Khảo sát thành phần hóa học và đánh giá một số tác dụng sinh học của cây cam thảo đá bia jasminanthes tuyetanhiae t b tran rodda, apocynaceae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA DƯỢC THÁI HỒNG ĐĂNG KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY CAM THẢO ĐÁ BIA JASMINANTHES TUYETANHIAE T.B.TRAN & RODDA, APOCYNACEAE LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA DƯỢC THÁI HỒNG ĐĂNG KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY CAM THẢO ĐÁ BIA JASMINANTHES TUYETANHIAE T.B.TRAN & RODDA, APOCYNACEAE Chuyên ngành: Dược học cổ truyền Mã số: 60720406 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Thị Vân Anh Thành phố Hồ Chí Minh – 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan công trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Thái Hồng Đăng TÓM TẮT LUẬN VĂN Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ dược học – Năm học 2018-2020 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC VÀ CỦA CÂY CAM THẢO ĐÁ BIA (Jasminanthes tuyetanhiae T.B.Tran & Rodda, Apocynaceae) Thái Hồng Đăng Giảng viên hướng dẫn: TS Trần Thị Vân Anh Đặt vấn đề: Cam thảo đá bia (CTĐB) Jasminanthes tuyetanhiae Apocynaceae loài dược liệu đặc hữu vùng núi Đá Bia - Phú Yên, phần thân rễ có vị dân gian sử dụng để chữa ho thay Cam thảo bắc thuốc Do tác dụng độc đáo, CTĐB bị khai thác triệt để dẫn đến cịn vài cá thể ỏi xếp vào sách đỏ Việt Nam năm 2007 Nhằm mục đích bảo tồn, phát triển dược liệu quý, thực đề tài khảo sát thành phần hóa học đánh giá số tác dụng sinh học CTĐB, mở đầu cho nghiên cứu phát triển ứng dụng chữa bệnh tương lai Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát đặc điểm vi học phận rễ, thân, CTĐB, phân tích mã vạch ADN vùng gen ITS rbcL, so sánh với liệu lồi Genbank Phân tích sơ thành phần hóa học phận theo phương pháp Ciuley cải tiến, so sánh thành phần hóa học sắc kí lớp mỏng Đánh giá tiềm hoạt tính sinh học phận thử nghiệm chống oxy hóa làm giảm màu DPPH, độc tính tế bào ung thư MDA-MB-231 RD, ức chế sản sinh NO từ tế bào bạch cầu RAW 264.7, kháng khuẩn kháng nấm với số chủng vi sinh vật gây bệnh Từ kết thử nghiệm in vitro lựa chọn phận có hoạt tính tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học, sử dụng phương pháp chiết ngấm kiệt, chiết phân bố lỏng - lỏng, phương pháp sắc kí cột để phân lập chất tinh khiết Cấu trúc chất phân lập xác định phổ MS NMR Kết quả: Thân CTĐB có cấu tạo vi phẫu đặc trưng họ Apocynaceae ống nhựa mủ thật, libe quanh tủy cụm tế bào sợi vách cellulose; cuống có ống nhựa mủ, libe quanh tủy Kết phân tích ADN công cụ BLAST xây dựng phát sinh loài khẳng định khác biệt gen ITS rbcL CTĐB so với lồi khác phân họ Thành phần hóa học tồn CTĐB chứa nhóm hợp chất giống gồm: Triterpenoid tự do, alkaloid, coumarin, đường 2-desoxy, saponin hợp chất polyuronic Ngồi nhóm hợp chất chung, mẫu cịn có thêm tinh dầu Bằng sắc kí lớp mỏng cho thấy CTĐB có thành phần khác biệt so với thân rễ, thân rễ vết hồn tồn tương đồng ngoại trừ cao nước Kết thử nghiệm in vitro: rễ cho kết chống oxy hóa tốt so với thân, thấp cao MeOH với IC50 3,74 ± 0,085 µg/ml, rễ cao DCM với IC50 4,61 ± 0,13 µg/ml Cao chiết DCM CTĐB cao chiết tiềm có tác dụng dòng tế bào ung thư MDA-MB-231 RD với IC50 95,31 ± 0.58 µg/ml 38,40 ± 0.92 µg/ml Lá rễ CTĐB có hoạt tính kháng viêm tốt phận thân, tập trung phân đoạn phân cực đến phân cực trung bình, cao chiết DCM từ có giá trị IC50 tốt 8,71 ± 0,37 μg/ml Cả phận khơng thể hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm Từ 1,8 kg nguyên liệu rễ chiết ngấm kiệt với cồn 