Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của cao chiết Thạch hộc nuôi cấy mô và Thạch hộc tự nhiên (Dendrobium nobile Lindl. Orchidaceae)

Hiện nay Thạch hộc là dược liệu quý hiếm, được đưa vào sách đỏ, cần được bảo tồn. Nên xu hướng mới là áp dụng công nghệ sinh học thực vật để tạo nguồn dược liệu với lượng lớn và chất lượng cao. Bước đầu làm rõ tính an toàn và thành phần hoạt chất có trong Thạch hộc nuôi cấy mô và Thạch hộc trồng tự nhiên,

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CAO CHIẾT THẠCH HỘC NUÔI CẤY MÔ VÀ THẠCH HỘC TỰ NHIÊN (DENDROBIUM NOBILE LINDL ORCHIDACEAE) * Lâm Cẩm Tiên , Trần Công Luận** TĨM TẮT Tình hình chung mục tiêu nghiên cứu: Hiện Thạch hộc dượcliệu quý hiếm, đưa vào sách đỏ, cần bảo tồn Nên xu hướng áp dụng công nghệ sinh học thực vật để tạo nguồn dược liệu với lượng lớn chất lượng cao Bước đầu làm rõ tính an tồn vàthành phần hoạt chất có Thạch hộc ni cấy mô Thạch hộc trồng tự nhiên, tiến hành nghiên cứu độc tính cấp khảo sát sơ thành phần hóa học cao chiết Thạch hộc nuôi cấy mô Thạch hộctự nhiên (Kim thoa Thạch hộc) (Dendrobium nobile Lindl Orchidaceae) Phương pháp nghiên cứu: Thử nghiệm độc tính cấp đường uống để xác định LD50 theo phương pháp Karber-Behrens Phân tích sơ thành phần hóa học dược liệu cao chiết cồn 60% Thạch hộc phản ứng hóa học đặc trưng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng Tiêu chuẩn chất lượng dược liệu kiểm nghiệm theo DĐVN IV Kết quả: Xác định Dmax cao Thạch hộc nuôi cấy 25 g cao/kg (tương đương 126,45 g dược liệu khô) cao Thạch hộc tự nhiên 28,6 g cao/kg (tương đương 348,78 g dược liệu khô) Sơ thành phần hóa thực vật mẫu dược liệu có tinh dầu, triterpenoid, acid hữu cơ, polyuronid, alkaloid saponin Định lượng cao Thạch hộc nuôi cấy mơ có hàm lượng alkaloid 3,22% saponin 15,61% Cao Thạch hộc tự nhiên có hàm lượng alkaloid 2,6% saponin 11,71% Kết luận: Liều lượng Thạch hộc sử dụng ngày khoảng - 12g dược liệu khô, dùng Thạch hộc nuôi cấy Thạch hộc tự nhiên với liều gấp 10,5 lần 29 lần liều thường sử dụng hàng ngày cho thấy khoảng cách an tồn rộng Sơ thành phần hóa học dược liệu cao chiết Thạch hộc nuôi cấy mô Thạch hộc tự nhiên giống Định lượng cao Thạch hộc ni cấy mơ có hàm lượng alkaloid cao gấp 1,2 lần hàm lượng saponin cao gấp1,3 lần cao Thạch hộc tự nhiên Từ khóa: Dendrobium nobile Lindl Orchidaceae, Thạch hộc tự nhiên, Thạch hộc nuôi cấy mô, sắc ký lớp mỏng, sơ thành phần hóa học ABSTRACT PRINCIPAL SURVEY CHEMICAL COMPONENTS OF EXTRACTIONS OF TISSUE CULTURE DENDROBIUM AND WILD DENDROBIUM (DENDROBIUM NOBILE LINDL ORCHIDACEAE) Lam Cam Tien, Tran Cong Luan * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol 22 - No 5- 2018: 70 –77 Background and Objectives: Wild dendrobium (Dendrobium nobile Lindl Orchidaceae) is a rare plant that has been proven to have potent antioxidant efficacy in the experiment and the current trend is to apply