Kí hiệu mẫu trình bày Bảng So sánh thành phần hóa học phận sắc ký lớp mỏng (SKLM) Thành phần hóa học cao chiết D, M, H từ phận rễ, thân, CTĐB so sánh phương pháp sắc kí lớp mỏng Cao D sử dụng hệ dung môi CHCl3-MeOH (9:1), cao M sử dụng hệ dung môi CHCl3-MeOH-H2O (65:35:10, lớp dưới) cao H sử dụng hệ dung môi BuOH-AcOH-H2O (4:1:5, lớp trên) Phát thuốc thử H2SO4 10%, sấy nhiệt độ 110 °C đến vết, quan sát mỏng ánh sáng thường đèn UV 365 nm Bảng Kí hiệu mẫu cao thử nghiệm sinh học Dung mơi Bộ phận Rễ Thân Lá Dichlorometha n Methanol Nước cất Ethanol 96% Ethanol 70% Ethanol 50% RD TD LD RM TM LM RH TH LH RA TA LA RB TB LB RC TC LC Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa Thử nghiệm thực theo nghiên cứu Yoshida cộng sự(10) có số điều chỉnh tiến hành đĩa 96 giếng Cao chiết pha MeOH để nồng độ từ 7,8 – 500 µg/ml, sử dụng DMSO 10% làm chất trợ tan 100 µl mẫu thử cho phản ứng với đồng lượng dung dịch DPPH 0,1 mM pha MeOH, hỗn hợp sau pha để nhiệt độ phòng 30 phút, đo độ hấp thu (OD) bước sóng 540 nm Kết tính theo cơng thức: Mẫu chứng (có DPPH, khơng có mẫu thử) chứng dương acid ascorbic tiến hành song song Thí nghiệm lặp lại lần tính giá trị trung bình Giá trị IC50 (nồng độ có HTCO 50%) xác định phương trình hồi quy tuyến tính nồng độ mẫu thử % ức chế thiết lập phần mềm Excel 2010 B - Khoa học Dược Đánh giá độc tính tế bào Tế bào ni cấy DMEM 37 °C, 5% CO2 bổ sung 10% FCS, 2mM L-glutamin, 100 UI/ml penicillin 100 µg/ml streptomycin Cao thử nghiệm pha loãng DMSO (10mM), chứng dương Paclitaxel 2,5 µM, Tế bào chuyển sang đĩa 96 giếng đến mật độ 4,2 x 104 tế bào/cm2 (hiệu chỉnh 104 tế bào/giếng/100 µl) Sau 24 ủ 37 °C, 5% CO2, 100 µl cao thử nghiệm, chứng dương, chứng trắng thêm vào giếng ủ tiếp 72 giờ, 37 °C, 5% CO2 Độc tính tế bào đánh giá phương pháp MTT theo nghiên cứu Denizot Lang(11), MTT hịa tan mơi trường khơng có FCS nồng độ 0,05 mg/ml thêm vào tất giếng, sau đem ủ 37 °C Isopropanol thêm vào tất giếng trộn kỹ 10 phút Các đĩa đọc đầu đọc Multikan, sử dụng bước sóng λ=570 nm 13 Nghiên cứu Thí nghiệm lặp lại lần tính giá trị trung bình Kết phần trăm ức chế biểu thị giảm cường độ hấp thu đối chiếu với chất chuẩn dương Paclitacxel so sánh với nhóm chứng âm Đường tuyến tính phụ thuộc nồng độ xây dựng nồng độ ức chế 50 phần trăm (IC50) xác định cho mẫu thử cho dòng tế bào phần mềm Excel 2010 Giá trị IC50 so sánh để đánh giá hoạt tính cao chiết thử nghiệm Đánh giá hoạt tính kháng viêm Hoạt tính kháng viêm mẫu cao chiết đánh giá sơ dựa khả ức chế sản sinh nitric oxid (NO) tế bào RAW 264.7 Tế bào nuôi cấy 48 môi trường DMEM 37 °C, 5% CO2 với 10% FBS, 100 UI/ml penicillin 100 µg/ml streptomycin, sau ni cấy đĩa 96 giếng với mật độ 2,5 x 105 tế bào/giếng Tế bào kích thích với LPS 24 với có mặt mẫu thử pha DMSO nồng độ 100 30 µg/ml Dịch tế bào phản ứng với thuốc thử Griess, NaNO2 nồng độ khác sử dụng để xây dựng đường chuẩn, đo độ hấp thụ bước sóng 570 nm(12) Dexamethason natri phosphat sử dụng làm mẫu đối chứng Mẫu trắng gồm môi trường dung môi DMSO 0,1% khảo sát cho thấy không ảnh hưởng khả tiết NO tế bào Phần tế bào lại sau sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng viêm bổ sung dung dịch MTT (0,5 mg/ml pha PBS), ủ 4h 37 °C 5% CO2 Sau hút bỏ hết môi trường bề mặt, kết tủa formazan hòa tan isopropanol, đo độ hấp thụ bước sóng 570 nm Thí nghiệm lặp lại lần tính giá trị trung bình Kết tính theo cơng thức: Các mẫu có biểu hoạt tính (% ức chế > 