− Các loại thuốc thường dùng: • Acarbose (C25H43NO18). • Miglitol (C8H17NO5).
− Dùng cho đái tháo đường type 2.
− Cơ chế: Acarbose và Miglitol ức chế men α-glucosidase trong ruột khiến các polysaccharose (tinh bột, đường mía saccharose …) chậm thủy phân thành glucose, kết quả là glucose vào máu từ từ nên glucose huyết không tăng nhiều sau bữa ăn.
2.3.3.2. Nhóm Sulfonylurea
− Các loại thuốc thường dùng:
9 Thế hệ thứ nhất: • Chlorpropamide (C10H13ClN2O3S). • Tolazamide (C14H21N3O3S). • Tolbutamide (C12H18N2O3S). 9 Thế hệ thứ hai: • Glibenclamide (C23H28ClN3O5S). • Glipizide (C21H27N5O4S). • Glimepiride (C24H34N4O5S). − Dùng cho đái tháo đường type 2.
− Cơ chế: Nhóm Sulfonylurea có tác dụng kích thích tế bào beta của tuyến tụy tiết ra insulin. Sulfonylurea chỉ tăng tiết insulin chứ không liên quan đến việc tổng hợp chất này.
2.3.3.3. Nhóm Meglitinide
− Các loại thuốc thường dùng: • Nateglinide (C19H27NO3). • Repaglinide (C27H36N2O4).
• Mitiglinide (C38H48CaN2O6.2H2O). − Dùng cho đái tháo đường type 2.
− Cơ chế: Tương tự nhóm Sulfonylurea. So với nhóm này, nhóm Meglitinide có tác dụng nhanh hơn nhưng thời gian ngắn hơn.
2.3.3.4. Nhóm Biguanide
− Thuốc thường dùng: Metformin (C4H11N5).
− Dùng cho bệnh nhân đái tháo đường type 2 mà ăn kiêng và thay đổi nếp sống vẫn không khống chế được glucose huyết.
− Cơ chế: Metformin ức chế sự thủy phân glycogen thành glucose ở gan, giảm hấp thụ glucose ở ruột và tăng độ nhạy của tế bào đối với insulin. Metformin không kích thích tiết insulin mà chỉ tăng khả năng dùng insulin.
2.3.3.5. Nhóm Thiazolidinedione (TZD)
− Các loại thuốc thường dùng: • Troglitazone (C24H27NO5S). • Rosiglitazone (C18H19N3O3S). • Pioglitazone (C19H20N2O3S).
− Cơ chế: Nhóm TZD làm tăng độ nhạy của tế bào đối với insulin, tăng khả năng hấp thụ glucose của tế bào.
2.3.3.6. Insulin
− Có nhiều loại chế phẩm insulin có thời gian tác dụng thay đổi khác nhau. − Dùng cho bệnh nhân đái tháo đường type 1 do tế bào beta của tuyến tụy bị thoái hóa, không sản xuất ra insulin. Cũng có thể dùng cho đái tháo đường type 2 mãn tính, khi thuốc uống không hiệu nghiệm.
2.4. PHƯƠNG PHÁP ỨC CHẾ MEN α-GLUCOSIDASE
2.4.1. Men α-glucosidase
Là một loại enzyme nằm ở tế bào biểu mô niêm mạc ruột non.
Tên khác: Maltase, Glucoinvertase, Glucosidosucrase, Maltase-glucoamylase, α- glucopyranosidase, Glucosidoinvertase, α-D-glucosidase, α-glucosidase hydrolase, α- 1,4-glucosidase.
2.4.2. Vai trò của α-glucosidase trong quá trình hình thành glucose
Sơđồ 2.1: Vai trò của α-glucosidase trong quá trình hình thành glucose
Dưới tác dụng của men amylase, tinh bột (kết hợp nhiều phân tử đường glucose) sẽ bị thủy phân thành maltose (gồm 2 phân tử đường glucose). Sau đó, với tác dụng của men α-glucosidase, đường maltose sẽ tiếp tục bị thủy phân thành đường glucose.
Ngoài sự hấp thu tinh bột, cơ thể còn hấp thu saccharose (gồm 1 phân tử đường glucose kết hợp với 1 phân tử đường fructose). Dưới tác dụng của men α-glucosidase, đường saccharose cũng bị thủy phân thành đường glucose và đường fructose.
Các phân tử đường glucose này sẽ được hấp thụ vào mạch máu trong cơ thể con người và trở thành glucose huyết cung cấp năng lượng cho mọi hoạt động sống.