plant biotechnology to produce medicinal sources with a large and high quality In order to clarify the safety and survey the active ingredients of tissue culture dendrobium andwild dendrobium, we conducted a study on acute toxicity and principal investigations of the chemical compositions of tissue culture dendrobium and wild dendrobium Methods: In vivo acute toxicity test is conducted using Karber-Behrens method to determine  ** Khoa Y học cổ truyền – Đại học Y dược TP HCM Đại học Công nghệ Miền Đông Tác giả liên lạc: ThS BS Lâm Cẩm Tiên ĐT: 01699940841 Email: lamcamtien2015@gmail.com 70 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học LD50.Preliminary analysis of chemical compositions and 60% alcohol extraction of dendrobium by specific chemical reactions and thin layer chromatography Quality standards of materials are tested according to Vietnamese Pharmacopoeia IV Results: The Dmax of alcohol extraction of tissue culture dendrobium was determined to be 25 g/kg (equivalent to 126.45 g dried herb) and Dmax of extraction of wild dendrobium was 28.6 g/kg (equivalent to 348.78 g dried herb) The phytochemical compositions of two herbs are essential oils, triterpenoids, organic acids, polyuronids, alkaloids and saponins Quantitative analysis of extraction of tissue culture dendrobium contains 3.22% alkaloid and 15.61% saponin; extraction of wild dendrobium contains 2.6% alkaloid and 11.71% saponin Conclusions: The amount of dendrobium used per day is about - 12 g driedherb, when the tissue culture dendrobium and wild dendrobium usedwith dosesat 10.5 times and 29 times higher than daily dose, it still showswide safe range Preliminary chemical compositions of herbs and extracts of dendrobium are similar Thealkaloid level and saponin level of extraction of tissue culture dendrobium is 1.2 times higher and 1.3 times higher than wild dendrobium Keywords: Dendrobium nobile Lindl.Orchidaceae, wild dendrobium, tissue culture dendrobium, thin layer chromatography, chemical compositions thạch hộc tự nhiên (Dendrobium nobile Lindl ĐẶT VẤN ĐỀ Orchidaceae)” Đã từ lâu, Thạch hộc (Dendrobium nobile ĐỐITƯỢNG–PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCÚU Lindl Orchidaceae) dược liệu quý, Trung Quốc sử dụng Đối tượng nghiên cứu thuốc giảm đau, hạ sốt, kích thích dày, để cải Thạch hộc ni cấy mơđược cơng ty cổ phần thiện cảm giác ngon miệng, kích thích tiết nước khoa học cơng nghệ Anh Đào, số 1031, Nguyễn bọt, điều trị bệnh khác nhau, viêm Hữu Thọ, ấp 2, xã Long Thới, huyện Nhà bè, TP dày, đái tháo đường, lão hóa da, bệnh tim HCM cung cấp Mẫu cấy từ thân Thạch mạch, mà phần lớn bệnh cho liên hộc, nuôi ống nghiệm tháng với quan chặt chẽ với rối loạn trao đổi chất làm môi trường sử dụng MS (Mac Conkey phóng thích gốc tự, Thạch hộc có tác dụng Sabouraud) bổ sung 30 g/l đường, g/l agar, 50 chống lại rối loạn việc tạo gốc tự do(3) g/l khoai