Thí nghiệm: Hòa tan 1g bột dây lá khổ qua khô trong 20ml CHCl3. Lọc, lấy dịch lọc làm mẫu thử. Với mẫu cao, sử dụng 0.1g hòa vào 30ml CHCl3, lấy dịch lọc làm mẫu thử.
• Với thuốc thử Liebermann- Burchard: Có màu hồng đỏ.
3.4.4. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất saponin [7, 19, 20] 3.4.4.1. Thuốc thử saponin
Căn cứ vào chỉ số tạo bọt để xác định sự hiện diện của saponin
Dược điển của Pháp định nghĩa chỉ số tạo bọt như sau: Chỉ số tạo bọt của saponin là độ loãng của nguyên liệu bằng nước để có chiều cao bọt 1cm sau khi lắc trong ống nghiệm có kích thước xác định, tiến hành trong điều kiện qui định.
Cách tiến hành: Cân 1g bột dược liệu cho vào erlen 500ml chứa sẵn 100ml nước
sôi. Tiếp tục cho nước trong erlen sôi nhẹ trong 30 phút nữa. Lọc để nguội, thêm nước cất cho đến 100ml (thu được nước sắc). Lấy 1 ống nghiệm có chiều cao 16cm, đường kính 16mm. Cho vào ống nghiệm lần 10ml nước sắc. Thêm nước cất vào ống nghiệm cho đủ 10ml. Bịt miệng ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc của ống trong 15 giây. Mỗi giây lắc 2 lần. Để yên trong 15 phút. Sau đó đo chiều cao cột bọt. Nếu cột bọt trong ống thấp dưới 1cm thì chỉ số bọt là dưới 100, nghĩa là không có saponin.
Chỉ số bọt (CSB) được tính theo công thức: CSB = 100 x 10
i
CSB: Chỉ số bọt.
Ví dụ: Bọt ở ống thứ 2 có chiều cao 1cm. Khối lượng này coi như đã pha loãng 100 x 10
2 = 500 lần. Như vậy bột nguyên liệu có chỉ số tạo bọt là 500. − Phản ứng Liebermann:
•Cách thực hiện: Hòa tan mẫu bằng 1ml anhydrid acetic, thêm từ từ 0.3 - 0.5ml H2SO4 đậm đặc.
•Dấu hiệu:
+ Nếu vòng ngăn cách có màu hồng đến đỏ tím thì sơ bộ nhận định có saponin triterpene.
+ Nếu vòng ngăn cách có màu xanh lá cây thì sơ bộ nhận định có saponin steroid. − Phản ứng Kahlenberg:
•Cách thực hiện: Hòa tan mẫu bằng 0.5ml dung dịch SbCl3 bão hòa trong CHCl3, khuấy đều, đem soi UV.
•Dấu hiệu:
+ Nếu có huỳnh quang màu xanh thì sơ bộ nhận định có saponin triterpene. + Nếu huỳnh quang màu vàng thì sơ bộ nhận định có saponin steroid.
3.4.4.2. Định tính saponin:
Thí nghiệm: Cân 1g bột dây lá khổ qua cho vào erlen 500ml chứa sẵn 100ml nước sôi. Tiếp tục cho nước trong erlen sôi nhẹ trong 30 phút nữa. Lọc, để nguội. Cho khoảng 1ml dịch lọc vào ống nghiệm và lắc mạnh trong 15 giây thì thấy rất nhiều bọt (cột bọt cao 6cm).
3.4.5. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất đường khử[7]
Thí nghiệm: Lấy 1g cao cồn 950 (cao dây lá khổ qua) hoà tan vào 5ml nước cất đun nóng. Nhỏ vào mẫu thử 4 – 5 giọt thuốc thử Fehling A và 4 – 5 giọt thuốc thử Fehling B. Đun nhẹ thấy xuất hiện tủa màu đỏ nâu.
3.4.6. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất tanin [8] 3.4.6.1. Thuốc thử tanin
− Stiasny: Formol (36%) 20ml.
Dung dịch HCl đậm đặc 10ml.
− Dung dịch gelatin mặn: Gelatin 2g.
Dung dịch NaCl bão hòa 10ml.
− Dung dịch acetate chì bão hòa cho kết tủa màu vàng nhạt. − Dung dịch FeCl3 1% trong nước tạo phức màu đen.