Nhưng với sự xuất hiện của một chất ức chế nào đó, men α-glucosidase sẽ hạn chế hoạt động, quá trình thủy phân maltose và saccharose diễn ra chậm. Vì vậy hàm lượng glucose không tăng mạnh sau khi ăn.
Tinh bột Maltose (Glucose + Glucose) Amylase Glucose Glucose Saccharose (Glucose + Fructose) Glucose Fructose α-glucosidase (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Glucose huyết tăng
Ức chế Ức chế
CHƯƠNG 3 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM:
3.1.1 Địa điểm:
Phòng Hợp Chất Thiên Nhiên - Viện Công Nghệ Hoá Học. 3.1.2. Thời gian:
Đề tài được thực hiện từ tháng 09/2009 – 01/2010.
3.2. THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 3.2.1. Thiết bị
− Điểm chảy (mpoC) được đo trên máy Electrothermal IA 9000 Series, dùng mao quản, không hiệu chỉnh.
− Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được đo trên máy AV500, Bruker.
− Sắc ký cột thường dùng silicagel 60 F254, MERCK, đường kính hạt: 0.04 – 0.63mm, 0.063 – 0.200mm.
− Sắc ký lớp mỏng TLC được thực hiện trên bản silicagel 60 F254, MERCK tráng sẵn. − Máy cô quay chân không.
3.2.2 Hóa chất
− Ether petrol, Trung Quốc. − Diethyl ether, Trung Quốc. − Chloroform, Trung Quốc. − Ethyl acetate, Trung Quốc. − Acetone, Trung Quốc. − Methanol, Trung Quốc.
− Ethanol 950.
− Acetone công nghiệp
3.3. NGUYÊN LIỆU
Nguyên liệu được cung cấp bởi Trung tâm Bảo tồn và Phát triển Dược liệu miền Trung, là dây và lá khổ qua, được trồng ở Đông Hòa – Phú Yên. Sau khi thu hái, cắt thành những đoạn nhỏ rồi sấy khô ở nhiệt độ dưới 60oC trên hệ thống sấy nguyên liệu đến khối lượng không đổi.
3.4. ĐỊNH TÍNH CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG TRÁI KHỔ QUA
3.4.1. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất alkaloid [8, 7, 20] 3.4.1.1. Thuốc thử alkaloid
Có rất nhiều thuốc thử cho phản ứng màu hoặc kết tủa với alkaloid.
* Phản ứng tạo kết tủa có màu:
− Thuốc thử Mayer:
•Công thức: 1.35g HgCl2 hòa tan trong 100ml dung dịch KI 5%. •Dấu hiệu: Tạo kết tủa vô định hình màu trắng vàng.
− Thuốc thử Dragendoff: •Công thức:
+ Dung dịch A: 850mg Bismut nitrat trong 40ml H2O và 10ml acetic băng. + Dung dịch B: Hòa tan 8g KI trong 20ml H2O.
Trộn hai thể tích bằng nhau của hai dung dịch A và B để làm thuốc thử. •Dấu hiệu: Tạo kết tủa có màu từ vàng cam đến đỏ.
− Thuốc thử Wagner:
•Công thức: Hòa tan 5g Iod trong 100ml dung dịch KI 10%. •Dấu hiệu: Cho kết tủa màu nâu sáng đến nâu đen.
•Công thức: 2.5g Iod và 5.0g KI hòa tan trong 10ml nước cất. •Dấu hiệu cho kết tủa màu nâu hoặc màu vàng đậm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.4.1.2. Định tính alkaloid
Thí nghiệm: Tẩm 10g bột dây và lá khổ qua bằng 5ml dung dịch NH4OH 25%. Đậy kín bằng giấy lọc rồi để qua đêm. Sau đó đem chiết với 25ml CHCl3. Dịch CHCl3 được lắc với 10ml dung dịch H2SO4 2%. Lấy dịch acid làm mẫu thử.
• Với thuốc thử Wagner: Cho kết tủa màu nâu.
3.4.2. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất flavonoid 3.4.2.1. Thuốc thử flavonoid
Trong dung dịch, flavonoid tạo kết tủa màu vàng cam hoặc màu đỏ với acetate chì, tạo kết tủa màu xanh lục, đôi khi màu nâu đỏ với FeCl3.