tây, 200 ml/l nước dừa, g/l than hoạt Một số nghiên cứu nước ngồi chứng minh Thạch hộc có tác dụng kháng viêm, chống tế bào ung thư, chống đột biến gen điều hòa miễn dịch,…gần cho thấy tác dụng chống oxy hóa in vitro(5) tính, mẫu ni cấy điều kiện pH 5,75,8, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ 2000 - 3000 lux, nhiệt độ 25 ± 2oC, độ ẩm trung bình 50 - 60% Mẫu sấy khô nhiệt độ 45 - 50oC bảo quản hộp kín Hiện Thạch hộc thực vật quý hiếm, đưa vào sách đỏ, cần bảo tồn, nên xu hướng áp dụng công nghệ sinh học thực vật để tạo nguồn dược liệu với lượng lớn chất lượng cao(7) Thạch hộc tự nhiên vườn lan xã Qui Đức, huyện Bình Chánh, TP HCM cung cấp Mẫu sấy khô nhiệt độ 45 - 50oC định danh Trung Tâm Sâm Dược Liệu TP HCM Để góp phần làm sáng tỏ thành phần hóa học tính an tồn Thạch hộc nuôi cấy mô Chúng tiến hành thực đề tài “Nghiên cứu độc tính cấp khảo sát sơ thành phần hóa học cao chiết thạch hộc ni cấy mơ Phương tiện Hóa chất: thuốc thử Bouchardat,Mayer, Dragendorff; hệ dung môi khai triển: Toluen ethyl acetate - acid formic (2:7:1), Chloroform methanol (9:1), Chloroform - methanol - 71 Nghiên cứu Y học ammoniac (40:5:1) Thiết bị: Tủ sấy Memmert (Germany), cân kĩ thuật Mettler Toledo AB204, máy cô giảm áp Buchi waterbath B-480, đèn soi UV Desaga Động vật nghiên cứu Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, khỏe mạnh, đồng giới, 6-8 tuần tuổi, trọng lượng 20 ± 2g, cung cấp Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh Trong suốt q trình thử nghiệm chuột nuôi với thức ăn viên điều kiện môi trường ổn định Phương pháp nghiên cứu Thiết kế thực nghiệm, đo lường độc lập Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp(4) Thử nghiệm thực qua giai đoạn: Giai đoạn thăm dò (mỗi lơ dò liều chuột) Khởi đầu từ liều cao bơm qua kim đầu tù cho uống Xác định liều LD0 (liều tối đa không gây chết) liều LD100 (liều tối thiểu gây chết 100%) Giai đoạn xác định (mỗi lơ dò liều chuột) Chuột chia lơ cho sử dụng thuốc liều khoảng LD0 LD100 chia theo cấp số nhân Theo dõi biểu hành vi vận động chuột vòng 72 sau dùng thuốc Ghi nhận số chuột chết lô Xác định LD50 (nếu có) theo phương pháp Karber-Behrens Phương pháp nghiên cứu hóa học Thử tinh khiết dược liệu theo DĐVN IV Xác định độ ẩm, độ tro, định lượng chất chiết dược liệu(2) Định tính sơ phản ứng hóa học: Dựa vào giáo trình thực tập Dược liệu môn Dược liệu Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh(1) Chiết xuất cao, xác định độ ẩm, độ tro, định tính phương pháp hóa học sắc ký lớp mỏng, định lượng phương pháp cân cao chiết: Chiết xuất phương pháp ngấm kiệt với 72 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 ethanol 60%: Dược liệu (Thạch hộc tự nhiên thạch hộc nuôi cấy) sau làm ẩm với cồn 60% theo tỉ lệ (1:1), sau cho vào bình ngấm kiệt, cho cồn 60% cách mặt dược liệu 10 cm đậy kín để n vòng 24 Sau 24 giờ, rút dịch chiết với tốc độ 2,3 ml/phút Dịch chiết