70%, chiết phân bố lỏng - lỏng chọn phân đoạn ether phân tách chất phương pháp sắc kí cột thu chất glycosid tinh khiết gồm Telosmoside A11, Telosmoside A22, Telosmoside A23 Tuyetanhoside Kết luận: Đề tài xây dựng đặc điểm vi học mã vạch ADN phục vụ định danh Cam thảo Đá Bia Hoạt tính kháng viêm hoạt tính chủ đạo CTĐB đặc biệt phận dùng rễ Thành phần rễ steroid glycosid với phần đường 2,6-deoxy Đề tài phân lập xác định chất từ CTĐB (Telosmoside A22, Telosmoside A23 Tuyetanhoside 1) Final essay for the degree of MS Pharm Academic year 2018-2020 INVESTIGATION OF THE CHEMICAL CONSTITUENTS AND BIOLOGICAL ACTIVITIES OF CAM THAO DA BIA (Jasminanthes tuyetanhiae T.B.Tran & Rodda, Apocynaceae) Thai Hong Dang Supervisor: Dr Tran Thi Van Anh Introduction: Cam Thao Da Bia (CTDB) Jasminanthes tuyetanhiae T.B.Tran & Rodda, Apocynaceae is an endemic plant of the Da Bia mountainous region in Phu Yen province The stems and roots of this plant with sweet taste are used as a substitution for licorice in traditional medicine With the aim of reserving and developing this precious plant, the plant anatomy characteristics and evaluation of some biological effects have been conducted to establish a foundation for further studies of therapeutic applications in the future Research Methodology: For identification, the microbiological characteristics of the roots, stems, leaves were described; DNA of ITS and rbcL genome regions were analyzed and compared with species data on Genbank Chemical constituents of three parts of CTDB were preliminarily analyzed by Ciuley method and thin layer chromatography The biological activities were evaluated by DPPH antioxidant test, cytotoxicity test on MDA-MB-231 and RD cancer cell, anti-inflammatory test on inhibiting production of NO from white blood cells RAW 264.7, antibacterial and antifungal test with some pathogenic microorganisms The part of CTDB which showed good activities was chosen for investigation of the chemical constituents, using percolation method, liquid-liquid distribution extraction, column chromatography Structure of isolated compounds were elucidated by analyzing MS and NMR spectroscopy Results: The stems of CTDB have the plant anatomy characteristics of Apocynaceae family such as non-articulated laticifer, internal phloem and bunch of cellulose wall sclerenchyma fibres; while in the leaves and petiole there is a non-articulated laticifer, the phloem around the pith Results of DNA analysis using BLAST tool and phylogenetic tree construction have confirmed the distinction of ITS gene and rbcL of CTDB compared with other species in subfamily Chemical constituents in different parts of CTDB were similar in general (free triterpenoids, alkaloids, coumarins, 2-desoxy sugars, saponins and polyuronic compounds); except the leaf had essential oils The thin layer chromatography analyses showed that the leaves of CTDB have different constituents compared with stems and roots The result of in vitro test indicated that roots and leaves showed better antioxidant activity than stems, with IC50 3.74 ± 0.085 µg/ml of MeOH extract from leaf and IC50 4.61 ± 0.13 µg/ml of DCM extract from the root The CTDB leaf extract showed the potential effects on MDA-MB-231 and RD cancer cell with IC50 at 95.31 ± 0.58 µg/ml and 38.40 ± 0.92 µg/ml, respectively The leaves and roots had better anti-inflammatory activity than the stem The best IC50 value, 8.71 ± 0.37 μg/ml was found for the DCM extract from leaves The extract from three plant parts did not show antibacterial