Flavonoid được xác định bởi phản ứng Shibata, còn gọi là phản ứng Cindin của Willstater. Thuốc thử là tập hợp các hóa chất gồm: dung dịch HCl đậm đặc, bột Mg kim loại, rượu isoamyl [CH3(CH3)CHCH2CH2CH2OH].
3.4.2.2. Định tính flavonoid
Thí nghiệm: Đun hoàn lưu 5g bột dây lá khổ qua trong 50ml EtOH 95o trong 30 phút. Lọc, lấy 1ml dịch EtOH vào ống nghiệm, thêm vài giọt HCl đậm đặc, sau đó cho một ít bột Mg vào lắc thì thấy dung dịch có màu tím.
3.4.3. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất sterol [8, 7, 20, 25] 3.4.3.1. Thuốc thử sterol:
Không có thuốc thử riêng đặc trưng cho sterol mà chỉ có phản ứng chung cho steroid. − Liebermann-Burchard:
Anhydrid acetic: 20ml. H2SO4 đậm đặc: 1ml.
Cho 1 giọt thuốc thử vào dịch CHCl3, nếu có sterol sẽ có màu xanh nhạt, lục, hồng hoặc đỏ bền vững trong một thời gian.
Cho vài giọt dung dịch acid tricloacetic 90% vào dịch CHCl3, nếu có sterol sẽ xuất hiện màu tím, sau 20 phút chuyển sang màu xanh lơ.
− Salkowski:
Dung dịch tách làm 2 lớp: Lớp H2SO4 có màu xanh, lớp CHCl3 có màu nâu đỏ.
3.4.3.2. Định tính sterol:
Thí nghiệm: Hòa tan 1g bột dây lá khổ qua khô trong 20ml CHCl3. Lọc, lấy dịch lọc làm mẫu thử. Với mẫu cao, sử dụng 0.1g hòa vào 30ml CHCl3, lấy dịch lọc làm mẫu thử.
• Với thuốc thử Liebermann- Burchard: Có màu hồng đỏ.
3.4.4. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất saponin [7, 19, 20] 3.4.4.1. Thuốc thử saponin
Căn cứ vào chỉ số tạo bọt để xác định sự hiện diện của saponin
Dược điển của Pháp định nghĩa chỉ số tạo bọt như sau: Chỉ số tạo bọt của saponin là độ loãng của nguyên liệu bằng nước để có chiều cao bọt 1cm sau khi lắc trong ống nghiệm có kích thước xác định, tiến hành trong điều kiện qui định.
Cách tiến hành: Cân 1g bột dược liệu cho vào erlen 500ml chứa sẵn 100ml nước
sôi. Tiếp tục cho nước trong erlen sôi nhẹ trong 30 phút nữa. Lọc để nguội, thêm nước cất cho đến 100ml (thu được nước sắc). Lấy 1 ống nghiệm có chiều cao 16cm, đường kính 16mm. Cho vào ống nghiệm lần 10ml nước sắc. Thêm nước cất vào ống nghiệm cho đủ 10ml. Bịt miệng ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc của ống trong 15 giây. Mỗi giây lắc 2 lần. Để yên trong 15 phút. Sau đó đo chiều cao cột bọt. Nếu cột bọt trong ống thấp dưới 1cm thì chỉ số bọt là dưới 100, nghĩa là không có saponin.
Chỉ số bọt (CSB) được tính theo công thức: CSB = 100 x 10
i
CSB: Chỉ số bọt.
Ví dụ: Bọt ở ống thứ 2 có chiều cao 1cm. Khối lượng này coi như đã pha loãng 100 x 10
2 = 500 lần. Như vậy bột nguyên liệu có chỉ số tạo bọt là 500. − Phản ứng Liebermann:
•Cách thực hiện: Hòa tan mẫu bằng 1ml anhydrid acetic, thêm từ từ 0.3 - 0.5ml H2SO4 đậm đặc.
•Dấu hiệu: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Nếu vòng ngăn cách có màu hồng đến đỏ tím thì sơ bộ nhận định có saponin triterpene.
+ Nếu vòng ngăn cách có màu xanh lá cây thì sơ bộ nhận định có saponin steroid. − Phản ứng Kahlenberg:
•Cách thực hiện: Hòa tan mẫu bằng 0.5ml dung dịch SbCl3 bão hòa trong CHCl3, khuấy đều, đem soi UV.
•Dấu hiệu:
+ Nếu có huỳnh quang màu xanh thì sơ bộ nhận định có saponin triterpene. + Nếu huỳnh quang màu vàng thì sơ bộ nhận định có saponin steroid.