thu cô quay chân không thu hồi dung môi thu cao Định tính phương pháp hóa học: hợp chất alkaloid với thuốc thử Bouchardat, Mayer, Dragendorff; hợp chất saponin với phản ứng tạo bọt phản ứng Libermann Burchard Định tính phương pháp sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi khai triển: Toluen - ethyl acetate - acid formic (2:7:1), Chloroform - methanol (9:1), Chloroform – methanol - ammoniac (40:5:1) Định lượng hợp chất alkaloid saponin mẫu cao phương pháp cân Hợp chất alkaloid Cân xác khoảng g dược liệu cho vào bình tam giác 250 ml, thêm 50 ml H2SO4 5%, siêu âm nóng 30 phút (50 ml x lần), lọc Dịch nước acid kiềm hóa dung dịch NH4OH đậm đặc đến pH - 10 Dịch nước kiềm hóa lắc với chloroform (10 - 12 lần, lần 20 ml) Tập trung dịch chiết chloroform, rửa lại nước cất (30 ml x lần) Cô quay thu hồi dịch chloroform đến cắn Cắn sấy chân không, cân đến khối lượng khơng đổi, tính kết xác định hàm lượng alkaloid toàn phần Kết định lượng lặp lại lần lấy trung bình Hợp chất saponin Cân xác khoảng g dược liệu cho vào bình soxhlet, chiết với 20 x 10 ml MeOH kiệt saponin Dịch MeOH giảm áp cắn, hồ cắn với 50 ml nước cất Dịch nước lắc với ether (6 - lần, lần 20 ml) lớp ether không màu màu nhạt Gạn bỏ lớp ether, lớp nước lắc với n-BuOH bão hoà nước kiệt saponin (khoảng 12 lần, lần 20 ml) Tập trung dịch chiết nBuOH, rửa với nước cất (30 ml x lần), cô giảm áp thu hồi n-BuOH cắn, làm khô Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 tủ sấy chân không đến khối lượng khơng đổi thu saponin tồn phần Cân tính hàm lượng saponin tồn phần dược liệu Tiến hành định lượng lần, lấy giá trị trung bình KẾT QUẢ Thử nghiệm độc tính cấp cao Thạch hộc nuôi cấy (cao 1) cao Thạch hộc tự nhiên (cao 2) Bảng Kết thử nghiệm độc tính cấp cao cao Lơ thử Số chuột Số chuột Số chuột Phân suất đực (con) (con) chết lô tử vong (con) (%) Sơ khởi 2 0 Xác định 6 0 Cao 1: liều tối đa bơm qua kim theo đường uống 25 g cao/kg chuột với thể tích 20 ml/kg thể trọng chuột Cao 2: liều tối đa bơm qua kim theo đường uống 28,6 g cao/kg chuột với thể tích 20 ml/kg thể trọng chuột Trong thời gian 72 tuần quan sát, không ghi nhận dấu hiệu bất thường xảy chuột thử nghiệm Tất chuột ăn uống hoạt động bình thường, khơng có chuột chết Sau tuần theo dõi, mổ chuột tất lô không thấy thay đổi bệnh lý hình thái đại thể quan tim, gan, thận, bàng quang hệ thống tiêu hóa Do đó, khơng tìm LD50 xác định Dmax 25 g cao/kg chuột cao (tương đương 126,45 g dược liệu khô) 28,6g cao/kg chuột cao (tương đương 348,78g dược liệu khô) Như vậy, cao Thạch hộc nuôi cấy cao Thạch hộc tự nhiên khơng thể độc tính cấp đường uống với liều tối đa cho chuột uống Điều cho phép nhận định cao Thạch hộc nuôi cấy cao Thạch hộc tự nhiên sử dụng thử nghiệm có độ an toàn cao động vật thử nghiệm Khảo sát hóa học Phân tích sơ Kết phân tích sơ cho thấy thành phần hóa học (Dendrobium nobile Lindl Nghiên cứu Y học Orchidaceae) mẫu