and antifungal function 1.8 kg of root was percolated with 70% ethanol and the separated by liquid - liquid distribution Ether fraction was chosen for investigation chemical constituents By different means of column chromatography, glycosides including Telosmoside A11, Telosmoside A22, Telosmoside A23 and Tuyetanhoside were obtained Conclusions: The thesis has established micro-characteristics and DNA barcodes for the identification of CTDB Anti-inflammatory activity is still the main bio-activity for the roots, the used part in folk medicine The main components in the roots were steroidal glycosides with a 2,6-deoxy sugar moieties new compounds from CTDB were identified (Telosmoside A22, Telosmoside A23 and Tuyetanhoside 1) MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG DANH MỤC SƠ ĐỒ MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC 1.1.1 Giới thiệu chi Jasminanthes 1.1.2 Đặc điểm hình thái Jasminanthes tuyetanhiae 1.2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC LOÀI THUỘC CHI JASMINANTHES 1.2.1 Thành phần hóa học Jasminanthes (Stephanotis) mucronata 1.2.2 Thành phần hóa học Jasminanthes tuyetanhiae 14 1.3 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CÁC LOÀI THUỘC CHI JASMINANTHES 17 1.3.1 Tác dụng dược lý Jasminanthes mucronata 17 1.3.2 Tác dụng dược lý Jasminanthes tuyetanhiae 22 1.4 CÔNG DỤNG DÂN GIAN CÁC LOÀI THUỘC CHI JASMINANTHES 22 1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC IN VITRO 22 1.5.1 Tác dụng chống oxy hóa 22 1.5.2 Tác dụng độc tính tế bào ung thư 25 1.5.3 Tác dụng kháng khuẩn 25 1.5.4 Tác dụng kháng viêm 28 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 ĐỐI TƯỢNG 30 1.1.1 Nguyên liệu 30 2.1.1 Dung môi thuốc thử 30 2.1.2 Dụng cụ trang thiết bị 31 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.2.1 Khảo sát thực vật 32 2.2.2 Phân tích mã vạch ADN 32 2.2.3 Nghiên cứu sơ thành phần hóa học 33 2.2.4 Đánh giá tác dụng sinh học in vitro 34 2.2.5 Nghiên cứu hóa học 38 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 40 3.1 KIỂM TRA NGUYÊN LIỆU 40 3.1.1 Khảo sát thực vật CTĐB 40 3.1.2 Phân tích mã vạch ADN định danh 45 3.1.3 Đánh giá độ tinh khiết 48 3.1.4 Xác định sơ thành phần hóa thực vật Cam thảo Đá Bia 48 3.1.5 So sánh thành phần hóa học phận sắc kí lớp mỏng 49 3.2 KHẢO SÁT MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC IN VITRO 52 3.2.1 Chiết xuất cao thử nghiệm hoạt tính sinh học 52 3.2.2 Hoạt tính chống oxy hóa 52 3.2.3 Độc tính tế bào 54 3.2.4 Hoạt tính kháng viêm 55 3.2.5 Hoạt tính kháng khuẩn 57 3.2.6 Tổng kết đánh giá tác dụng sinh học in vitro 58 3.3 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CAM THẢO ĐÁ BIA 59 3.3.1 Chiết xuất 59 3.3.2 Phân tách cao chiết toàn phần 60 Phân tách cao ether (JasA) 62 3.3.3 Xác định cấu trúc hóa học chất phân lập 73 CHƯƠNG BÀN LUẬN 88 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 92 KẾT LUẬN 92 Kiểm tra nguyên liệu 92 Khảo sát số tác dụng sinh học in vitro 92 Nghiên cứu thành phần hóa học CTĐB 93 KIẾN NGHỊ 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO 95 DANH MỤC VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng Anh Con A Concanavalin A CsA Cyclosporin A CTĐB Diễn giải Cam thảo Đá Bia DMSO Dimethyl sulfoxide DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl DTH Delayed-type hypersensitivity EtOAc Ethyl acetat GSH Glutathion GSH Px Glutathion peroxydase IC50 Inhibitory concentration at 50% ICR Institute of Cancer Research IFN-γ Interferon-γ IL-10 Interleukin-10 IL-2 Interleukin-2 IL-4 Interleukin-4 LPS