3.4.4.2. Định tính saponin:
Thí nghiệm: Cân 1g bột dây lá khổ qua cho vào erlen 500ml chứa sẵn 100ml nước sôi. Tiếp tục cho nước trong erlen sôi nhẹ trong 30 phút nữa. Lọc, để nguội. Cho khoảng 1ml dịch lọc vào ống nghiệm và lắc mạnh trong 15 giây thì thấy rất nhiều bọt (cột bọt cao 6cm).
3.4.5. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất đường khử[7]
Thí nghiệm: Lấy 1g cao cồn 950 (cao dây lá khổ qua) hoà tan vào 5ml nước cất đun nóng. Nhỏ vào mẫu thử 4 – 5 giọt thuốc thử Fehling A và 4 – 5 giọt thuốc thử Fehling B. Đun nhẹ thấy xuất hiện tủa màu đỏ nâu.
3.4.6. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất tanin [8] 3.4.6.1. Thuốc thử tanin
− Stiasny: Formol (36%) 20ml.
Dung dịch HCl đậm đặc 10ml.
− Dung dịch gelatin mặn: Gelatin 2g.
Dung dịch NaCl bão hòa 10ml.
− Dung dịch acetate chì bão hòa cho kết tủa màu vàng nhạt. − Dung dịch FeCl3 1% trong nước tạo phức màu đen.
3.4.6.2. Định tính tanin
Thí nghiệm: Lấy 5g bột dấy lá khổ qua, thêm 100ml nước cất rồi đun sôi trong 10 phút. Lọc, lấy dịch lọc làm mẫu thử:
Lấy 2ml dịch lọc, thêm vài giọt dung dịch gelatin mặn, xuất hiện kết tủa trắng. Lấy 2ml dịch lọc, thêm 2ml dung dịch FeCl3 1%, dung dịch chuyển thành màu nâu đen.
3.4.7. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất glycoside [8, 19] 3.4.7.1. Thuốc thử glycoside
Thuốc thử tác dụng lên phần aglycon.
− Thuốc thử Tollen (xác định theo đường khử trong glycoside):
•Công thức: Pha 0.5ml dung dịch AgNO3 10% với 0.5ml dung dịch NaOH 10%. Sau đó nhỏ từ từ dung dịch NH4OH đến khi tan kết tủa.
•Dấu hiệu: Có Ag kết tủa. − Thuốc thử Molish:
•Công thức: Nhỏ 1 – 2 giọt dung dịch thymol 2% vào 1ml H2SO4 đậm đặc. •Dấu hiệu: Xuất hiện màu đỏ thẳm.
− Thuốc thử Baljet:
•Công thức: Pha dung dịch acid picric 1% trong EtOH với dung dịch NaOH 10% trong nước theo tỷ lệ thể tích 1:1.
•Dấu hiệu: Nhỏ 3 – 4 giọt thuốc thử vào 1mg chất thử, nếu có màu vàng cam hoặc hồng xỉn là phản ứng dương tính.
− Thuốc thử Legal:
•Công thức: Hòa tan 1mg chất thử trong 2 – 3 giọt pyridin, thêm 1 giọt dung dịch natri nitroprussiat 0.5% mới pha, sau đó cho từ từ từng giọt dung dịch KOH 2N.
•Dấu hiệu: Xuất hiện màu đỏ tím. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.4.7.2. Định tính glycoside
Thí nghiệm: Lấy 10g bột dây lá khổ qua khô, loại các chất không phân cực bằng ether petrol. Tiếp tục chiết bằng soxhlet với dung môi EtOH 50o. Dịch lọc EtOH 50o được loại tạp bằng acetate chì cho đến khi không còn trầm hiện. Sau đó, loại acetate chì dư bằng Na2SO4 bão hòa. Cô cạn dịch lọc được cao glycoside thô. Hòa tan cao bằng EtOH 95o và lấy dung dịch này làm mẫu thử.
• Với thuốc thử Molish: Có màu đỏ thẳm.
3.5. CHIẾT XUẤT, CÔ LẬP VÀ TINH CHẾ 3.5.1. Chiết xuất 3.5.1. Chiết xuất
Lấy 3.4kg dây và lá khổ qua khô đun hoàn lưu với Ethanol 950. Lọc lấy dịch chiết, cô quay chân không loại dung môi thu được 427g cao (ký hiệu T1).