nuôi cấy tự nhiên có nhóm hoạt chất: tinh dầu, triterpenoid, acid hữu cơ, polyuronid, alkaloid saponin Bảng Kết phân tích thành phần hóa thực vật Nhóm hợp chất Tinh dầu Chất béo Carotenoid Triterpenoid Alkaloid Cournarin Anthraquinon Flavonoid Glycosid tim Tannin Các chất khử Acid hữu Saponin Polyuronid Steroid Kết định tính chung Thạch hộc nuôi cấy Thạch hộc tự mô nhiên + + + + + + + + + + + + - Thử tinh khiết Độ ẩm trung bình dược liệu Thạch hộc nuôi cấy mô 9,47% ± 0,09; Thạch hộc tự nhiên 10,70% ± 0,11 Độ tro tồn phần trung bình dược liệu Thạch hộc nuôi cấy mô 4,52% ± 0,03; Thạch hộc tự nhiên 5,79% ± 0,05 Độ tro không tan acid hydrochloric trung bình dược liệu Thạch hộc nuôi cấy mô 0,6% ± 0,01; Thạch hộc tự nhiên 0,8% ± 0,05 Định tính phương pháp hóa học Dịch chiết từ Thạch hộc tự nhiên Thạch hộc nuôi cấy môt cho phản ứng dương tính với thuốc thử hợp chất alkaloid Bảng Phản ứng hóa học định tính alkaloid ngun liệu Thạch hộc nuôi cấy Thạch hộc tự nhiên Ống 1: dịch acid (đối chứng) Vàng Vàng Ống 2: dịch acid + TT Mayer Tủa vàng nhạt Tủa vàng nhạt Ống 3: dịch acid + TT Tủa đỏ cam Tủa đỏ cam Dragendroff Ống 4: dịch acid + TT Tủa đỏ nâu Tủa đỏ nâu Bouchardat 73 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học Dịch chiết từ Thạch hộc tự nhiên Thạch hộc nuôi cấy mô cho phản ứng dương tính với phản ứng tạo bọt (lớp bọt bền 30 phút) Bảng Phản ứng hóa học định tính saponin ngun liệu Thạch hộc nuôi cấy mô Phản ứng Phản ứng tạo bọt Ống chứng Không tạo bọt Phản ứng Libermann Burchard Trắng Ống mẫu thử Ống chứng Bọt bền 30 phút Khơng tạo bọt Bọt bền 30 phút Vòng ngăn cách màu nâu đỏ Trắng Vòng ngăn cách màu nâu đỏ Định tính phương pháp sắc ký lớp mỏng Bảng Sắc ký lớp mỏng định tính hợp chất saponin nguyên liệu Thạch hộc nuôi cấy Rf = 0,63 Toluen - ethyl acetate acid formic (2:7:1) Rf = 0,81 Chloroform - methanol Rf = 0,46 (9:1) Rf = 0,81 Thạch hộc tự nhiên Thạch hộc tự nhiên Rf = 0,63 Rf = 0,81 Rf = 0,46 Rf = 0,81 Nhận xét: sắc kí đồ, Thạch hộc ni cấy tự nhiên có vết có Rf màu sắc tương đồng Ống mẫu thử Xác định diện hợp chất alkaloid Bảng Sắc ký lớp mỏng định tính hợp chất alkaloid nguyên liệu Thạch hộc nuôi cấy Thạch hộc tự nhiên Rf = 0,71 Rf = 0,71 Chloroform: methanol: ammoniac (40:5:1) Nhận xét: sắc kí đồ, Thạch hộc ni cấy mơ có vết có Rf màu sắc tương đồng với vết Thạch hộc tự nhiên Định lượng Bảng Định lượng alkaloid nguyên liệu Thạch hộc nuôi cấy mô tự nhiên Thạch hộc nuôi cấy Thạch hộc tự nhiên Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Khối lượng mẫu thử (g) 3,0026 3,0012 3,0026 3,0046 3,0018 3,0022 Cắn alkaloid (g) 0,0277 0,0251 0,0262 0,0160 0,0146 0,0169 Hàm lượng alkaloid (%) 1,02 0,92 0,96 0,60 0,54 0,63 Trung bình (%) 0,97 % ± 0,03 0,59 % ± 0,03 Bảng Định lượng saponin nguyên liệu Thạch hộc nuôi cấy mô tự nhiên Khối lượng mẫu thử (g) Cắn saponin (g) Hàm lượng saponin (%) Trung bình (%) Thạch hộc nuôi cấy