KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA CÂY KHỔ QUA (Momordica charantia L.) VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG ĐÁI THÁO ĐƯỜNG

i LỜI CẢM ƠN Luận văn này được thực hiện tại phòng Hóa Hợp Chất Thiên Nhiên – Viện Công Nghệ Hóa Học – Viện Khoa học và Công Nghệ Việt Nam, năm 2009. Với tấm lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn đến: Ban Giám hiệu trường Đại Học Tôn Đức Thắng, Ban chủ nhiệm Khoa Khoa học Ứng dụng và Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô giáo đã trang b ị cho tôi những kiến thức nền tảng vững chắc trong suốt thời gian học tại trường, niên khóa 2005-2010. ThS. Phùng Văn Trung, anh đã truyền đạt cho tôi những kiến thức chuyên môn và nhiều kinh nghiệm nghiên cứu quí báu trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. PGS-TS Nguyễn Ngọc Hạnh, cô đã động viên và tạo nhiều điều kiện để tôi hoàn thành tốt luận văn. ThS. Phan Nhật Minh, anh đã nhiệt tình h ướng dẫn và động viên tôi trong suốt thời gian nghiên cứu. Các anh chị và các bạn thực hiện đề tài luận văn tại phòng Hoá Hợp Chất Thiên Nhiên, năm 2009 đã cùng nhau giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Cuối cùng tôi rất cảm ơn người thân trong gia đình đã giúp đỡ, động viên, tạo mọi điều kiện từ vật chất đến tinh thần cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. TP.H ồ Chí Minh, tháng 01, năm 2010. Sinh viên thực hiện Vy Thị Thanh Nhân ii TÓM TẮT Đề tài: “KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA CÂY KHỔ QUA (Momordica charantia L.) VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG ĐÁI THÁO ĐƯỜNG” Đề tài này được thực hiện từ tháng 09/2009 đến 12/2009, tại Phòng Hợp Chất Thiên Nhiên - Viện Công Nghệ Hoá Học. Qua quá trình chiết tách và cô lập, chúng tôi đã có được kết quả như sau: • Định danh được một hợp chất tinh khiết: 3β,7β,25-trihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al. • Định tính được phần lớn các nhóm hợp chất: Flavonoid, sterol, tanin, alkaloid, saponin, đường khử, glycoside có trong dây lá khổ qua. • Khảo sát hoạt tính kháng đái tháo đường của chất phân lập được với chỉ số IC 50 =36 μg/l. iii MỤC LỤC TRANG Trang tựa Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Mục lục iii Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt viii Danh mục các bảng x Danh mục các hình xi Danh mục các sơ đồ, đồ thị xii CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1 1.2. MỤC ĐÍCH 1 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 2.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ CÂY KHỔ QUA 2 2.1.1. Mô tả cây 2 2.1.2. Phân bố và sinh thái 3 2.1.3. Y học dân gian củ a cây khổ qua 5 2.1.3.1. Rễ 5 2.1.3.2. Thân 5 2.1.3.3. Lá 5 2.1.3.4. Hoa 5 2.1.3.5. Trái 5 2.1.3.6. Hạt 6 iv 2.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ KHỔ QUA 6 2.2.1. Các công trình nghiên cứu trong nước 6 2.2.1.1. Thành phần hóa học 6 2.2.1.2. Tác dụng dược lý 7 2.2.2. Các công trình nghiên cứu trên thế giới 8 2.2.2.1. Thành phần hóa học 8 2.2.2.2. Một số Triterpene glucoside được phân lập từ cây khổ qua 10 2.2.2.3. Một số Steroid được phân lập từ cây khổ qua 20 2.2.2.4. Tác dụng dược lý 21 2.3. SƠ LƯỢC VỀ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG 22 2.3.1. Tình hình bệnh đái tháo đường trên thế giới và Việt