50%) chọn để thử nghiệm tiếp để tìm 14 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 giá trị IC50 (xác định phần mềm Graphpad Prism 5.0) Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn – kháng nấm Phương pháp thử hoạt tính ức chế vi sinh vật thực theo Hadacek et al có điều chỉnh(13), cao chiết pha DMSO đến nồng độ thử nghiệm 50 mg/ml Hoạt tính kháng khuẩn mẫu cao chiết đánh giá phương pháp khuếch tán đĩa thạch với nồng độ mg/giếng thạch Các đĩa thử nghiệm đối chứng sau ủ 37 °C, 24 mẫu vi khuẩn 48 vi nấm Hoạt tính ức chế vi sinh vật đánh giá cách đo bán kính (BK) vịng ức chế vi sinh vật cơng thức: BK (mm) = D-d (D = đường kính vịng ức chế vi sinh vật d = đường kính giếng thạch) Thí nghiệm lặp lại lần tính giá trị trung bình KẾT QUẢ Khảo sát sơ thành phần hóa học Ba phận rễ, thân CTĐB chứa nhóm hợp chất giống gồm: triterpenoid tự do, alkaloid, coumarin, đường 2-desoxy, saponin hợp chất polyuronic Ngồi nhóm hợp chất chung, mẫu cịn có thêm tinh dầu Kết so sánh thành phần hóa học phận CTĐB SKLM trình bày Hình Phân tích cao D, cao M SKLM cho thấy thành phần hóa học phận rễ, thân, CTĐB tương đối giống thành phần chính; thân rễ hồn tồn giống nhau, có thêm số vết khác biệt Đối với cao H, thân rễ tương đối giống thân chất phân cực mà rễ khơng có, có vết khác hồn tồn so với phận cịn lại Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa Trong thử nghiệm, mẫu thử phản ứng với DPPH 0,1 mM làm giảm màu chứng tỏ B - Khoa học Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 Nghiên cứu cao phân đoạn phận có chứa nhóm hợp chất chống oxi hóa Kết thử nghiệm giá trị IC50 trình bày Hình oxi hóa tập trung phân đoạn phân cực phân cực trung bình rễ cao D cao M Trong ba phận CTĐB, rễ cho kết chống oxi hóa tốt so với thân có phân đoạn cho tác dụng với IC50 10 µg/ml, thấp mẫu LM với IC50 3,74 ± 0,085 µg/ml, RD với IC50 4,61 ± 0,13 µg/ml So sánh dung môi chiết, mẫu LA cho tác dụng chống oxi hóa tốt với IC50 5,29 ± 0,06 µg/ml, tiếp đến LB cho hoạt tính chống oxi hóa với giá trị IC50 7,6 ± 0,95 µg/ml, đối chứng dương thử nghiệm Vitamin C với giá Cao H phận IC50 lớn 50 trị IC50 1,47 ± 0,19 µg/ml µg/ml, thành phần có hoạt tính chống CHCl3-MeOH (9:1) CHCl3-MeOH-H2O BuOH-AcOH-H2O (65:35:10, lớp dưới) (4:1:5, lớp trên) Hình Sắc kí đồ so sánh thành phần hóa học phận CTĐB Hình Biểu đồ kết thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa D: cao chiết dicloromethan, M: cao chiết methanol, H: cao chiết nước; A: cao chiết cồn 96%, B: cao chiết cồn 70% C: cao chiết cồn 50% bào ung thư cao dung mơi cịn lại, Đánh giá độc tính tế bào nhiên khảo sát đánh giá IC50 có mẫu LD Kết sàng lọc sơ nồng độ 100 µg/ml có khả ức chế phát triển tế bào ung thư cho thấy mẫu cao thử nghiệm chiết với IC50 dịng tế bào MDA-MB-231 dung mơi phân cực dicloromethan tế bào RD 95,31 ± 0,58 µg/ml cồn 96% CTĐB thể hoạt tính ức chế tế B - Khoa học Dược 15 Nghiên cứu Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 38,40 ± 0,92 µg/ml so với chứng dương paclitaxel với IC50 7,59 µM 11,06 µM Khơng có mẫu ức chế dòng tế bào LLC-PK1 (giá trị % ức chế nhỏ 0%), điều cho thấy cao thử nghiệm khơng gây độc tính cho tế bào bình thường Kết sàng lọc sơ hoạt tính gây độc tế bào trình bày Bảng Đánh giá hoạt tính kháng viêm Kết sàng lọc hoạt tính kháng viêm mẫu cao chiết nồng độ 30 100 µg/ml trình bày Bảng Bảng Kết sàng lọc sơ hoạt tính gây độc tế bào Mẫu thử (100 μg/ml) RD TD LD RM TM LM RH TH LH Paclitaxel* LLC-PK1