Mẫu Mẫu 3,0021 3,0018 0,0986 0,1014 3,63 3,73 3,71 % ± 0,04 Mẫu 3,0042 0,1025 3,77 Thạch hộc tự nhiên Mẫu Mẫu Mẫu 3,0030 3,0012 3,0001 0,0603 0,0605 0,0578 2,25 2,26 2,16 2,22 % ± 0,03 Chiết xuất cao thơm nhẹ, vị Thạch hộc nuôi cấy mô với khối lượng dược liệu 850g thu 180g cao, hiệu suất đạt 19,77% Thạch hộc tự nhiên với khối lượng dược liệu 700g thu 72g cao, hiệu suất đạt 8,2% Thử tinh khiết Độ tan: mẫu cao thạch hộc nuối cấy mô Thạch hộc tự nhiên tan 20ml nước Tiêu chuẩn hóa cao chiết Hình thức cảm quan Hai cao chất quánh, màu đen, mùi 74 Độ ẩm trung bình cao Thạch hộc ni cấy mơ 13,83% ± 0,15, Thạch hộc tự nhiên 15,51% ± 0,03 Độ tro tồn phần trung bình cao Thạch hộc nuôi cấy mô 4,22% ± 0,02, Thạch hộc tự nhiên 3,91% ± 0,02 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Cao Thạch hộc Cao Thạch hộc nuôi cấy tự nhiên Định tính phương pháp hóa học Bảng Phản ứng hóa học định tính alkaloid cao Bouchardat Ống 4: dịch acid + TT Mayer Cao Thạch hộc Cao Thạch hộc nuôi cấy tự nhiên Ống 1: dịch chiết cao (đối chứng) Ống 2: dịch chiết cao + TT Dragendroff Ống 3: dịch acid + TT Vàng Vàng Tủa đỏ cam Tủa đỏ cam Tủa đỏ nâu Tủa đỏ nâu Nghiên cứu Y học Tủa vàng nhạt Tủa vàng nhạt Nhận xét: dịch chiết cao Thạch hộc tự nhiên cao Thạch hộc nuôi cấy mô cho phản ứng dương tính với thuốc thử hợp chất alkaloid Bảng 10 Phản ứng hóa học định tính saponin cao Cao Thạch hộc ni cấy mô Phản ứng Ống chứng Phản ứng tạo bọt Không tạo bọt Phản ứng Libermann Burchard Trắng Cao Thạch hộc tự nhiên Ống mẫu thử Ống chứng Bọt bền 30 phút Không tạo bọt Bọt bền 30 phút Vòng ngăn cách màu nâu đỏ Trắng Vòng ngăn cách màu nâu đỏ Nhận xét: dịch chiết cao Thạch hộc tự nhiên cao Thạch hộc nuôi cấy cho phản ứng dương tính với phản ứng tạo bọt phản ứng Libermann Buchard Đ ị nh tính bằ ng phư ng pháp sắ c ký lớ p mỏ ng Trên sắc kí đồ, ngun liệu ni cấy có vết có Rf màu sắc tương đồng với vết cao nuôi cấy mô, nguyên liệu tự nhiên có vết có Rf Ống mẫu thử màu sắc tương đồng với vết cao tự nhiên, cao tự nhiên có vết có Rf màu sắc tương đồng với vết cao nuôi cấy mơ (Bảng 11) Trên sắc kí đồ, ngun liệu ni cấy mơ có vết có Rf màu sắc tương đồng với vết cao nuôi cấy mô, nguyên liệu tự nhiên có vết có Rf màu sắc tương đồng với vết cao tự nhiên, cao tự nhiên có vết có Rf màu sắc tương đồng với vết cao nuôi cấy mô (Bảng 12) Bảng 11 Sắc ký lớp mỏng định tính alkaloid cao Nhóm Nhóm Nhóm Dược liệu Cao Thạch hộc Dược liệu Cao Thạch hộc Cao Thạch hộc Cao Thạch hộc Thạch hộc nuôi tự nhiên Thạch học tự nuôi cấy mô tự nhiên nuôi cấy mô cấy mô nhiên Chloroform: methanol: ammoniac (40:5:1) Rf = 0,65 Rf = 0,71 Rf = 0,65 Rf = 0,71 Rf = 0,65 Rf = 0,71 Rf = 0,65 Rf = 0,71 Rf = 0,65 Rf = 0,71 Rf = 0,65 Rf = 0,71 Bảng 12 Sắc ký lớp mỏng định tính saponin cao Chloroform: methanol (9:1) Nhóm Nhóm Nhóm Cao Thạch hộc Dược liệu Thạch Cao Thạch hộc Dược liệu Thạch Cao Thạch hộc Cao Thạch hộc nuôi cấy mô hộc