Cao ethanol 950 lắc lần lượt với petrol erther, chloroform, butanol, ethanol 950. Sau khi lắc với petrol erther, lọc lấy dịch chiết, cô quay loại dung môi thu được cao petrol ether (T2) 50g, phần bã tiếp tục lắc với chloroform, làm tương tự như trên ta thu được cao chloroform (T3) 48g, tiếp tục với butanol 39g (T4) và ethanol 950 (T5).
Sơđồ 3.1: Qui trình chiết xuất cao từ dây và lá khổ qua. 3.5.2. Cô lập và tinh chế
3.5.2.1. Các phương pháp sắc ký được sử dụng[15]
Ở đây sử dụng hai phương pháp săc ký: sắc ký cột hấp thu và sắc ký lớp mỏng.
9 Sắc ký cột hấp thu:
Pha động là chất lỏng, pha tĩnh là chất rắn. Ở phương pháp sắc ký này các chất của hỗn hợp sẽ hấp thu hoặc dính lên bề mặt của pha tĩnh. Các hợp chất khác nhau sẽ có những mức độ hấp thu khác nhau lên pha tĩnh và chúng cũng phụ thuộc vào tính chất của pha động. Kết quả là trong quá trình pha động di chuyển chúng sẽ tách xa nhau ra.
Sự hấp thu xảy ra là do sự tương tác lẫn nhau giữa các phân tử phân cực, do sự tương tác giữa những phân tử có mang các nhóm phân cực đối với pha tĩnh rắn
Cao Ethanol 950 T1(427g) Cao cồn 500 Bã Cao H2O Lắc với cồn 500 Bã Đun hoàn lưu với cồn 950 Lọc
Cô quay loại dung môi
Lắc lần lượt với: Petrol ether Chlorofom Butanol Ethenol 950 Lắc với H2O Còn lại tan trong EtOH 950 Cao XDM T2 (50g) Cao CHCl3 T3(48g) Cao BuOH T4(39g) Bột dây lá khổ qua
là chất rất phân cực. Trong sắc ký hấp thu pha tĩnh thường là những hạt silicagel. Trên bề mặt của những hạt này có mang nhiều nhóm –OH nên dây là những pha tĩnh có tính rất phân cực.
9 Sắc ký lớp mỏng:
Trong sắc ký lớp mỏng, các nguyên liệu được sử dụng làm chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng, phủ đều lên trên bề mặt một tấm kiếng, tấm kim loại, thường là nhôm hoặc tấm nhựa. Các tấm này là các sản phẩm thương mại hoặc có thể tự tráng lấy trong phòng thí nghiệm. Chất hấp thu thường sử dụng trong sắc ký lớp mỏng là silicagel. Là loại pha tĩnh với tính chất rất phân cực. Pha động luôn luôn là chất lỏng di chuyển từ dưới thấp lên trên cao
Do phần lớn các hợp chất hữu cơ không có màu, nên không thấy vị trí của mẫu chất trong quá trình dung môi di chuyển đi lên trong bình triển khai, chỉ theo dõi mức dung môi gần đạt hết tấm sắc ký thì ngưng. Sử dụng các thuốc thử đặc trưng hoặc ánh sáng UV để phun xịt lên tấm sắc ký, làm hiện hình các vết.
Với sắc ký lớp mỏng người ta thường sử dụng các yếu tố làm chậm trễ Rf (Rf =a/b) để phân tích định tính sự hiện diện của mộ loại hợp chất nào đó so sánh với chất chuẩn.
• a: đoạn đường di chuyển của mẫu chất • b: đoạn đường di chuyển của dung môi
3.5.2.2. Sắc ký cột thường cao Chloroform (T3):
Cao T3 tiến hành sắc ký cột thường, sử dụng chất mang silicagel cỡ hạt 0.063-0.200mm.
9 Khối lượng cao: 25g.
9 Khối lượng Silicagel: 400g.
9 Đường kính cột: 6cm.
9 Chiều cao lớp Silicagel: 70cm
9 Dung môi ổn định cột: Ether petrol. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
9 Thể tích lấy mỗi phân đoạn: 600ml.
Tăng dần độ phân cực của hệ dung môi giải ly bằng cách tăng dần tỉ lệ EtOAc trong hệ EP-EtOAc. Theo dõi cột bằng sắc ký lớp mỏng, hiện vết bằng cách phun dung dịch H2SO4 10% trong EtOH và hơ nóng trên bếp điện.