Nam 22 2.3.2. Bệnh đái tháo đường 23 2.3.2.1. Khái niệm 23 2.3.2.2. Phân loại 23 2.3.2.3. Nguyên nhân 24 2.3.3. Hóa dược trị đái tháo đường 24 2.3.3.1. Ức chế α-glucosidase 24 2.3.3.2. Nhóm Sulfonylurea 25 2.3.3.3. Nhóm Meglitinide 25 2.3.3.4. Nhóm Biguanide 26 2.3.3.5. Nhóm Thiazolidinedione (TZD) 26 2.3.3.6. Insulin 26 2.4. PHƯƠNG PHÁP ỨC CHẾ MEN α-GLUCOSIDASE 26 2.4.1. Men α-glucosidase 2 2.4.2. Vai trò của α-glucosidase trong quá trình hình thành glucose 27 v CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 28 3.1.1. Thời gian 28 3.1.2. Địa điểm 28 3.2. THIẾT BỊ VÀ HOÁ CHẤT 28 3.2.1. Thiết bị 28 3.2.2. Hóa chất 28 3.3. NGUYÊN LIỆU 29 3.4. ĐỊNH TÍNH CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG TRÁI KHỔ QUA 29 3.4.1. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất alkaloid 29 3.4.1.1. Thuốc thử alkaloid 29 3.4.1.2. Định tính alkaloid 30 3.4.2. Khảo sát sự hiện diện của các h ợp chất flavonoid 30 3.4.2.1. Thuốc thử flavonoid 30 3.4.2.2. Định tính flavonoid 30 3.4.3. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất sterol 30 3.4.3.1. Thuốc thử sterol 30 3.4.3.2. Định tính sterol 31 3.4.4. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất saponin 31 3.4.4.1. Thuốc thử saponin 31 3.4.4.2. Định tính saponin 32 3.4.5. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất đường khử 33 3.4.6. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất tanin 33 3.4.6.1. Thuốc thử tanin 33 3.4.6.2. Định tính tanin 33 vi 3.4.7. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất glycoside 33 3.4.7.1. Thuốc thử glycoside 33 3.4.7.2. Định tính glycoside 34 3.5. CHIẾT XUẤT, CÔ LẬP VÀ TINH CHẾ 34 3.5.1. Chiết xuất 34 3.5.2. Cô lập và tinh chế 35 3.5.2.1. Các phương pháp sắc ký được sử dụng 35 3.5.2.2. Sắc ký cột thường cao Chloroform (T3) 37 3.6. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ MEN α-GLUCOSIDASE 37 3.6.1. Hóa chất – Thiết bị 37 3.6.1.1. Hóa chất 37 3.6.1.2. Thiết bị 38 3.6.2. Phương pháp ngiên cứu hoạt tính ức chế men α-Glucosidase 38 3.6.2.1. Nguyên tắc 38 3.6.2.2. Phương pháp tiến hành 39 3.6.2.3. Chuẩn bị mẫu thử 39 3.6.3. Xây dựng đường chuấn PNP 40 3.6.4. Tính phần trăm ức chế và chỉ số IC 50 40 3.6.4.1. Tính phần trăm ức chế 40 3.6.4.2. Chỉ số IC 50 41 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ & THẢO LUẬN 42 4.1. KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG DÂY LÁ KHỔ QUA 42 4.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TRƯNG VẬT LÝ, KHẢO SÁT VÀ NHẬN DANH CÁC CHẤT 44 vii 4.2.1. Kết quả sắc ký cột thường cao T3 44 4.2.2. Chất MCD1 46 4.2.2.1. Nhận danh cấu trúc hóa học của MCD1 46 4.2.2.2. Công thức cấu tạo của MCD1 47 4.3. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ MEN α-GLUCOSIDASE 54 4.3.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn cho PNP 54 4.3.2. Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế men α-glucosidase của MCD1 55 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 5.1. CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẠT ĐƯỢC 57 5.2. KIẾ N NGHỊ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHU LỤC viii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT A tb : Độ hấp thu trung bình B.W : Body Weight (trọng lượng cơ thể) CHCl 3 : Chloroform COSY : Correlation Spectroscopy (phổ tương quan giữa H và H) d : Doublet (mũi đôi) dd : Doublet of doublet (NMR) đđ : Đậm đặc DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DMSO : Dimethyl sulfoxide EP : Ether petrol EtOAc : Ethyl acetate EtOH : Ethanol Glc : Glucose HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation (phổ tương quan nhiều nối giữa H và C) HSQC : Heteronuclear Single Quantum Correlation (phổ tương quan một nối giữa H và C) IC 50 : 50% Inhibition Concentration (ức chế ở nồng độ 50%) J : Coupling constant (hằng số ghép) m : Multiplet (mũi đa) MeOH : Methanol mp : Melting point (điểm chảy) NMR : Nuclear Magnetic Resonance (cộng hưởng từ hạt nhân) ix PNP : p-nitrophenol PNP-Glc : p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside ppm : Parts per million R f : Retention factor (yếu tố chậm trễ) s : Singlet (mũi đơn) t : Triplet (mũi ba) TLC : Thin Layer Chromatography (sắc ký lớp mỏng) TZD : Thiazolidinedione UV : Ultra Violet α-Glc : α-glucosidase δ : Chemical shift (độ dịch chuyển hóa học) MCD1 : Tên chất tinh khiết x DANH MỤC CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 3.1: Công thức của một mẫu thử hoạt tính 40 Bảng 4.1: Kết quả định tính các hợp chất hữu cơ trong dây lá khổ qua 42 Bảng 4.2: Kết quả sắc ký cột thường cao Chloroform (T3) 44 Bảng 4.3: Dữ liệu phổ 1 H, 13 C-NMR; DEPT và HMBC của MCD1 47 Bảng 4.4: Dữ liệu phổ 1 H, 13 C-NMR; COSY và HSQC của MCD1 49 Bảng 4.5: Dữ liệu phổ 13 C-NMR và DEPT của MCD1 50 Bảng 4.6: So sánh dữ liệu phổ 13 C-NMR của MCD1với tài liệu tham khảo 52 Bảng 4.7: Kết quả độ hấp thu A, A tb và % ức chế của PNP chuẩn theo nồng độ 54 Bảng 4.8: Kết quả độ hấp thu A, A tb và % ức chế của MCD1 theo nồng độ 55 [...]... ích của loại dược liệu này, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY KHỔ QUA (Momordica charantia L.)VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG ĐÁI THÁO ĐƯỜNG” Trong luận văn này, chúng tôi trình bày một số kết quả chiết tách, cô lập các hoạt chất cũng như việc xác định cấu trúc các hoạt chất cô lập được, góp phần làm sáng tỏ thêm thành phần hóa học của trái khổ qua Đồng thời, thử hoạt tính. .. hoạt tính ức chế men αglucosidase (hoạt tính kháng đái tháo đường) 1.2 MỤC ĐÍCH Phân lập các hợp chất tinh khiết bằng các phương pháp sắc ký Xác định cấu trúc hoá học của các chất đã phân lập được Khảo sát hoạt tính kháng đái tháo đường của các chất đã phân lập được 1 ` CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ CÂY KHỔ QUA 2.1.1 Mô tả cây Tên khoa học: Momordica charantia L Họ: Bầu bí (Cucurbitaceae)... 2.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ KHỔ QUA 2.2.1 Các công trình nghiên cứu trong nước 2.2.1.1 Thành phần hóa học Các tác giả Phạm Văn Thanh, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Thượng Dong, Vũ Kim Thu, Nguyễn Kim Phượng và Lê Minh Phượng của Viện Dược liệu đã thống kê và khảo sát sơ bộ các nhóm hoạt chất chính của cây khổ qua Tuy nhiên, các tác giả này chưa cô lập được các hoạt chất có hoạt tính dưới dạng chất tinh... ` Ngoài ra bệnh đái tháo đường có thể phát triển khi mang thai, được gọi là đái tháo đường thai sản và có thể cần được điều trị bằng insulin để duy trì sức khỏe của mẹ và con Đái tháo đường thai sản thường biến mất sau khi sinh con, tuy nhiên phụ nữ nào đã mắc bệnh này có nguy cơ phát triển