nuôi cấy mô tự nhiên học tự nhiên nuôi cấy mô tự nhiên Rf = 0,44 Rf = 0,44 Rf = 0,44 Rf = 0,44 Rf = 0,46 Rf = 0,46 Rf = 0,52 Rf = 0,52 Rf = 0,52 Rf = 0,52 Rf = 0,68 Rf = 0,68 Rf = 0,82 Rf = 0,82 Rf = 0,82 Rf = 0,82 Rf = 0,94 Rf = 0,94 Định lượng Bảng 13 Định lượng alkaloid nguyên liệu cao Thạch hộc nuôi cấy mô tự nhiên Khối lượng mẫu thử (g) Cắn alkaloid (g) Hàm lượng alkaloid (%) Trung bình (%) Cao Thạch hộc ni cấy Mẫu Mẫu Mẫu 1,0031 1,0028 1,0011 0,0277 0,0280 0,0261 3,27 3,30 3,09 3,22 % ± 0,07 Cao Thạch hộc tự nhiên Mẫu Mẫu Mẫu 1,0032 1,0038 1,0011 0,0227 0,0237 0,0211 2,63 2,74 2,45 2,60 % ± 0,08 75 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học Bảng 14 Định lượng saponin nguyên liệu cao Thạch hộc nuôi cấy mô tự nhiên Khối lượng mẫu thử (g) Cắn saponin (g) Hàm lượng saponin (%) Trung bình (%) Cao Thạch hộc ni cấy Mẫu Mẫu Mẫu 0,502 0,5005 0,5012 0,0651 0,0670 0,0662 15,35 15,84 15,63 15,61% ± 0,14 BÀN LUẬN Trong thử nghiệm độc tính cấp, liều cao bơm qua kim đầu tù cho chuột uống 25 g cao/kg chuột (tương đương 116,87 g cao/kg người, khoảng 126,45 g dược liệu khô) cao Thạch hộc nuôi cấy mô 28,6 g cao/kg chuột (tương đương 133,7 g cao/kg người, khoảng 348,78 g dược liệu khô) cao Thạch hộc tự nhiên Ở liều này, thuốc dạng hỗn dịch đậm đặc vừa đủ qua đầu kim để bơm thuốc vào dày chuột Sau uống thuốc, chuột ăn uống, hoạt động tiết bình thường, khơng thấy có biểu ngộ độc chuột khơng có chuột chết vòng 72 suốt tuần sau uống thuốc Do chưa xác định độc tính cấp chưa tính LD50 cao chuột nhắt trắng theo đường uống Theo liều lượng sử dụng DĐVN IV, thuốc động vật làm thuốc Việt Nam (Viện dược liệu), đơn thuốc kinh nghiệm, khối lượng dược liệu Thạch hộc sử dụng ngày khoảng - 12 g dược liệu khô Thạch hộc nuôi cấy Thạch hộc tự nhiên dùng liều với lượng gấp 10,5 lần 29 lần lượng thường sử dụng, cho thấy khoảng cách an toàn rộng Hiện Thạch hộc dược liệu quý hiếm, đưa vào sách đỏ, cần bảo tồn(7) Nên xu hướng áp dụng công nghệ sinh học thực vật để tạo nguồn dược liệu với lượng lớn chất lượng cao(6) Tuy nhiên chưa có nghiên cứu so sánh hoạt chất hóa học Thạch hộc ni cấy Thạch hộc tự nhiên Do cần làm rõ hoạt chất có sản phẩm Thạch hộc nuôi cấy mô từ việc áp dụng công nghệ sinh vật thực vật so với Thạch hộc trồng tự nhiên để chủ động 76 Cao Thạch hộc tự nhiên Mẫu Mẫu Mẫu 0,5018 0,5006 0,5022 0,0508 0,0494 0,0516 11,75 11,45 11,92 11,71% ± 0,14 tạo nguồn dược liệu quý đạt chất lượng cao Qua Phân tích sơ thành phần hóa thực vật mẫu dược liệu có tinh dầu, triterpenoid, acid hữu cơ, polyuronid, alkaloid saponin, ta thấy có tương đồng thành phần hóa học mẫu Thạch hộc nuôi cấy Thạch hộc tự nhiên.Khảo sát số tiêu chuẩn cao chiết cồn mẫu Thạch hộc nuôi cấy mô mẫu tự nhiên hình thức cảm quan, độ tan nước, độ ẩm, độ tro toàn phần đạt theo tiêu chuẩn sở Định tính phương pháp hóa học sắc ký lớp mỏng chứng minh mẫu cao có hợp chất alkaloid hợp chất