3.4.6.2. Định tính tanin
Thí nghiệm: Lấy 5g bột dấy lá khổ qua, thêm 100ml nước cất rồi đun sôi trong 10 phút. Lọc, lấy dịch lọc làm mẫu thử: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lấy 2ml dịch lọc, thêm vài giọt dung dịch gelatin mặn, xuất hiện kết tủa trắng. Lấy 2ml dịch lọc, thêm 2ml dung dịch FeCl3 1%, dung dịch chuyển thành màu nâu đen.
3.4.7. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất glycoside [8, 19] 3.4.7.1. Thuốc thử glycoside
Thuốc thử tác dụng lên phần aglycon.
− Thuốc thử Tollen (xác định theo đường khử trong glycoside):
•Công thức: Pha 0.5ml dung dịch AgNO3 10% với 0.5ml dung dịch NaOH 10%. Sau đó nhỏ từ từ dung dịch NH4OH đến khi tan kết tủa.
•Dấu hiệu: Có Ag kết tủa. − Thuốc thử Molish:
•Công thức: Nhỏ 1 – 2 giọt dung dịch thymol 2% vào 1ml H2SO4 đậm đặc. •Dấu hiệu: Xuất hiện màu đỏ thẳm.
− Thuốc thử Baljet:
•Công thức: Pha dung dịch acid picric 1% trong EtOH với dung dịch NaOH 10% trong nước theo tỷ lệ thể tích 1:1.
•Dấu hiệu: Nhỏ 3 – 4 giọt thuốc thử vào 1mg chất thử, nếu có màu vàng cam hoặc hồng xỉn là phản ứng dương tính.
− Thuốc thử Legal:
•Công thức: Hòa tan 1mg chất thử trong 2 – 3 giọt pyridin, thêm 1 giọt dung dịch natri nitroprussiat 0.5% mới pha, sau đó cho từ từ từng giọt dung dịch KOH 2N.
•Dấu hiệu: Xuất hiện màu đỏ tím.
3.4.7.2. Định tính glycoside
Thí nghiệm: Lấy 10g bột dây lá khổ qua khô, loại các chất không phân cực bằng ether petrol. Tiếp tục chiết bằng soxhlet với dung môi EtOH 50o. Dịch lọc EtOH 50o được loại tạp bằng acetate chì cho đến khi không còn trầm hiện. Sau đó, loại acetate chì dư bằng Na2SO4 bão hòa. Cô cạn dịch lọc được cao glycoside thô. Hòa tan cao bằng EtOH 95o và lấy dung dịch này làm mẫu thử.
• Với thuốc thử Molish: Có màu đỏ thẳm.
3.5. CHIẾT XUẤT, CÔ LẬP VÀ TINH CHẾ 3.5.1. Chiết xuất 3.5.1. Chiết xuất
Lấy 3.4kg dây và lá khổ qua khô đun hoàn lưu với Ethanol 950. Lọc lấy dịch chiết, cô quay chân không loại dung môi thu được 427g cao (ký hiệu T1).
Cao ethanol 950 lắc lần lượt với petrol erther, chloroform, butanol, ethanol 950. Sau khi lắc với petrol erther, lọc lấy dịch chiết, cô quay loại dung môi thu được cao petrol ether (T2) 50g, phần bã tiếp tục lắc với chloroform, làm tương tự như trên ta thu được cao chloroform (T3) 48g, tiếp tục với butanol 39g (T4) và ethanol 950 (T5).
Sơđồ 3.1: Qui trình chiết xuất cao từ dây và lá khổ qua. 3.5.2. Cô lập và tinh chế
3.5.2.1. Các phương pháp sắc ký được sử dụng[15]
Ở đây sử dụng hai phương pháp săc ký: sắc ký cột hấp thu và sắc ký lớp mỏng.
9 Sắc ký cột hấp thu:
Pha động là chất lỏng, pha tĩnh là chất rắn. Ở phương pháp sắc ký này các chất của hỗn hợp sẽ hấp thu hoặc dính lên bề mặt của pha tĩnh. Các hợp chất khác nhau sẽ có những mức độ hấp thu khác nhau lên pha tĩnh và chúng cũng phụ thuộc vào tính chất của pha động. Kết quả là trong quá trình pha động di chuyển chúng sẽ tách xa nhau ra.