đái tháo đường type 2 ở giai đoạn về sau 2.3.2.3 Nguyên nhân Nguyên nhân gây ra bệnh đái tháo đường đến nay vẫn... nhiều sản phẩm trái khổ qua nhưng đa số ở dạng thực phẩm chức năng như trà hòa tan, trà túi lọc Điển hình là sản phẩm trà khổ qua của Viện Dược liệu hay trà túi lọc khổ qua của Công ty Traphaco Nhóm tác giả Phạm Văn Thanh, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu và cộng sự đã sản xuất chế phẩm Morantin từ thành phần glycoside của trái khổ qua dạng to, màu trắng và chứng minh tác dụng hạ đường huyết của nhóm glycoside... đều được xếp chung vào chi khổ qua (Momordica charantia L.) Tuy nhiên, căn cứ vào kích thước, hình dạng, màu sắc của quả mà chia khổ qua thành hai chủng loại: − Momordica charantia L var charantia L., trái to (đường kính > 5cm), màu xanh nhạt, gai tù, ít đắng − Momordica charantia L var abbreviata Ser., trái nhỏ (đường kính < 5cm), màu xanh đậm, gai nhọn, vị rất đắng Hình 2.4: Var charantia L Hình 2.5:... mà thành phần của bài thuốc cũng có chứa trái khổ qua Các tác giả Mai Phương Mai, Nguyễn Thị Hạnh, Nguyễn Ngọc Hạnh đã chứng minh tác dụng hạ đường huyết của các dịch chiết từ trái khổ qua thu hái tại Phú Yên bằng các dung môi khác nhau [34] 7 ` 2.2.2 Các công trình nghiên cứu trên thế giới 2.2.2.1 Thành phần hóa học [17, 35, 26, 29] Người ta đã tìm thấy khoảng hơn 200 hợp chất có trong cây khổ qua và. .. đo lượng đường trong máu (khi đói) đã giảm được 54% so với ban đầu Sau 7 tuần dùng thuốc, cả 6 bệnh nhân đều không thấy đường trong nước tiểu, lượng đường trong máu như người bình thường 2.3 SƠ LƯỢC VỀ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG 2.3.1 Tình hình bệnh đái tháo đường trên thế giới và Việt Nam Theo công bố của WHO năm 1985 có khoảng 30 triệu người mắc bệnh đái tháo đường, năm 1994 có 98.9 triệu người và năm 2005... ước tính của Viện nghiên cứu đái tháo đường quốc tế thì năm 2010 có khoảng 215.6 triệu người mắc bệnh đái tháo đường và đến năm 2025 sẽ tăng lên 300 triệu người Một số nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường ở Singapore năm 1975 là 1.9%, 1985 là 4.7%, 1992 là 8.6%; ở Pháp là 1.4%; Châu Âu là 3%; Philippin là 4.27%; Thái Lan là 3.58%; Malaysia là 3.01% Theo công bố tại Hội nghị đái tháo đường. .. bào Ức chế hoạt tính các men tổng hợp glucose − Có tác dụng sinh học giống insulin, giúp cơ thể tăng tiết insulin − Có tác dụng tốt với người mắc bệnh đái tháo đường type 2 Hỗ trợ tăng tác dụng, giảm liều và giảm tác dụng phụ của các loại sulfamid trị đái tháo đường type 2 Dịch chiết trái khổ qua có khả năng ức chế khối u [22, 24, 28], hỗ trợ men gan, chữa được nhiều bệnh như đái tháo đường, lách, gan, . được phần l n các nhóm hợp chất: Flavonoid, sterol, tanin, alkaloid, saponin, đường khử, glycoside có trong dây l khổ qua. • Khảo sát hoạt tính kháng đái tháo đường của chất phân l p được. tài: “KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY KHỔ QUA (Momordica charantia L. )VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG ĐÁI THÁO ĐƯỜNG” Trong luận văn này, chúng tôi trình bày một số kết quả chiết tách, cô l p các hoạ t. cấu trúc các hoạt chất cô l p được, góp phần l m sáng tỏ thêm thành phần hóa học của trái khổ qua. Đồng thời, thử hoạt tính ức chế men α- glucosidase (hoạt tính kháng đái tháo đường) . 1.2.