saponin Kết phù hợp với báo cáo Wang X K.và cộng Thạch hộc tự nhiên có hợp chất Alkaloid (Dendrobin)(8) Định lượng cao Thạch hộc ni cấy mơ có 3,22% alkaloid 15,61% saponin Cao Thạch hộc tự nhiên có 2,6% alkaloid 11,71% saponin Điều cho thấy cao Thạch hộc ni cấy mơ có hàm lượng alkaloid cao gấp 1,2 hàm lượng saponin cao gấp1,3 lần cao Thạch hộc tự nhiên Việc phân tích sơ thành phần hợp chất nguyên liệu Thạch hộc cao Thạch hộc góp phần tạo sở cho việc phân tích xác định cấu trúc hợp chất alkaloid saponin Thạch hộc Và việc định lượng hợp chất alkaloid saponin phương pháp cân tạo tiền đề cho việc xây dựng qui trình định lượng sắc ký cao Kết đề tài tiền đề cho nghiên cứu tính an tồn tác dụng dược lý Thạch hộc nuôi cấy mô Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 KẾT LUẬN Độc tính cấp cao: Cả mẫu cao không gây biểu độc tính cấp liều tối đa cho uống Cao Thạch hộc ni cấy mơ có Dmax 25 g cao/kg chuột, cao Thạch hộc tự nhiên có Dmax 28,6 g cao/kg chuột So sánh thành phần hóa học cao Thạch hộc nuôi cấy mô cao Thạch hộc tự nhiên:định tính cao có hàm lượng alkaloid saponin, định lượng cao Thạch hộc ni cấy mơ có hàm lượng alkaloid saponin cao so với cao Thạch hộc tự nhiên TÀI LIỆU THAM KHẢO Nghiên cứu Y học China’s Pharmarcopoiea, Part One (1977) The People’s Health Sciences Publication C Beijing (Peking), China, pp 145 Đỗ Trung Đàm (1996) Phương pháp xác định độc tính cấp thuốc Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 6-24, 50-57 Lee YH, Jong DP, Nam IB, Shin IK, Byung ZA (1995) "In Vitro and In Vivo Antitumoral Phenanthrenes from the Aerial Parts of Dendrobium nobile" Planta Medica; 61(2): 178-180 Viện Dược Liệu (2011) Cơng Trình Nghiên Cứu Khoa Học Viện Dược Liệu 2006-2011 NXB Khoa Học Kỹ Thuật, tr.164-169 Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam (2007) Sách Đỏ Việt Nam NXB Khoa học tự nhiên công nghệ, tr 57-60 Wang XK, Zhao T, Che CH (1985) “Dendrobine and 3Hydroxy-2-Oxodendrobine from Dendrobium nobile” Journal of Natural Produm; 48(5): 796-801 Ngày nhận báo: 25/04/2017 Ngày phản biện nhận xét báo: 20/06/2018 Ngày báo đăng: 20/09/2018 Bộ môn Dược liệu (2011) Phương pháp nghiên cứu dược liệu (tài liệu lưu hành nội bộ) Đại học Y Dược TP HCM, tr – 16 Bộ Y Tế (2009) Dược điển Việt Nam IV NXB Y học, tr 894-895 77 ... saponin cao Chloroform: methanol (9:1) Nhóm Nhóm Nhóm Cao Thạch hộc Dược liệu Thạch Cao Thạch hộc Dược liệu Thạch Cao Thạch hộc Cao Thạch hộc nuôi cấy mô hộc nuôi cấy mô tự nhiên học tự nhiên nuôi cấy. .. liệu Cao Thạch hộc Dược liệu Cao Thạch hộc Cao Thạch hộc Cao Thạch hộc Thạch hộc nuôi tự nhiên Thạch học tự nuôi cấy mô tự nhiên nuôi cấy mô cấy mô nhiên Chloroform: methanol: ammoniac (40:5:1)... chuột, cao Thạch hộc tự nhiên có Dmax 28,6 g cao/ kg chuột So sánh thành phần hóa học cao Thạch hộc nuôi cấy mô cao Thạch hộc tự nhiên: định tính cao có hàm lượng alkaloid saponin, định lượng cao Thạch