Sự hấp thu xảy ra là do sự tương tác lẫn nhau giữa các phân tử phân cực, do sự tương tác giữa những phân tử có mang các nhóm phân cực đối với pha tĩnh rắn
Cao Ethanol 950 T1(427g) Cao cồn 500 Bã Cao H2O Lắc với cồn 500 Bã Đun hoàn lưu với cồn 950 Lọc
Cô quay loại dung môi
Lắc lần lượt với: Petrol ether Chlorofom Butanol Ethenol 950 Lắc với H2O Còn lại tan trong EtOH 950 Cao XDM T2 (50g) Cao CHCl3 T3(48g) Cao BuOH T4(39g) Bột dây lá khổ qua
là chất rất phân cực. Trong sắc ký hấp thu pha tĩnh thường là những hạt silicagel. Trên bề mặt của những hạt này có mang nhiều nhóm –OH nên dây là những pha tĩnh có tính rất phân cực. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
9 Sắc ký lớp mỏng:
Trong sắc ký lớp mỏng, các nguyên liệu được sử dụng làm chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng, phủ đều lên trên bề mặt một tấm kiếng, tấm kim loại, thường là nhôm hoặc tấm nhựa. Các tấm này là các sản phẩm thương mại hoặc có thể tự tráng lấy trong phòng thí nghiệm. Chất hấp thu thường sử dụng trong sắc ký lớp mỏng là silicagel. Là loại pha tĩnh với tính chất rất phân cực. Pha động luôn luôn là chất lỏng di chuyển từ dưới thấp lên trên cao
Do phần lớn các hợp chất hữu cơ không có màu, nên không thấy vị trí của mẫu chất trong quá trình dung môi di chuyển đi lên trong bình triển khai, chỉ theo dõi mức dung môi gần đạt hết tấm sắc ký thì ngưng. Sử dụng các thuốc thử đặc trưng hoặc ánh sáng UV để phun xịt lên tấm sắc ký, làm hiện hình các vết.
Với sắc ký lớp mỏng người ta thường sử dụng các yếu tố làm chậm trễ Rf (Rf =a/b) để phân tích định tính sự hiện diện của mộ loại hợp chất nào đó so sánh với chất chuẩn.
• a: đoạn đường di chuyển của mẫu chất • b: đoạn đường di chuyển của dung môi
3.5.2.2. Sắc ký cột thường cao Chloroform (T3):
Cao T3 tiến hành sắc ký cột thường, sử dụng chất mang silicagel cỡ hạt 0.063-0.200mm.
9 Khối lượng cao: 25g.
9 Khối lượng Silicagel: 400g.
9 Đường kính cột: 6cm.
9 Chiều cao lớp Silicagel: 70cm
9 Dung môi ổn định cột: Ether petrol.
9 Thể tích lấy mỗi phân đoạn: 600ml.
Tăng dần độ phân cực của hệ dung môi giải ly bằng cách tăng dần tỉ lệ EtOAc trong hệ EP-EtOAc. Theo dõi cột bằng sắc ký lớp mỏng, hiện vết bằng cách phun dung dịch H2SO4 10% trong EtOH và hơ nóng trên bếp điện.
3.6. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ MEN α-GLUCOSIDASE
3.6.1. Hóa chất - Thiết bị 3.6.1.1. Hóa chất
− Dung dịch p-nitrophenol (PNP) chuẩn 0.1mM (Merck).
− Dung dịch p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (PNP-Glc) 1mM (pha trong nước khử ion) (Merck).
− α-glucosidase (α-Glc) 0.9U/ml (pha trong nước khử ion lạnh) (Sigma). − Đệm phosphate pH = 6.8 (Prolabo).
− Đệm natri carbonate pH = 9.6 (Prolabo).
− Cao chiết (pha trong nước khử ion hoặc dung môi hữu cơ thích hợp). − Nước khử ion.
3.6.1.2. Thiết bị − Spectrophotometer DR 2000. − Spectrophotometer DR 2000. − Incubator. − Máy đo pH. − Ống nghiệm. − Pipette. − Micropipette 100-1000μl.
3.6.2. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính ức chế men α-glucosidase
Phương pháp ức chế men α-glucosidase trong điều trị đái tháo đường type 2 là phương pháp được ưu tiên sử dụng vì có cơ chế đơn giản, an toàn, chỉ xảy ra trong bộ phận tiêu hóa chứ không tham gia vào quá trình chuyển hóa đường hay cải thiện chức năng của insulin hoặc kích thích sự sản sinh insulin của tế bào beta tuyến tụy… như các phương pháp khác.