Lipopolysaccharide M Mucronatoside Mucronatosid MBC Minimum Bactericidal Concentration Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu MTT 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5diphenyltetrazol bromide NBT Nitroblue tetrazolim NFAT Nuclear factor of activated T-cells NFκB Nuclear factor-kappa B NO Nitric oxide Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-50 Phụ lục 9-21: Phổ HMBC JAS3 Phụ lục 9-22: Phổ HMBC JAS3 trích vùng 2,9 – 5,0 x 10 – 100 ppm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-51 Phụ lục 9-23: Phổ HMBC JAS3 trích vùng 0,8 – 2,6 x 70 – 180 ppm Phụ lục 9-24: Phổ HMBC JAS3 trích vùng 0,5 – 2,6 x 10 – 60 ppm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-52 Phụ lục 9-25: Phổ COSY JAS3 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-53 CHƯƠNG 10 Phụ lục 10: Dữ liệu phổ học JAS4 Phụ lục 10-1: Phổ MS JAS4 Phụ lục 10-2: Phổ 13C-NMR JAS4 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-54 Phụ lục 10-3: Phổ 13C-NMR JAS4 trích vùng 90 – 210 ppm Phụ lục 10-4: Phổ 13C-NMR JAS4 trích vùng 68 – 94 ppm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-55 Phụ lục 10-5: Phổ 13C-NMR JAS4 trích vùng 44 – 61 ppm Phụ lục 10-6: Phổ 13C-NMR JAS4 trích vùng 26 – 41 ppm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-56 Phụ lục 10-7: Phổ 13C-NMR JAS4 trích vùng – 21 ppm Phụ lục 10-8: Phổ 1H-NMR JAS4 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-57 Phụ lục 10-9: Phổ 1H-NMR JAS4 trích vùng 4,1 – 5,5 ppm Phụ lục 10-10: Phổ 1H-NMR JAS4 trích vùng 2,7 – 3,7 ppm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-58 Phụ lục 10-11: Phổ 1H-NMR JAS4 trích vùng 1,6 – 2,5 ppm Phụ lục 10-12: Phổ 1H-NMR JAS4 trích vùng 0,7 – 1,5 ppm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-59 Phụ lục 10-13: Phổ HSQC JAS4 Phụ lục 10-14: Phổ HSQC JAS4 trích vùng 4,4 – 5,5 ppm x 80 – 140 ppm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-60 Phụ lục 10-15: Phổ HSQC JAS4 trích vùng 2,9 – 4,4 ppm x 66 – 90 ppm Phụ lục 10-16: Phổ HSQC JAS4 trích vùng 3,4 – 3,7 ppm x 56 – 64 ppm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-61 Phụ lục 10-17: Phổ HSQC JAS4 trích vùng 0,9 – 3,0 ppm x 26 – 48 ppm Phụ lục 10-18: Phổ HSQC JAS4 trích vùng 0,9 – 2,0 ppm x – 22 ppm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-62 Phụ lục 10-19: Phổ HMBC JAS4 Phụ lục 10-20: Phổ HMBC JAS4 trích vùng 4,3 – 5,5 ppm x 20 – 170 ppm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-63 Phụ lục 10-21: Phổ HMBC JAS4 trích vùng 2,9 – 4,0 ppm x 20 – 110 ppm Phụ lục 10-22: Phổ HMBC JAS4 trích vùng 0,7 – 2,5 ppm x 120 – 210 ppm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-64 Phụ lục 10-23: Phổ HMBC JAS4 trích vùng 0,7 – 2,5 ppm x 20 – 110 ppm Phụ lục 10-24: Phổ COSY JAS4 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... dược học – Năm học 2018-2020 KHẢO S? ?T THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ M? ?T SỐ T? ?C DỤNG SINH HỌC VÀ CỦA CÂY CAM THẢO ĐÁ BIA (Jasminanthes tuyetanhiae T. B. Tran & Rodda, Apocynaceae) Thái Hồng Đăng... B? ?? GIÁO DỤC VÀ ĐÀO T? ??O B? ?? Y T? ?? ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA DƯỢC THÁI HỒNG ĐĂNG KHẢO S? ?T THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ M? ?T SỐ T? ?C DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY CAM THẢO ĐÁ BIA JASMINANTHES. .. đích b? ??o t? ??n, ph? ?t triển dược liệu quý, thực đề t? ?i ? ?Khảo s? ?t thành phần hóa học đánh giá số t? ?c dụng sinh học Cam thảo Đá Bia (Jasminanthes tuyetanhiae T. B. Tran & Rodda Apocynaceae) ” Mục tiêu