Phương pháp in vitro để khảo sát hoạt tính ức chế men α-glucosidase dựa trên nguyên tắc:
− Men α-glucosidase khi gặp nối α-D-glucose sẽ cắt đứt nối này để giải phóng đường D-glucose.
− Sử dụng chất nền có liên kết α với đường D-glucose như p-nitrophenyl-α-D- glucopyranoside, dưới tác dụng của men α-glucosidase sẽ bị thủy phân cho ra đường D-glucose và p-nitrophenol.
− p-Nitrophenol hấp thu trong ánh sáng nhìn thấy được, nên tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng λ = 400nm. Từ đó xác định được lượng D-glucose sinh ra.
3.6.2.1. Nguyên tắc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
PNP-Glc α-glucosidase α-D-glucopyranoside + p-nitrophenol
Theo phản ứng, lượng glucose sinh ra tỉ lệ với PNP. Vì vậy có thể đo độ hấp thu của PNP ở bước sóng 400nm để xác định lượng glucose sinh ra. So sánh hàm lượng
glucose sinh ra giữa mẫu có ức chế và mẫu không ức chế để xác định % ức chế. Dựng đường biểu diễn giữa % ức chế và nồng độ chất ức chế để xác định chỉ số IC50.
3.6.2.2. Phương pháp tiến hành
− Chuẩn bị các dung dịch thử chuẩn (enzyme, chất nền, các dung dịch đệm, chất ức chế).
− Trộn lẫn các dung dịch gồm: Đệm pH = 6.8, enzyme, chất ức chế với thể tích đã định trước.
− Hoạt hóa hỗn hợp ở 37oC trong thời gian 30 phút.
− Thêm chất nền, duy trì phản ứng ở 37oC, trong thời gian 20 phút. − Kết thúc phản ứng bằng đệm pH = 9.6.
− Đo độ hấp thu A ở λ = 400nm, dựa vào đường chuẩn để xác định lượng glucose sinh ra, từ đó xác định % ức chế (%) và suy ra chỉ số IC50.
3.6.2.3. Chuẩn bị mẫu thử
Chuẩn bị mẫu ức chế pha trong acetone có nồng độ 100μg/ml trong hỗn hợp phản ứng. Pha loãng để có các nồng độ 75; 50; 25;10μg/ml. Thực hiện đối với mỗi nồng độ (Ci) của từng mẫu thử theo bảng 3.1:
Bảng 3.1: Công thức của một mẫu thử hoạt tính THỂ TÍCH (ml) TÁC CHẤT Trắng mẫu Mẫu ức chế Mẫu không ức chế Nước khử ion 0.2 0 0.2 Đệm phosphate 5.0 5.0 5.0 Enzyme 0 0.2 0.2 Chất ức chế có nồng độ Ci 0.2 0.2 0 Ủ ở 37oC trong 30 phút PNP-Glc 0.5 0.5 0.5 Lắc đều, ủ ở 37oC trong 20 phút
Cho vào ống nghiệm có sẵn 4ml đệm pH = 9.6, lắc đều Đo độ hấp thu ở 400nm
3.6.3. Xây dựng đường chuẩn PNP
Pha các dung dịch PNP với các nồng độ tương ứng: 0μM; 25μM; 50μM; 75μM; 100μM và đo độ hấp thu A ở bước sóng 400nm.
3.6.4. Tính phần trăm ức chế và chỉ số IC50
3.6.4.1 Tính phần trăm ức chế
Hoạt tính ức chế của các cao chiết và chất sạch được tính theo công thức:
% ức chế = [ ] [ ] 100 [ ] o i o glc glc x glc −
Do [glc] = [PNP] nên: % ức chế = [ ] [ ] 100 [ ] o i o PNP PNP x PNP −
Vì [PNP] tuyến tính bậc 1 với A nên
% ức chế = [ ] [ ] 100 [ ] o i o A A x A − Trong đó:
[PNP]0: Nồng độ PNP sinh ra khi không sử dụng chất ức chế (mM). [PNP]i: Nồng độ PNP sinh ra khi sử dụng chất ức chế ở nồng độ i (mM). [A]0: Độ hấp thu trung bình khi không sử dụng chất ức chế.
[A]i: Độ hấp thu trung bình khi sử dụng chất ức chế ở nồng độ i.
3.6.4.2. Chỉ số IC50
Chỉ số IC50 cho biết nồng độ của chất ức chế khi ức chế 50%. Có thể tính chỉ số IC50 dựa vào đồ thị hoặc từ phương trình đường cong phần trăm ức chế theo nồng độ chất ức chế.
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG DÂY LÁ KHỔ
QUA
Bảng 4.1: Kết quảđịnh tính các hợp chất hữu cơ trong dây lá khổ qua (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
TT HỢP CHẤT THUỐC THỬ HIỆN TƯỢNG KẾT LUẬN
1 FLAVONOID Mg/HCl đđ Màu tím nhạt +
2 STEROL Liebermann-Burchard Dung dịch có màu xanh lục bền
++
Gelatin Tủa trắng + 3 TANIN
FeCl3 Màu đen +
4 ALKALOID Wagner Kết tủa đỏ nâu +
5 SAPONIN Tạo bọt Tạo bọt bền +
6 ĐƯỜNG
KHỬ
Fehling A+B Tủa đỏ nâu ++
7 GLYCOSIDE Thymol 20% và
H2SO4 đđ
Cho màu đỏ thẳm +++
Sterol Glycoside Tanin Alkaloid Saponin Hình 4.1: Kết quả thử hoạt tính
4.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TRƯNG VẬT LÝ, KHẢO SÁT VÀ
NHẬN DANH CÁC CHẤT
4.2.1. Kết quả sắc ký cột thường cao Chloroform (T3)
Kiểm tra các phân đoạn bằng TLC hệ dung môi giải ly CHCl3-MeOH (95:5; 9:1; 85:15). Gom các phân đoạn có Rf giống nhau, thu được tất cả 11 phân đoạn chính.
Bảng 4.2: Kết quả sắc ký cột thường cao T3
Phân đoạn Hệ dung môi Kết quả thử TLC
1 EP:EtOAc = 7:3 Vết kéo dài
2 EP:EtOAc = 7:3 Vết kéo dài
3 EP:EtOAc = 7:3 Vết kéo dài
4 EP:EtOAc = 6:4 Vết kéo dài
5 EP:EtOAc = 4:6 Có 1 vết đậm kí hiệu (MCD1) 6 EP:EtOAc = 5:95 Có 1 vết có UV không hiện màu
với thuốc thử
7 100% EtOAc Có 1 vết đậm kí hiệu (MCD2)
8 100% EtOAc Có 2 vết đậm kí hiệu(MCD3,
MCD4) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
9 EtOAc:MeOH = 94:6 Vết kéo dài
10 EtOAc:MeOH = 9:1 Vết kéo dài
Hình 4.2: Kết quả TLC của các chất khảo sát được
9 Ở phân đoạn 5, rửa nhiều lần bằng EtOAc. Sau đó hòa tan trong MeOH và chờ kết tinh, thu được 78 mg dạng bột màu trắng. Kiểm tra bằng TLC thấy có vết tròn rõ màu cam, Rf =0.4, hệ giải ly CHCl3-MeOH (9:1). Ký hiệu là MCD1.
Các đặc tính của MCD1
− Dạng bột, màu trắng, kết tinh trong MeOH. − Điểm nóng chảy: mp = 196-197.5oC.
− Sắc ký lớp mỏng hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10% trong EtOH. − Giải ly bằng hệ CHCl3-MeOH (9:1) cho vết tròn màu cam Rf = 0.4 − Giải ly bằng hệ CHCl3-MeOH (85:15) cho vết tròn màu cam có
Rf = 0.625
9 Ở phân đoạn 6, sau khi rửa nhiều lần bằng EtOAc. Sau đó hoà tan trong MeOH. Kiểm tra bằng TLC, nhận thấy có một vết có UV, không hiện màu với thuốc thử nhưng chưa sạch.
9 Ở phân đoạn 7, sau khi tinh sạch ta được một chất kí hiệu MCD2, khi kiểm tra TLC nhận thấy có mốt vết tròn màu tím, hệ giải ly CHCl3-MeOH (9:1), khi so sánh với mẫu chuẩn thì đó là Charantin.
9 Ở phân đoạn 8, sau khi rửa nhiều lần bằng EtOAc, hoà tan trong MeOH và CHCl3. Kiểm ra TLC thấy có 2 vết tròn màu nâu đen, hệ giải ly CHCl3-